Zn/H2aip荧光探针、制备及其在检测四环素类抗生素中的应用

本发明属于抗生素检测分析技术领域，特别涉及一种识别四环素类(tcs)的荧光探针的合成，对荧光积分法的提出，以及一款利用荧光积分法识别四环素类抗生素的应用程序。

背景技术：

金属-有机骨架(mofs)是由有机配体和金属离子有序组合而成，也称为多孔协调聚合物。由于mofs具有大的内比表面积，多拓扑网络结构，低密度，均匀的空腔，永久多孔性，耐酸，耐碱性，高热稳定性，使得它成为被广泛探索的新型超分子研究材料，在气体分离，催化，药物传送，光学和电子传感等多个领域应用，而5-氨基间苯二甲酸是mofs中优异的有机合成中间体，位置1和3两个羧酸基团具有丰富的协调和共轭，可以通过共价连接，与金属离子形成的无限结构复合物，例如以5-氨基间苯二甲酸组成的多孔金属-有机骨架被用作检测硝基爆炸物和抗生素。然而，使用基于mofs聚集诱导的荧光检测仍处于初级阶段。已有报导以下几个例子，如金属有机框架增强金霉素的聚集诱导的荧光以及检测应用；多响应聚集诱导活性四苯基乙烯官能的水杨醛基对zn²⁺和co3^2-检测。因此，基于荧光mofs的分析方法，在灵敏度和选择性方面具有突出的优点，并在环境和生物成像中的应用有极大可研究的价值，同时，高选择性和灵敏度来设计能够检测tcs的多功能化学传感器有诱人的前景。以上所有报道的mofs传感器，在多个同族类分析物之间没有特定的区别，这是设计传感器最具有挑战的部分。tcs常作为治疗人类感染疾病的药物和饲料添加剂，易产生大量的残留并且在食物之中被发现。已报道的检测方法，包括电化学，紫外可见光谱和高效液相色谱。tcs具有相似的化学结构，所以在相同的环境难以使用探针很明显来区分tc，otc，dox和ctc等四环素类抗生素。

技术实现要素：

本发明涉及一种zn/h2aip荧光探针、制备及其在检测四环素类抗生素中的应用。通过识别四环素类(tcs)的荧光探针的合成，对荧光积分法提出应用，以及一款利用荧光积分法识别四环素类抗生素的应用。具体技术方案如下：

本发明所述zn/h2aip荧光探针的制备方法，包括以下具体步骤：

取0.05gzno、0.08-0.12g5-氨基间苯二甲酸和6-10ml的dmf，将其混合物进行超声处理，并置于反应釜中反应，随后用dmf(n,n-二甲基甲酰胺)和无水乙醇依次洗涤，然后在50-70℃烘箱中进行真空干燥，干燥后研磨以备用。

上述所述的制备方法中，优选的，所述置于反应釜中反应48小时，反应温度设定为120℃。

本发明所述制备方法可得到zn/h2aip荧光探针，该zn/h2aip荧光探针可在检测四环素类抗生素中的应用。

上述所述应用可采用下述方法步骤：将荧光探针制备成1mg/ml的储备溶液，加入到10mm、ph＝8的tris-hcl缓冲液中，依次加入不同浓度的四环素类抗生素，并记录荧光光谱，建立荧光强度与tcs浓度的线性关系。通过对待检测样品进行荧光检测，根据荧光强度与tcs浓度的线性关系从而可计算得到对应样品中tcs浓度。

上述所述应用也可采用下述方法步骤：将荧光探针制备成1mg/ml的储备溶液，取定量加入到10mm、ph＝8的tris-hcl缓冲液中，依次加入不同浓度的四环素类抗生素，并记录荧光光谱，同时将荧光光谱中从指定位置至结束出峰位置之间曲线下的面积进行积分求值(积分求值可通过常用的软件如matlab等实现)，以获得的积分面积以及tcs浓度，形成积分面积-浓度关系曲线。通过对待检测样品进行荧光检测分析，根据积分面积-浓度关系曲线从而可计算得到对应样品中tcs浓度。同时，还可设计应用程序“tcsanalysis”以在终端设备界面如手机app应用界面、电脑界面实时显示样品中tcs的污染程度。所述应用程序“tcsanalysis”录入积分面积-浓度关系曲线相关数据(txt记事本文件等等)，当进行样品荧光检测将获得的荧光数据在应用程序中录入时，分析指令启动，在程序内部计算后弹出新的界面中则实时显示如“tcs污染程度：xx-xxμm”数据。

本发明所述四环素类抗生素包括但不限于以下药物及其混合----tc：四环素；otc：土霉素；dox：强力霉素；ctc：金霉素等等。

本发明选择5-氨基间苯二甲酸(h2aip)作为稳定的三维框架mofs的有机配体，过渡金属zn(ii)作为金属源，合成对tcs具有独特响应的探针，并命名为[zn/h2aip]。在本发明中，探针[zn/h2aip]的三维结构通过sem，xrd，fitr，tg进行分析，而荧光光谱，紫外可见光谱，作为tcs的定性和定量核心分析数据。同时，建立了tcs的污染定量分析，应用荧光积分方法，通过“tcsanalysis”应用程序，可快速地获得包含在该样品tcs的总体污染的浓度范围，这有效地实现了智能处理和荧光检测的优良结合。通过设计“tcsanalysis”应用程序量化tcs的污染程度，荧光积分法提供了一种新的方法，并且通过精密的数据处理和智能分析量化污染程度。本发明合成了对tcs具有独特响应的荧光探针。同时，基于荧光积分法，不限于鉴定单个抗生素，可通过“tcsanalysis”应用程序量化tcs的污染程度，经过数据处理和智能分析，提供了一种新的方法来衡量tcs整体污染程度，适于便携式分析检测。

本发明提供的荧光探针可用于定性定量检测四环素家族类抗生素，在紫外光下就可以看到荧光明显增强，实现tcs的定性检测；通过建立荧光强度与tcs浓度的线性关系，可定量检测tcs浓度；

本发明在合成一种荧光探针的条件下，利用荧光光谱建立线性关系，并使用积分法进行拟合，实现了数据处理的有效性；

本发明通过设计“tcsanalysis”应用程序量化tcs的污染程度，提供了一种新的方法，通过精密的数据处理和智能分析来衡量污染程度。目前已知的污染定量主要取决于荧光强度，而在对混合污染物的荧光检测中，荧光光谱的峰并不能非常明确，荧光强度峰值难以选择，这样则会带来相应的误差，而精确的积分算法不需要关注峰值，则可以弥补所提到的缺陷。也就是说，采用比率荧光强度-浓度的方法可以对单一种四环素类抗生素污染物进行定量检测，但在对混合污染物(含一种及以上四环素类抗生素)的荧光检测时由于荧光光谱的峰并不能非常明确，采用比率荧光强度-浓度的方法就难以确定污染物中四环素类抗生素的总体污染程度如何。此外，也可通过更广泛的浓度区间和抗生素种类制作标准曲线上传到“tcsanalysis”后台作为参考标准。

附图说明

图1是本发明探针与不同浓度tc、otc的荧光光谱图以及线性关系图，附图为探针分别添加tc、otc前后可视化效果图；

图2是本发明探针与不同浓度dox、ctc的荧光光谱图以及线性关系图，附图为探针添加dox、ctc前后可视化效果图；

图3是本发明探针与tcs的积分拟合曲线；

图4是“tcsanalysis”应用程序量化tcs的污染程度的分析界面展示。

图5是本发明zn/h2aip探针材料的结构表征。

图6是选择性研究实验光谱图。

具体实施方式

本发明涉及一种识别四环素类抗生素的荧光探针的合成，对荧光积分法的提出应用，以及一款利用荧光积分法识别四环素类抗生素的应用程序。下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

图1是本发明探针与不同浓度tc、otc的荧光光谱图以及线性关系图，激发波长为365nm，发射波长分别为517nm和520nm，附图为探针添加tc、otc前后可视化效果图(在365nm紫外灯下)；a和c图中，各荧光曲线从下至上所对应的tcs浓度逐渐增大；b、d图中，右下角三个柱子分别表示加入本发明的探针前后的溶液荧光色彩变化---b图中，加入前：探针溶液为蓝色、tcs溶液为土黄色，加入后：混合溶液为浅绿色；d图中，加入前：探针溶液为蓝色、tcs溶液为土黄色，加入后：混合溶液为浅绿色；

图2是本发明探针与不同浓度dox、ctc的荧光光谱图以及线性关系图，激发波长为365nm，发射波长分别为513nm和525nm，附图为探针添加dox、ctc前后可视化效果图(在365nm紫外灯下)；a和c图中，各荧光曲线从下至上所对应的tcs浓度逐渐增大；b、d图中，右下角三个柱子分别表示加入本发明的探针前后的溶液荧光色彩变化---b图中，加入前：探针溶液为蓝色、tcs溶液为土黄色，加入后：混合溶液为浅绿色；d图中，加入前：探针溶液为蓝色、tcs溶液为深绿色，加入后：混合溶液为浅绿色；

图3是本发明探针与tcs的积分拟合曲线，从436nm(指定位置)至700nm(结束出峰位置)的曲线下的面积进行积分求值，以获得的数学等效值以及tcs浓度，形成积分面积-浓度关系曲线；

图4是“tcsanalysis”应用程序量化tcs的污染程度的分析界面展示，如图所示，应用程序“tcsanalysis”的主菜单包括三个部分(图4)。所述第一部分是用于读取txt文件。第二部分是“分析”。一旦该指令启动，在程序内部计算后弹出新的界面中显示“tcs污染程度：xx-xxμm”。第三部分展示“应用程序信息”，提醒程序的操作过程及本版本的声明。

图5是本发明zn/h2aip探针材料的结构表征。其中，(a)zn/h2aip的sem图像。(b)zno、zn/h2aip和h2aip的xrd分析。(c)zn/h2aip的tga曲线。(d)zn/h2aip和h2aip的红外光谱。本发明zn/h2aip的晶体结构sem显示形状独特的立方体结构，并非常见的zn配位多面体结构。并且，在31.74°、34.42°和36.29°处的2θ峰对应于zno的典型纤锌矿结构bragg峰(100)、(002)和(101)。同时，材料在20.05°和22.83°处出现了新的高强度衍射。tg谱图中，429摄氏度开始分解，486摄氏度趋于稳定。ftir强羧酸配位伸缩振动在1553cm^-1和1363cm^-1。

图6是选择性研究实验光谱图。(a)同时存在dox，ctc，otc和tc(共16μm)的情况下[zn/h2aip](0.05mg/ml)的荧光光谱。(b)探针[zn/h2aip](0.05mg/ml)对tris(ph＝8)中其他抗生素和金属离子的选择性研究实验。tc、otc、ctc、dox、amp(氨苄青霉素)、lpa(l-青霉胺)、sms(硫酸链霉素)、ca²⁺、k⁺、na⁺各自浓度均相同，浓度均为10μm。可见，amp(氨苄青霉素)、lpa(l-青霉胺)、sms(硫酸链霉素)、ca²⁺、k⁺、na⁺的存在并不会影响到本发明所选取的积分面积(从436nm至700nm之间)，反映出本发明对于四环素类抗生素检测应用的有效性及可行性。

实施例1

(1)合成荧光探针

取zno(0.05g)和5-氨基间苯二甲酸(0.1g)和8ml的dmf，将其混合物超声处理，并置于120℃反应釜中反应48小时。取出后，用dmf和无水乙醇依次洗涤，在60℃烘箱中真空干燥后研磨，得到zn/h2aip荧光探针。探针材料制备成1mg/ml的储备溶液，可存储于冰箱备用。

(2)定性、定量检测tcs

本发明探针zn/h2aip与tcs的荧光响应在tris-hcl缓冲液(10mm，ph＝8)下进行。100μl探针zn/h2aip(1mg/ml)添加到含2ml缓冲液的比色皿中，需进行30分钟孵化等待，探针的终浓度为0.05mg/ml，然后将tcs加入到上述溶液中。tcs的最终浓度分别为0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28μm。以365nm作为激发波长，荧光光谱从385nm记录至700nm，将i517/i403、i520/i403、i513/i403和i525/i403分别作为tc四环素、otc土霉素、dox强力霉素和ctc金霉素的比率荧光强度用于最终定量分析的线性数据，得到比率荧光强度-浓度关系曲线及线性方程，如图1、图2。

(3)应用程序“tcsanalysis”设计

引入对污染程度的智能分析，实现对tcs的污染程度的识别。实现将未知浓度的不同tcs被添加到所制备的探针溶液中，获得相应的荧光光谱，进行积分处理后，与标准曲线进行比对。最后，所估计的污染浓度被显示在新建的窗口上。

第一步是标准曲线。以上述步骤(2)图1、图2所示荧光光谱图，选取在436nm和700nm之间，0-28μm的tcs荧光光谱，通过面积积分法，得到四种四环素类抗生素荧光检测的积分面积-浓度关系曲线及线性方程如图3。

第二步是理论设计。将未知浓度的样品进行荧光检测获得荧光光谱，且从436nm至700nm之间的荧光光谱曲线进行求面积积分，获得数学等效值即积分面积数值，并且将该积分面积数值通过与四种四环素类抗生素的积分面积-浓度关系标准曲线进行比较，可获得该积分面积数值在四个标准曲线上所对应的浓度数值，而最高浓度和最低浓度被取出作为污染范围，也即获得了污染程度的指标。

第三步是智能应用程序。同时，根据数据处理和智能客户端，所获得的信息在后台处理并呈现智能运算的结果。安装在桌面上的软件读取荧光光谱的txt文件，污染浓度被显示在新建的窗口上。

通过命名为“tcsanalysis”的应用程序，可以迅速地获得包含在样本中的tcs的整体污染的浓度范围。该检测基于与所述标准曲线的精确比对后的自动匹配。

实施例2

配制强力霉素样品溶液，使其放置于2mltris-hcl缓冲溶液(10mm，ph＝8)中最终浓度为4μm。采用本发明积分面积法进行检测。首先100μl探针zn/h2aip(1mg/ml)添加到上述2mltris-hcl缓冲液的比色皿中，进行30分钟孵化等待，探针的终浓度为0.05mg/ml，以365nm作为激发波长进行荧光检测，荧光光谱从385nm记录至700nm，且从436nm至700nm之间曲线下的面积进行积分获得面积积分数值，再根据图3所述四个标准曲线读数计算得到tcs样品溶液浓度范围为4.01-12.12μm。通过应用程序“tcsanalysis”则可在界面直接显示“tcs污染程度：4.01-12.12μm”。

实施例3

配制强力霉素样品溶液，使其放置于2mltris-hcl缓冲溶液中最终浓度浓度为8μm。采用实施例2所述方法进行检测，得到tcs样品溶液浓度为8.05-21.4μm。通过应用程序“tcsanalysis”则可在界面直接显示“tcs污染程度：8.05-21.4μm”。

实施例4

配制强力霉素样品溶液，使其放置于2mltris-hcl缓冲溶液中最终浓度浓度为10μm。采用实施例2所述方法进行检测，得到tcs样品溶液浓度为9.92-25.7μm。通过应用程序“tcsanalysis”则可在界面直接显示“tcs污染程度：9.92-25.7μm”。

以下表格显示了不同四环素类抗生素在不同浓度的输出端界面的对应数据。

实施例5

配制四种类型四环素的混合溶液(含dox，ctc，otc和tc)，放置于2mltris-hcl缓冲溶液中使四种类型四环素最终总浓度为16μm(dox，ctc，otc和tc各4μm)。采用本发明积分面积法进行荧光检测如图6(a)。首先100μl探针[zn/h2aip](1mg/ml)添加到含2mltris-hcl缓冲液(10mm，ph＝8)的比色皿中，进行30分钟孵化等待，探针的终浓度为0.05mg/ml，然后将配制的tcs样品溶液加入到上述溶液中，以365nm作为激发波长进行荧光检测，荧光光谱从385nm记录至700nm，且从436nm至700nm之间曲线下的面积进行积分获得积分面积数值。然后对曲线进行面积积分再根据图3所述标准曲线得到tcs样品溶液浓度。通过应用程序“tcsanalysis”则可在界面直接显示“tcs污染程度：15.42-38.35μm”。