一种生物被膜抑制剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物被膜抑制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.细菌生物被膜(bf)是指细菌为适应自然环境，粘附于惰性物体表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将其自身克隆聚集包绕其中而形成的大量细菌聚集的膜状物。细菌生物被膜主要由细菌和胞外多糖基质、嵌在基质中的多个微菌落及水通道组成的立体结构。在生物被膜中生长的细菌无论其形态结构、生理生化特性、对抗菌药物的耐药性等都与普通浮游菌有显著的不同。生物被膜深层的细菌与浮游菌的dna序列不一，细胞的形态也呈现出多形性，而且由于生长速度启动的普遍应激反应，是细菌的生理学得到改变，使其在各种环境下得到保护。
3.致病性细菌生物被膜的形成能极大的增强细菌的耐药性且不易被清除，引起不同程度的慢性或持续性细菌感染，导致致病菌生物被膜相关感染的难治性，威胁公共卫生安全。而且致病性细菌生物被膜更是养殖业的重灾区，由于长期药物的不合理应用，耐药菌株逐年增多，而且呈现出交叉耐药和多重耐药的趋势，严重威胁养殖业的健康发展。
4.因此，开发新型的细菌生物被膜抑制剂势在必行。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的第一个技术问题是：
6.提供一种生物被膜抑制剂。
7.本发明所要解决的第二个技术问题是：
8.上述生物被膜抑制剂的制备方法。
9.为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
10.一种生物被膜抑制剂，
11.包括成膜物质和纳米抑菌材料；
12.所述成膜物质为水性树脂分散体或聚合物乳液中的至少一种。
13.将上述纳米抑菌材料添加到上述成膜物质中，混合均匀后，得到生物被膜抑制剂。经喷涂施工后在物体表面形成一层生物被膜抑制剂涂层，待涂层干燥后，上述纳米抑菌材料均分分布在涂层中，并随空气中水分子进出涂层的孔隙通道，在涂层表面富集。由于空气中的水分子含量相对较少，从而使得本发明生物被膜抑制剂中的上述纳米抑菌材料释放出来的速率十分缓慢，从而达到了药物缓慢释放的效果。
14.根据本发明的一种实施方式，上述成膜物质与所述纳米抑菌材料的重量比为(30-70)：(1-10)。
15.根据本发明的一种实施方式，上述生物被膜抑制剂还包括以下原料：
16.润湿剂、消泡剂和流平剂中的至少一种。
17.根据本发明的一种实施方式，上述成膜物质包括水性丙烯酸树脂、苯丙乳液、水性
环氧树脂、水性聚氨酯树脂、水性醇酸树脂中的至少一种。
18.根据本发明的一种实施方式，上述纳米抑菌材料包括纳米银、纳米氧化铜、纳米氧化锌中的至少一种。
19.根据本发明的一种实施方式，上述润湿剂为阴离子型、非离子型和两亲型润湿剂中的至少一种。
20.根据本发明的一种实施方式，上述消泡剂为聚醚类、矿物油类、聚丙烯酸酯类、有机硅类、氟碳共聚物、氯醋共聚物、丙烯酸共聚物中的至少一种。
21.根据本发明的一种实施方式，上述流平剂为丙烯酸聚合物、氟类和有机硅类中的至少一种。
22.根据本发明的一种实施方式，上述纳米抑菌材料预先分散在水中制成分散液或者预先负载在纳米氧化锆上形成粉剂。
23.根据本发明的一种实施方式，上述纳米抑菌材料的尺寸在1-100nm。
24.为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
25.一种制备上述一种生物被膜抑制剂的方法：
26.混合上述成膜物质和上述纳米抑菌材料，得到上述生物被膜抑制剂。
27.本发明的再一个方面，还提供一种生物被膜抑制剂制备抗菌制品中的应用。
28.上述抗菌制品包括抗菌涂料与喷剂制品。
29.本发明的再一个方面，还提供一种抑菌制品，包括上述的一种生物被膜抑制剂。
30.上述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
31.将上述纳米抑菌材料添加到上述成膜物质中，混合均匀后，得到生物被膜抑制剂。经喷涂施工后在物体表面形成一层生物被膜抑制剂涂层，待涂层干燥后，上述纳米抑菌材料均分分布在涂层中，并随空气中水分子进出涂层的通道在涂层表面富集。由于空气中的水分子含量相对较少，从而使得本发明生物被膜抑制剂中的上述纳米抑菌材料释放出来的速率十分缓慢，从而达到了药物缓慢释放的效果。释放出来的纳米抑菌材料不仅能起到对表面浮游菌的长效灭杀、抑制表面细菌生物被膜的形成的效果，而且能将已有的顽固生物被膜形成包覆灭杀。除此之外，上述生物被膜抑制剂涂层能够更好的吸附在物体表面，不易脱落，除菌作用持久。
具体实施方式
32.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
33.(一)材料、试剂和仪器
34.1.实验菌株
35.沙门氏菌
36.2.主要试剂及药物
37.胰蛋白胨(tryptone，oxoid)、酵母浸出物(yeast extract，oxoid)、nacl(国产分析纯)、na2hpo4(国产分析纯)、kh2po4(国产分析纯)、nh4cl(国产分析纯)、mgso4(国产分析纯)、cacl2(国产分析纯)、葡萄糖(国产分析纯)、he琼脂粉(国产分析纯)、结晶紫(国产分析纯)、纳米银(国产)、纳米氧化锌(国产)、纳米氧化铜(国产)。
38.3.实验仪器
39.恒温振荡器(上海一恒，hzq-x300c)
40.生化培养箱(biobase，spx-300)
41.高压蒸汽灭菌器(biobase，bkq-b75ii)
42.电子分析天平(sartorius，gl3202i-1scn)
43.超净工作台(biobase，bbs-ddc)
44.6孔板(biofil公司)
45.pc塑料管(直径10mm、市售)
46.pc塑料棒(直径8mm、市售)。
47.(二)实验菌株生物被膜培养
48.1.实验菌株准备
49.1)实验菌株复苏
50.取出-70℃保存的沙门氏菌甘油菌液，置于冰上缓慢融化后充分振荡摇匀，在超净工作台中用接种环蘸取一环菌液划线于lb固体培养基上。在37℃培养箱中培养16-18h。挑取固体培养基上单个菌落，接种于4ml的lb液体培养基中，放入37℃的恒温摇床中200r/min培养8h，备用。
51.2)实验菌株活化
52.取上述复苏的实验菌株用接种环蘸取一环菌液划线于lb固体培养基上。在37℃培养箱中培养16-18h。挑取固体培养基上单个菌落，接种于4ml的lb液体培养基中，放入37℃的恒温摇床中200r/min培养4-6h，将菌液用lb培养基调光密度od
600
≈1(相当于108cfu/ml)，备用。
53.2.实验菌株生物被膜培养
54.将活化后的菌液用lb培养基进行1:100倍稀释，加入96孔板中，每孔加入100μl，设置平行实验，并以无菌培养基作为阴性对照，置于37℃的培养箱中培养24h，用灭菌的pbs溶液洗去浮游菌，即可观察得到沙门氏菌生物被膜。
55.(三)长效细菌生物被膜抑制剂抑制沙门氏菌生物被膜形成实验
56.将上述步骤中活化后的沙门氏菌菌液用lb培养基按1:100的比例稀释至浓度为106cfu/ml，将0.5ml稀释后的沙门氏菌菌液加入到灭菌后的pc塑料管中，放入表面涂覆有长效细菌生物被膜抑制剂的pc塑料棒封口，做3组平行实验，并设置阴性对照(涂覆有长效细菌生物被膜抑制剂的pc塑料棒，无沙门氏菌的lb培养基)和阳性对照(空白的pc塑料棒，浓度为106cfu/ml的沙门氏菌菌液)。置于37℃培养箱中培养24h后。弃去菌液，用pbs溶液清洗pc塑料管3次，用结晶紫染色20min后，用pbs溶液清洗残余结晶紫3次，再在流动的水中清洗1min，用33％的乙酸溶液洗脱结晶紫，用摇床充分振荡1h后，测试od值。
57.(四)长效细菌生物被膜抑制剂对细菌生物被膜的清除作用
58.按配方量配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，在超净工作台中将长效细菌生物被膜抑制剂涂覆在按上述步骤已经培养好沙门氏菌生物被膜的6孔板中，在超净工作台中晾干后保湿密封放置，做3组平行实验，并设置阴性对照(涂覆长效细菌生物被膜抑制剂，无沙门氏菌生物被膜)和阳性对照(不涂覆长效细菌生物被膜抑制剂，有沙门氏菌生物被膜)。于室温条件下放置24h后，加入2ml的lb培养基，置于37℃的培养箱中培养8h后进行平板计数。
59.实施例1
60.一种长效细菌生物被膜抑制剂及其应用，其中，所述长效细菌生物被膜抑制剂由如下重量份的原料组成：
[0061][0062]
其中，纳米银粉末为将纳米银预先负载在纳米氧化锆上形成的纳米银粉剂，纳米银粉末中纳米银重量百分比为2％，其中，纳米银的尺寸为10-20nm，纳米银为该尺寸区间内任意尺寸按任意比例混合的混合体。按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂，将其涂覆在灭菌后的pc塑料棒上，按照上述(三)“长效细菌生物被膜抑制剂抑制沙门氏菌生物被膜形成实验”的方法测试od值，每间隔一个月按照上述(三)的方法测试其对沙门氏菌生物被膜形成的长效抑制作用。测试的od值(od630)如下，其中od为0.030～0.040时，可以认为没有沙门氏菌或者只含有很少量的沙门氏菌。结果表面，6个月后长效细菌生物被膜抑制剂仍然能够有效的抑制表面细菌生物被膜的形成。
[0063]
表1纳米银细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜形成的作用
[0064][0065]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，在超净工作台中将长效细菌生物被膜抑制剂涂覆在已经培养好沙门氏菌生物被膜的6孔板中，在超净工作台中晾干后保湿密封24h，然后测试其对沙门氏菌生物被膜清除作用。各实验组的菌落数如下表所示，长效细菌生物被膜抑制剂对已经相成的细菌生物被膜具有良好的清除效果。
[0066]
表2纳米银细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜的清除作用
[0067][0068][0069]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，分别在猪场产房的墙壁上选定3个1m2的区域，作为测试区域，实验组涂刷配制好的长效细菌生物被膜抑制剂，阴性对照喷洒与实验组相同浓度的纳米银溶液，阳性对照不做任何处理。分别间隔1个月用棉拭子在3个测试区域采样，采样面积为5*10cm。将采样后的棉拭子浸没于1ml无菌pbs溶液中，涡旋后进行菌落计数，结果如下表所示，1个月后，阴性对照的菌落数明显上升，表明直接喷洒的纳米银溶液，在一个月后，只有部分纳米银还残留在墙壁上了，而实验组到6个月时候仍然具有90％以上的灭菌率。
[0070]
表3猪场产房纳米银细菌生物被膜抑制剂实验结果
[0071][0072]
从上表的阴性对照1-3与实验组1-3可知，只有纳米银溶液与成膜物质同时存在，才能实现缓慢释放纳米银的效果，只使用纳米银溶液来灭菌，效果不长久。
[0073]
实施例2
[0074]
一种长效细菌生物被膜抑制剂及其应用，其中，所述长效细菌生物被膜抑制剂由如下重量份的原料组成：
[0075]
[0076][0077]
其中，纳米氧化锌溶液中纳米氧化锌重量百分比为1％，其中，纳米氧化锌的尺寸为5-15nm，纳米氧化锌为该尺寸区间内任意尺寸按任意比例混合的混合体。按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂，将其涂覆在灭菌后的pc塑料棒上，置于相同环境中。分别间隔1个月测试其对沙门氏菌生物被膜形成的长效抑制作用。测试的od值如下，6个月后长效细菌生物被膜抑制剂仍然能够有效的抑制表面细菌生物被膜的形成。
[0078]
表4纳米氧化锌细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜形成的作用
[0079][0080]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，在超净工作台中将长效细菌生物被膜抑制剂涂覆在已经培养好沙门氏菌生物被膜的6孔板中，在超净工作台中晾干后保湿密封，然后测试其对沙门氏菌生物被膜清除作用。各实验组的菌落数如下表所示，长效细菌生物被膜抑制剂对已经相成的细菌生物被膜具有良好的清除效果。
[0081]
表5纳米氧化锌细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜的清除作用
[0082][0083][0084]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，分别在猪场产房的墙壁上选定
3个1m2的区域，作为测试区域，实验组涂刷配制好的长效细菌生物被膜抑制剂，阴性对照喷洒与实验组相同浓度的纳米氧化锌溶液，阳性对照不做任何处理。分别间隔1个月用棉拭子在3个测试区域采样，采样面积为5*10cm。将采样后的棉拭子浸没于1ml无菌pbs溶液中，涡旋后进行菌落计数，结果如下表所示，6个月后实验组仍然具有90％以上的灭菌率。
[0085]
表6猪场产房纳米氧化锌细菌生物被膜抑制剂实验结果
[0086][0087]
实施例3
[0088]
一种长效细菌生物被膜抑制剂及其应用，其中，所述长效细菌生物被膜抑制剂由如下重量份的原料组成：
[0089][0090][0091]
其中，纳米氧化铜溶液中纳米氧化锌重量百分比为1％，其中，纳米氧化铜的尺寸为5-15nm，纳米氧化铜为该尺寸区间内任意尺寸按任意比例混合的混合体。按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂，将其涂覆在灭菌后的pc塑料棒上，置于相同环境中。分别间隔1个月测试其对沙门氏菌生物被膜形成的长效抑制作用。测试的od值如下，6个月后长效细菌生物被膜抑制剂仍然能够有效的抑制表面细菌生物被膜的形成。
[0092]
表7纳米氧化铜细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜形成的作用
[0093][0094]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，在超净工作台中将长效细菌生物被膜抑制剂涂覆在已经培养好沙门氏菌生物被膜的6孔板中，在超净工作台中晾干后保湿密封，然后测试其对沙门氏菌生物被膜清除作用。各实验组的菌落数如下表所示，长效细菌生物被膜抑制剂对已经相成的细菌生物被膜具有良好的清除效果。
[0095]
表8纳米氧化铜细菌生物被膜抑制剂对沙门氏菌生物被膜的清除作用
[0096][0097][0098]
按上述配方配制好长效细菌生物被膜抑制剂备用，分别在猪场产房的墙壁上选定3个1m2的区域，作为测试区域，实验组涂刷配制好的长效细菌生物被膜抑制剂，阴性对照喷洒与实验组相同浓度的纳米氧化铜溶液，阳性对照不做任何处理。分别间隔1个月用棉拭子在3个测试区域采样，采样面积为5*10cm。将采样后的棉拭子浸没于1ml无菌pbs溶液中，涡旋后进行菌落计数，结果如下表所示，6个月后实验组仍然具有90％以上的灭菌率。
[0099]
表9猪场产房纳米氧化铜细菌生物被膜抑制剂实验结果
[0100][0101]
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。