一种章鱼胺上转换荧光传感材料的制备方法与流程

本发明属于光学传感材料制备技术及发酵食品中章鱼胺检测方法研究领域，尤其涉及一种上转换分子印迹荧光传感材料的制备方法及在发酵食品中章鱼胺的检测。

背景技术：

章鱼胺在发酵类食品中广泛存在，其主要的生物危害包括：①在生物体的末梢神经调节系统中，章鱼胺对于机体的各种肌肉、神经末梢器官(如内脏脂肪、血淋巴细胞、卵巢输卵管)以及大部分感觉器官的活动和能量代谢都具有一定影响；②在生物体的免疫系统中，过多的章鱼胺摄入可能会造成生物体免疫能力的下降；③在中枢神经系统中，章鱼胺可以改变感受器(光感受、化学感受器、机械感受器和听觉感受器)的敏感性，通过改变神经元膜阻力、突触反应的强度、改变适应动力学和动作电位的形状来改变生物体的对于外界感觉。

上转换荧光材料是一种通过吸收两个或两个以上低频率光子，发射一个高频率光子的光致发光材料。其因具有低毒性、化学稳定性好、灵敏度高、生物兼容性好以及在生物体内无自发发光和无光漂白作用等优点，广泛应用在生物成像、生物探针等生物领域，是一种理想的荧光探针。

分子印迹聚合物是一种采用仿生抗原-抗体技术合成的具有高选择性、特异性的聚合物，对模板分子具有特异性吸附。表面分子印迹溶胶-凝胶技术是一种通过溶胶-凝胶法在支撑材料表面合成分子印迹聚合物的技术。

目前章鱼胺的检测方法多为高效液相色谱法，虽然检测灵敏度高，但是前处理过程复杂、耗时长，仪器操作要求高，无法实现快速检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种对章鱼胺具有高选择性的荧光传感材料，以用于发酵食品中章鱼胺检测方法的建立。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

采用二氧化硅包裹的ucnps作为载体，结合分子印迹技术，合成了一种特异性识别章鱼胺的荧光传感材料。

本发明的传感材料对章鱼胺有很强的识别功能。

一种章鱼胺上转换荧光传感材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)上转换材料ucnps制备：

采用水热法合成上转换荧光纳米粒子，将乙醇，油酸，氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白；逐滴加入超纯水，搅拌至溶液变澄清；逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液，加入硝酸钇、硝酸镱、硝酸铒，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h；反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥；

(2)ucnps@sio2的制备：

称取50mg步骤(1)制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂2ml，并逐滴滴加正硅酸四乙酯(teos)，搅拌8h；逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)200μl，持续搅拌1h；在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h；

(3)荧光传感材料ucnps@sio2@mip的制备

将章鱼胺超声溶解到乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加aptes，搅拌15min，加入步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入teos后，加入100μl催化剂进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；真空干燥24h，避光保存。

进一步，步骤(3)中的章鱼胺、aptes和teos的摩尔质量比为1:4:4-1:4:20；用100ml乙醇和水交替洗脱，去除模板分子，直到洗脱液中无章鱼胺的检出。油酸是一种单不饱和omega-9脂肪酸，存在于动植物体内。

进一步，步骤(3)中在进行模板分子的洗脱过程中交替加入相同体积的乙醇和水。

优选的，一种章鱼胺上转换荧光传感材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将8ml乙醇；8ml油酸700mg氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白。逐滴加入5ml超纯水，搅拌至溶液变澄清。逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液3ml，1.56ml硝酸钇(0.5mol/l)、400μl硝酸镱(0.5mol/l)、40μl硝酸铒(0.5mol/l)，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h。反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥。

(2)首先将50mg步骤(1)制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂28％的氨水2ml，并逐滴滴加正硅酸四乙酯(teos)40μl，搅拌8h。逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)200μl，持续搅拌1h。在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h。teos化学式si(oc2h5)4，是无色液体；熔点-77℃，沸点168.5℃，密度0.9346克/厘米3。它对空气较稳定；微溶于水，在纯水中水解缓慢，在酸或碱的存在下能加速水解作用；与沸水作用得到没有电解质的硅酸溶胶。

(3)将1mmol的章鱼胺超声溶解到乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加4mmolaptes，搅拌15min，加入50mg步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入6mmolteos后，加入100μl28％氨水进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；真空干燥24h，避光保存。

以ucnps@sio2为支撑体，合成对章鱼胺具有高选择性的荧光传感材料(ucnps@sio2@mip)；

按照上述方法，但不加模板分子章鱼胺，制备本发明对应的非印迹聚合物(ucnps@sio2@nip)。

本发明所合成的分子聚合物具有选择性高，吸附速率快和稳定好等特点。本发明结合上转换纳米粒子的良好荧光性能和分子印迹聚合物的高选择性，制备对章鱼胺具有特异性吸附的荧光分子印迹聚合物，建立一种章鱼胺的荧光传感检测方法，并用于食品中章鱼胺的检测。

相对于现有技术，本发明创造所述的章鱼胺荧光传感材料的制备方法及应用在章鱼胺检测中具有以下优势：

本发明首次合成了上转换荧光分子印迹传感材料，以荧光性能好的上转换材料作为光信号，通过简单的常温搅拌法引入二氧化硅，不仅增大了材料的比表面积，缩短了吸附时间，提高了材料的传质速率和吸附能力，还提高了材料的热稳定性和化学稳定性，同时还提高了材料在有机相中的分散性和荧光强度；最后通过溶胶凝胶法合成了具有高选择性、稳定性好的荧光分子印迹聚合物。与已有的发明专利相比，该方法首次运用到食品中章鱼胺的检测，合成的上转换材料无需转性，印迹聚合物材料的合成方法简单，无需孵化，加热老化，萃取等繁琐过程。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例所述的传感材料的制备示意图。

图2、图3分别为本发明创造实施例所述的ucnps和ucnps@sio2@mip的透射电镜图。

图4为本发明创造实施例所述的ucnps、ucnps@sio2和ucnps@sio2@mip的傅里叶红外光谱图。

图5为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2、ucnps@sio2@mip、ucnps@sio2@nip的热重分析图谱。

图6为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2、ucnps@sio2@mip、ucnps@sio2@nip的xrd射线衍射图谱。

图7为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2@mip和ucnps@sio2@nip的吸附动力学曲线。

图8为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2@mip(a、b)和ucnps@sio2@nip(c、d)对不同浓度的章鱼胺响应曲线。

图9为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2@mip的特异性实验。

具体实施方式

为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。

实施例1

(1)上转换材料ucnps制备：

采用水热法合成上转换荧光纳米粒子，将乙醇，油酸，氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白；逐滴加入超纯水，搅拌至溶液变澄清；逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液，加入澜系物质硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h；反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥；

(2)ucnps@sio2的制备：

称取50mg步骤(1)制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂2ml，并逐滴滴加正硅酸四乙酯搅拌8h；逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷200μl，持续搅拌1h；在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h；

(3)荧光传感材料ucnps@sio2@mip的制备

将章鱼胺超声溶解到乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加aptes，搅拌15min，加入步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入teos后，加入100μl催化剂进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；真空干燥24h，避光保存。

实施例2

(1)将8ml乙醇；8ml油酸700mg氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白。逐滴加入5ml超纯水，搅拌至溶液变澄清。逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液3ml，1.56ml硝酸钇(0.5mol/l)、400μl硝酸镱(0.5mol/l)、40μl硝酸铒(0.5mol/l)，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h。反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥h得到ucnps；

(2)首先将50mg制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂28％的氨水2ml，并逐滴滴加teos40μl，搅拌8h。逐滴滴加aptes200μl，持续搅拌1h。在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h。

(3)将1mmol的章鱼胺超声溶解到12ml乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加4mmolaptes，搅拌15min，加入50mg步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入6mmolteos后，加入100μl28％氨水进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；最后放入60℃真空干燥箱真空干燥24h，避光保存。

为了更好地理解本发明提供的的传感材料的性能，对合成所用的材料ucnps、ucnps@sio2和ucnps@sio2@mip进行了透射电镜、傅里叶红外光谱、荧光、热重分析(tga)、xrd衍射表征。

图2、图3、分别为本发明创造实施例所述的ucnps和ucnps@sio2@mip的透射电镜图。从图中可以看出制备的材料形状呈现棒状。ucnps的长度约为2μm，ucnps@sio2@mip粒径具有明显的核壳结构，其粒径明显大于ucnps，从而说明分子印迹层合成。

图4为本发明创造实施例所述的ucnps、ucnps@sio2和ucnps@sio2@mip的傅里叶红外光谱图。通过对比观察ucnps、ucnps@sio2@mip以及ucnps@sio2@nip的傅立叶红外光谱图，在1078、799、453位置分别代表着si-o-si键的伸缩振动和si-o-h键的伸缩振动以及si-o键的伸缩震动，而ucnps@sio2@mip以及ucnps@sio2@nip相对于ucnps在这两处有明显的特征峰。这一结果说明分子印迹前驱体中的各个硅烷类物质与荧光支撑材料ucnps@sio2中的si-oh键发生了键与键之间的结合并结合在支撑材料的表面。而1634、694位置分别代表着c-n键的伸缩震动以及ch2碳链的伸缩震动，在ucnps上并没有这两处位置的红外吸收峰，而在分子印迹聚合物聚合的过程中3-氨丙基三乙氧基硅烷为唯一的氮源，这充分表明功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷成功地结合在了荧光支撑材料的表面。上述说明已经成功制备了荧光印迹复合材料。

图5为本发明创造实施例所述的ucnps@sio2、ucnps@sio2@mip、ucnps@sio2@nip的tga图谱。如图所示，ucnps@sio2热失重比率为12.14％。ucnps@sio2@mip以及ucnps@sio2@nip产生两部分热失重情况。其中，第一部分热失重在100-550℃出现了大幅度的热失重现象，这一现象主要是由于分子印迹层受热分解所引起的热失重。第二部分热失重在550-800℃出现了热失重现象，这一现象的主要原因是由于复合物材料的热分解引起的与ucnps@sio2的热失重现象相一致。ucnps@sio2@mip和ucnps@sio2@nip的热失重比率分别达到了20.75％和24.35％。这一失重比率明显高于ucnps@sio2的热失重比率，这主要是因为材料外层的印迹层影响所引起的，从而进一步的说明了ucnps@sio2的表面已经成功包裹上了一层分子印迹层。从热失重曲线tga曲线可以看出该合成的分子印迹材料具有良好的热稳定性。

实施例3

研究该传感材料的动力学性能如图7。称取1mg印迹聚合物mip和非印迹聚合物nip，置于4ml的离心管底部并加入8mgl^-1的章鱼胺标准溶液各2ml，用封口膜密封离心管后固定于水平振荡器上分别振荡不同时间(20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min)后，立刻用外接980nm激发器的荧光分光光度仪测定材料吸附前后的荧光强度，绘制出荧光印迹聚合材料的吸附动力学曲线。如图7所示，在吸附章鱼胺的过程中，随着时间的延长，荧光印迹聚合材料mip和荧光非印迹聚合物nip的f/f0值不断上升，当吸附时间为2h时，f/f0数值基本趋于稳定达到吸附平衡。而且与非印迹聚合物相比，印迹聚合物由于具有高的空穴密度和特定的识别位点，因此对章鱼胺具有较高的荧光响应，同时吸附速率较快。

实施例4

研究该传感材料的吸附性能(如图8所示)，称取1mg印迹聚合物mip和非印迹聚合物nip，置于4ml的离心管底部，分别加入2ml不同浓度(2mgl^-1，4mgl^-1，6mgl^-1，8mgl^-1，10mgl^-1)的章鱼胺的标准溶液，每个浓度设置三个平行，之后用封口膜密封离心管，室温条件下固定于水平振荡器上充分振荡2h，随后用外接980nm激发器的荧光分光光度仪测定两种聚合材料吸附前后的荧光强度，分别绘制出荧光印迹聚合材料和非印迹聚合材料的吸附平衡曲线如图8，评价所制备的荧光分子印迹聚合材料对章鱼胺的吸附性能(ex＝980nm，em＝550nm)。从图中可以看出，随着章鱼胺浓度的增大，印迹及非印迹聚合物的荧光强度均出现升高。且在相同浓度下，mip的荧光增强强度明显大于nip的荧光增强强度。

实施例5

选择章鱼胺结构类似物组胺(his)、色胺(try)、酪胺(tyr)为竞争物，研究该传感材料的选择性能。结果如图9，章鱼胺比其他生物胺对mip的荧光强度影响更加明显。而章鱼胺和其他生物胺对nip的荧光强度影响作用效果相类似，这是由于nip中并不存在特异性识别位点，所以mip的荧光增强强度f/f0值要比nip的荧光增强强度f/f0值要大。以上结果表明mip对章鱼胺具有特异性识别能力，而对其他生物胺没有特异性识别能力。

实施例6

(1)上转换材料ucnps制备：

采用水热法合成上转换荧光纳米粒子，将乙醇，油酸，氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白；逐滴加入超纯水，搅拌至溶液变澄清；逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液，加入澜系物质硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h；反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥；

(2)ucnps@sio2的制备：

称取50mg步骤(1)制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂2ml，并逐滴滴加正硅酸四乙酯搅拌8h；逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷200μl，持续搅拌1h；在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h；

(3)荧光传感材料ucnps@sio2@mip的制备

将1mmol章鱼胺超声溶解到乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加4mmolaptes，搅拌15min，加入步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入4mmolteos后，加入100μl催化剂进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；真空干燥24h，避光保存。

实施例7

(1)上转换材料ucnps制备：

采用水热法合成上转换荧光纳米粒子，将乙醇，油酸，氢氧化钠粉加入到150ml圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白；逐滴加入超纯水，搅拌至溶液变澄清；逐滴滴加0.101gml^-1氟化钠水溶液，加入澜系物质硝酸钇、硝酸镱和硝酸铒，搅拌30min将反应溶液转移至反应釜中，230℃加热12h；反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3次，60℃真空干燥；

(2)ucnps@sio2的制备：

称取50mg步骤(1)制备的ucnps分散在80％乙醇溶液中，加入催化剂2ml，并逐滴滴加正硅酸四乙酯搅拌8h；逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷200μl，持续搅拌1h；在10000rpm的速度下离心10min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3次，60℃真空干燥12h；

(3)荧光传感材料ucnps@sio2@mip的制备

将1mmol章鱼胺超声溶解到乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加4mmolaptes，搅拌15min，加入步骤(2)制备的ucnps@sio2，搅拌15min，再逐滴加入20mmolteos后，加入100μl催化剂进行催化，搅拌15min，通入氮气15-20min，密封搅拌10h；离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次；直至模板全部洗脱；真空干燥24h，避光保存。

以上所述仅为本发明创造的较好的实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。