一种金掺杂荧光碳量子点的制备方法与流程

本发明属于医药生化检测领域，具体涉及一种双荧光发射波长的金掺杂荧光碳量子点及其制备方法。

背景技术：

在近年来应用最多，量子点材料备受研究人员关注，但是近几年有研究表明，量子点含有重金属铬和硒等，毒性大，因此很多科学家在努力寻找其新的替代品。碳量子点(cqd，carbonquantumdot)是新发展起来的一种碳纳米材料，是由sp²杂化碳或无定形碳组成的、能稳定发光、尺寸小于10nm、具有准球形结构的荧光纳米颗粒，有望取代半导体量子点作为医药荧光材料。近年来，人们已开发出众多制备碳量子点的碳源，例如石墨、葡萄糖、柠檬酸、抗败血酸、明胶、蔗糖、聚吡喃糖衍生物、聚呋喃糖、聚氨基葡萄糖等。

单一信号荧光材料已难以满足各学科发展的需求，如单一荧光材料可以很好地完成分子离子的检测、生物大分子的标记等，但是却不能将其有效分离富集至有效量，以满足现有微量分析仪器，有人利用磁性物质可以实现目标对象的分离富集，却不能进行相应的检测，而磁性碳量子点是荧光材料与磁性材料的结合。双信号(甚至多信号)荧光纳米材料因可被不同波长的激发光激发，进而可在不同环境下荧光成像，因此具有很好的应用前景，已经受到材料学、分析化学、生物学、医药学等领域研究者的高度关注。

荧光纳米材料通常包括：半导体量子点、稀土掺杂上转换纳米材料、贵金属纳米粒子(如金纳米粒子)以及碳量子点。但是，半导体量子点的制备条件比较苛刻，且先驱体为cd、pb、hg等重金属离子盐，对人体和环境都会造成极大的伤害，这些因素一定程度上限制了其应用。制备上转换材料的原料比较昂贵。因此，毒性小、生物相容性好的金纳米粒子和碳量子点吸引了更多研究者的关注。黄宏等人(浙江师范大学，硕士论文，2014年)利用不同碳源合成了多种新型荧光纳米材料，详细研究了其荧光特性及其靶向识别性能，并深入探讨了相关靶向识别机制：(1)卡托普利-金纳米粒子的合成以及hg²⁺靶向识别研究以卡托普利为稳定剂，四羟甲基氯化磷为还原剂，通过简单、温和、快速(5分钟)、绿色的方法合成荧光金纳米粒子，利用hg²⁺能够特异性淬灭金纳米粒子的荧光，荧光金纳米粒子可用于环境水样中hg²⁺含量的快速检测；(2)多肽模板法合成波长可调的荧光金纳米粒子与其性能研究采用序列结构不同的多肽为模板，硼氢化钠为还原剂，合成了具有不同发射波长的荧光金纳米粒子，以此金纳米粒子为探针，可实现hg²⁺的高灵敏度和高选择性检测；(3)以草莓为碳源，水热法合成氮掺杂的荧光碳量子点，所得碳量子点水溶性好、稳定性高，并能够作为荧光探针测定hg²⁺。(4)用葡萄为原料，一步水热法合成量子产率较高的荧光碳量子点，该碳量子点同时具有水溶性好、稳定性高、粒径小、尺寸均一、细胞毒性低等特征，且具有较好的细胞成像能力。

当金纳米颗粒尺寸逐渐减小到与费米波长相当时，其电子结构与半导体类似，能级不连续。这些超小的金纳米颗粒具有荧光特性，又被称为金纳米簇(aunc)。相比于传统的荧光探针，金纳米簇具有更多的优点。它具有更高的量子产率、更长的荧光寿命，抗光漂白能力强，发射光谱波长具有尺寸依赖可调性，斯托克斯位移大以及生物毒性低。因此，金纳米簇作为一种新型荧光纳米材料在生物标记、荧光成像领域有望得到广泛应用。苏小清等人(东南大学硕士论文2016年)通过化学还原法，以氯金酸为反应前驱体，gsh为还原剂，在不同条件下探索了荧光金纳米簇的制备方法，并进一步考察了硫醇对金纳米簇的荧光强度的影响。

目前大多数已报道的碳量子点荧光量子产率较低，限制了其在各个领域的实际应用，一些碳量子点表面缺乏有效的识别基团，导致其对目标物的特异性结合能力有限，选择性不佳；基于碳量子点构建的生化传感器多以单一荧光发射强度的改变作为信号输出单元，存在荧光强度易受激发光源强度、探针浓度等因素干扰的问题，导致检测的准确性有待提高。上官璟芳等人(湖南大学硕士论文2017年)采用不同的原料，通过简单的水热合成法制备了一系列具有独特光学性质的碳量子点。主要包括：(1)新型高荧光氮掺杂碳量子点的制备及其细胞成像应用研究，相比于荧光染料，大多数已报道的碳量子点存在量子产率较低的缺点，极大限制了其在生化传感领域的实际应用；(2)基于氮、磷共掺杂高荧光碳量子点荧光探针制备及其对生物样品中fe³⁺的检测研究，为了实现碳量子点表面官能团的简单、快速引入以及结合杂原子掺杂提高量子产率，选取三磷酸腺苷作为碳源、氮源和磷源，通过水热法一步合成了具有高量子产率的氮、磷共掺杂碳量子点，该碳量子点具有良好的荧光稳定性、低毒性和水溶性，量子产率可达43.2％，对官能团及元素价态分析可知，其表面含有大量羧基、磷酸基团等官能团，此类氮、磷共掺杂碳量子点荧光探针可作为fe³⁺检测的新方法；(3)基于免标记碳量子点的比率型荧光探针制备及其对细胞内ph传感应用研究，为了进一步解决碳量子点结合荧光染料或其他荧光纳米材料构建比率型荧光探针存在的染料泄露、交联与纯化步骤繁琐等不足，通过简单的水热合成法，以柠檬酸和碱性品红为反应物，一步制备了免标记、双发射的荧光碳量子点。该碳量子点在380nm激发光照射下，分别于475nm和545nm处有两个荧光发射峰，且荧光发射强度显示出优良的光稳定性，实验表明，该双发射碳量子点的两个荧光发射强度同时具有ph响应性。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种低毒性、生物兼容性良好、水溶性好、荧光产率高的双荧光发射波长的金掺杂荧光碳量子点。

本发明的另一个目的是提供上述金掺杂荧光碳量子点的制备方法。

为此，本发明提供了以下技术方案。

一种金掺杂荧光碳量子点的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1.制备载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液：将5～20ml质量浓度为1％的改性壳聚糖水溶液与1～3ml浓度为4mol/l的氯金酸水溶液混合后，再加入3～5ml浓度为4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀后静置15～60分钟；然后再加入0.400g的含硫和氮元素的化合物，搅拌均匀后向混合体系中加入9～14ml浓度为4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置，得到所述载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液，其中所述含硫和氮元素的化合物为巯基乙胺或巯基乙酸或乙二胺中的任一种；

步骤2.将0.625～5g的所述载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液与含有1～5g柠檬酸的水溶液30ml混匀后，在150℃～200℃的温度下下进行水热反应，制得所述金掺杂荧光碳量子点。

作为一种优选的实施方式，所述方法还包括在制得所述金掺杂荧光碳量子点后对其进行纯化处理。

作为一种优选的实施方式，所述纯化处理包括：将所述金掺杂荧光碳量子点离心后再进行透析。离心的速度优选为5000r/分钟至12000r/分钟，更优选为6000r/分钟至10000r/分钟。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中进行水热反应的温度优选为160℃～190℃。更优选为180℃。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中进行水热反应的时间为至少300分钟。

作为一种优选的实施方式，所述改性壳聚糖接枝共聚有聚合单体n-乙烯基吡咯烷酮和功能单体丙烯酸的壳聚糖。

与现有技术相比，本发明的金掺杂荧光碳量子点具有低毒性和良好的生物兼容性，水溶性好，荧光产率高，储存稳定性好。

附图说明

图1是总载金量为1％时不同载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的用量制备的金掺杂荧光碳量子点紫外光谱图。

图2是总载金量为1％时不同载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的用量制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图。

图3是总载金量为2％时不同载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的用量制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图。

图4是总载金量为2％时载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量为0.625g制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图，其具有双激发波长。

图5是具有双激发波长的金掺杂荧光碳量子点的tem(透射电子显微镜)图。

图6是总载金量为1％时不同载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的用量制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图。

图7是总载金量为2％时不同载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的用量制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图。

图8是总载金量为3％时载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量为0.625g制备的金掺杂荧光碳量子点荧光光谱图，其具有双激发波长。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。出于简要目的，部分技术操作并未具体描述细节，但应理解，这些操作都在本领域技术人员所熟知的范围内，其可以根据本说明书中所记载的内容予以实现。

本发明所用到的改性壳聚糖为接枝共聚有聚合单体n-乙烯基吡咯烷酮和功能单体丙烯酸的壳聚糖。

制备改性壳聚糖水溶液的具体步骤如下：

用1％(wt)壳和糖酸性水溶液(简称cts)为原料(88份)，含硫酸高铈(0.1份)的稀硝酸(0.5％wt)水溶液(20份)为引发剂，在45℃有氮气保护的条件下，与聚合单体n-乙烯基吡咯烷酮(10份)和功能单体(如丙烯酸)(10份)发生接枝共聚，制备改性壳聚糖(cts-g-p(nvp-co-aa))。

测试方法如下：

(1)金掺杂荧光碳量子点的测试与表征

采用透射电子显微镜(tem)观察碳量子点与磁性碳量子点的形貌和粒径大小；

以“改性壳聚糖+柠檬酸+巯基乙胺”体系合成的碳量子(改性壳聚糖水溶液(3ml)，向其中加入含3g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在180℃下水热反应300分钟得到。)为空白对照，测紫外光谱；

采用荧光分光光度计(激发波长分别为：356nm或425nm)研究样品的荧光特性。

(2)金掺杂荧光碳量子点的荧光产率的测定

将少量标准物硫酸奎宁(qy＝0.577)溶于0.05n的硫酸溶液，以此作为参比物，测量待测物和硫酸奎宁在同一波长(标准物的最大激发波长)下的发射峰积分面积和紫外吸光度(需保持在0.05下)，量子产率的计算公式如下：

yqs＝yqr(fs/fr)(ar/as)(ηs/ηr)²

qy是量子产率，f是荧光发射峰面积，a是在激发波长下的吸光度，η是溶剂的折射率。其中s表示待测物；r表示参比物。

实施例1：

当总载金量为1％，改变载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量，在“柠檬酸+巯基乙胺”体系中制备金掺杂荧光碳量子点

(1)取10ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、1ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加3ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g巯基乙胺，搅拌均匀后向混合体系中加12ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)分别取以上载金量为1％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液1.25g、2.5g、5g，向其中加入含2.5g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在180℃下水热反应至少300分钟，制备粗产物。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

tem图显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，平均直径约7.5nm。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释15000倍，进行测试。结果显示，随着加入的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液的量不同，产品外观颜色也不同，1.25g用量为褐色，2.5g用量为黄色，5g用量为棕色。紫外光谱图如图1所示，荧光光谱图如图2所示，图2中的数值“14000”表示相同浓度的样品在测试前稀释14000倍。

由测试结果可见，以“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约500nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。

实施例2：

当总载金量为1％，改变载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量，在“柠檬酸+巯基乙酸”体系制备中金掺杂荧光碳量子点

(1)取20ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、1ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加3ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g巯基乙酸，搅拌均匀后向混合体系中加14ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)分别取以上载金量为1％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液0.625g、1.25g、2.5g、5g，向其中加入含1.5g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在160℃下水热反应至少300分钟，制备粗产物。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释10000倍，进行测试。结果如图6所示，结果显示，本实施例所得产品的荧光强度比图2对应样品更低(如图2中的曲线a)。

tem图显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，平均直径约7.5nm。

由测试结果可见，以“柠檬酸+巯基乙酸”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约500nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。

实施例3：

当总载金量为2％，改变载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量，在“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备中金掺杂荧光碳量子点

(1)取10ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、2ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加3ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g巯基乙胺，搅拌均匀后向混合体系中加12ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)分别取以上载金量为1％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液0.625g、1.25g、2.5g、5g，向其中加入含2.5g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在190℃下水热反应至少300分钟，制备粗产物。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

tem图显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，平均直径约7.5nm。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释15000倍，进行测试。结果显示，产品外观颜色为棕色。荧光光谱图如图3所示。

由测试结果可见，以“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约500nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。

实施例4：

当总载金量为2％，改变载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量，在“柠檬酸+乙二胺”体系制备中金掺杂荧光碳量子点

(1)取5ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、2ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加3ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g乙二胺，搅拌均匀后向混合体系中加14ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)取以上载金量为2％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液0.625g、1.25g、2.5g、5g(额外增加了个10g的样品)，向其中加入含1.0g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在150℃下水热反应至少300分钟，制备粗产物(伴有大量黑色固体沉淀生成)。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

tem图显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，基平均直径约7.5nm。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释1000倍，进行测试。

由测试结果(图7)可见，以“柠檬酸+乙二胺”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，以“改性壳聚糖复合物水溶液添加量0.625g的样品”为例(只稀释10倍)，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约500nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。

实施例5：

总载金量为2％，载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量为0.625g，在“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备中金掺杂荧光碳量子点

(1)取10ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、2ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加3ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g巯基乙胺，搅拌均匀后向混合体系中加12ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)取以上载金量为2％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液0.625g，向其中加入含2.5g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在180℃下水热反应300分钟，制备粗产物。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

tem图(图5)显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，平均直径约7.5nm。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释45000倍，进行测试。对应测试的实验结果如图4所示。由图4可见，以“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约510nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。

实施例6：

总载金量为3％，载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液用量为0.625g，在“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备中金掺杂荧光碳量子点

(1)取10ml1％(wt)改性壳聚糖水溶液、3ml4mol/l的氯金酸水溶液混合后，加5ml4mol/l的柠檬酸水溶液混匀后静置30分钟(15至60分钟均可)；再加0.400g巯基乙胺，搅拌均匀后向混合体系中加9ml4mol/l的柠檬酸水溶液，混匀并静置至少3h，得到载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液。

(2)取以上载金量为3％的载金纳米簇的改性壳聚糖复合物水溶液0.625g，向其中加入含5.0g柠檬酸的水溶液30ml，混匀后于马弗炉中在200℃下水热反应300分钟，制备粗产物。

(3)经适当纯化处理(以5000r/分钟至12000r/分钟、更优选为6000r/分钟至10000r/分钟、最优选8000r/分钟的速度离心30分钟后装入2000da的透析袋纯水透析72h，冷冻干燥后备用；或直接冰箱冷藏保存。)，得到金掺杂荧光碳量子点。

tem图显示本实施例得到的金掺杂荧光碳量子点为近似球形，平均直径约7.5nm。

将得到的金掺杂荧光碳量子点样品稀释50000倍，进行测试。对应的测试实验结果(图8)和图3中对应样品相当(如图3中的曲线a)。

由测试结果可见，以“柠檬酸+巯基乙胺”体系制备的金掺杂荧光碳量子点水溶液，当在365nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约450nm；当在425nm的激发光作用下的发射光谱的峰值约500nm；由此可见，金掺杂荧光碳量子点对双重波长的激发光作出“应答”。