抑制眼病理过程的方法

专利名称：抑制眼病理过程的方法
技术领域：
本发明总的涉及抑制或预防眼病理过程，包括眼细胞外基质产生和/或沉积、新血管形成、炎症、细胞增生，细胞迁移等的方法，以及用于预防和治疗眼科疾病的方法和制剂。
背景技术：
眼睛是一种复杂的器官，拥有包括各种结构和高度专门化细胞类型的多功能层。视网膜是衬垫眼后部的感光层。黄斑是视网膜位于眼睛光轴上的一部分，黄斑提供了精细视觉和对视野中心(物体)的精细区分。健康眼睛中外视网膜由称为视网膜包素上皮的毗邻层所滋养和维护，视网膜色素上皮(RPE)细胞单层位于视网膜下。视网膜色素上皮后面是含有转运营养物质进入或携带废物离开视网膜的血管的脉络血管丰富区。眼睛的其它重要结构包括晶状体、虹膜、角膜、小梁网和玻璃体。
眼科疾病是眼睛的正常生理和功能的改变。眼科疾病可由各种急性或慢性疾病和事件所引起，包括损伤、创伤、病疾、外科手术等。眼科疾病可导致视力清晰度降低。视力丧失和视觉缺失，严重地影响了生活质量。
绝大多数眼科疾病与某些生理活动相关。在对这些生理活动反应中(或与之相关)发生的细胞增生、细胞迁移、炎症、新血管形成和纤维变性(胞外厂基质组分的过度产生和沉积)导致了眼睛形态和功能改变，和许多眼科疾病。眼睛中的创伤愈合反应常常包括一种或多种这些病理过程。常见的眼病和眼内生理过程的例子包括以下增生性玻璃体视网膜病变增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种由眼损伤或创伤，包括穿孔性损伤、孔源性视网膜剥脱，贯通性损伤、眼内异物、挫伤等引起的眼科疾病(Cardillo等，Ophthalmology 1041166-1173.1997)PVR是治疗与视网膜变形、破裂相关的孔源性视网膜剥脱和复发性剥脱失败的最常见原因(Girard等，Retina，14.417-424，1994)。PVR与玻璃体腔(玻璃体膜之间)中及视网膜内和外表面(表视网膜)二者中的细胞增生，纤维膜的形成、生长和细胞接触相关联。
表视网膜和玻璃体膜主要含RPE细胞，但也含成纤维细胞、胶质细胞(如米勒细胞、星状细胞、微胶质细胞体、血管周围胶质细胞等)和炎性细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)。除细胞成分外，表视网膜和玻璃体膜这些与PVR相关的膜还含有胞外基质成分，如胶原蛋白(如I、II和IV型胶原)和纤连蛋白，也可含硫酸乙酰肝素，层连蛋白，玻璃体结合蛋白，血小板反应素等。与PVR相关的表视网膜和玻璃体膜随时间推移而进行性细胞减少和纤维化(Hiscoff等，Br.J.Ophthalmol，11810-823，1985)，与眼膜发生或改变相关的PVR和其它疾病可作为许多疾病如糖尿病的并发症影响眼睛。
黄斑变性黄斑变性，包括老年性黄斑变性，是导致视敏度降低，阅读能力受损和精细近程视力受损的原因。通常黄斑变性的特征是视网膜中心称为黄斑的部位变性，导致患病眼睛中心视力丧失。黄斑变性至少部分起源于视网膜色素上皮中，与视网膜色素上皮和血管脉络膜之间基底膜(布鲁赫膜)中细胞外基质的异常沉积相关。黄斑变性中的胞外基质沉积称为玻璃疣。两种主要类型的黄斑变性特征是干性黄斑变性也称为非渗出性退化性萎缩性、黄斑变性或局部性萎缩；和湿性黄斑，也称为渗出性新生血管性或盘状黄斑变性。
脉络膜新血管形成脉络膜新血管形成(CNV)是一种严重病症，常与包括脉络膜内皮细胞(CEC)粘附，移行和增生，胞外基质过度产生和纤维血管性视网膜底膜的产生的黄斑变性相关联(D’Amore，IOVS 353974-3979，1994；Hinton等，Arch Ophthalmol 116203-209，1998)。证据提示视网膜色素上皮层在CNV发生中起关键性作用，RPE细胞的去分化，增生，移行和血管生成因子的产生调节着CNV的发展(Vrossniklans等，Am，J.Ophthamol 114464-472，1992；Das等，Ophthamology 991368-1376，1992)。虽然黄斑变性中最常见CNV，但经鉴定认为它是40岁以上其它眼病的并发症。
伤口愈合对于急慢性损伤、创伤、疾病等眼内伤口的愈合可能延长或失调，从而导致更严重的眼组织破坏和视力丧失。伤口愈合级联反应包括例如炎症反应的诱导；炎性细胞的募集和活化；生长因子和细胞因子释放；各种眼细胞胞外基质的分泌和沉积增加；纤维增生、新血管产生；组织重建和组织修复(Cordeiro等，Br.J.Ophthamol 831219-1224，1999)。
如上所述，各种眼科疾病是相互关联的，并包括共同的病理过程。上述和其它疾病，例如，糖尿病性视网膜病和青光眼，是严重的眼病与这些常见的眼病理过程，和眼内新血管形成和眼疤痕形成(即眼纤维增生)相关的示范性例子。
例如，糖尿病性视网膜病的现有治疗方法，在引起新血管形成退变和预防玻璃体出血和牵引性视网膜脱离中有些效果。然而，这种疗法不能治疗，因而不能防止或最大程度降低各种病理过程(即细胞增生，细胞迁移，眼纤维变性)的发生和推进，可导致严重程度不同的视力损伤，甚至视力丧失。目前对PVR的治疗包括玻璃体摘出术，摘除玻璃体和视网膜表面形成的膜。然而，这种治疗引发了眼睛炎症，导致PVR相关病理过程重新活跃。治疗与CNV相关的黄斑变性时，用光动力学/激光光照凝固法治疗活化脉络膜血管的堵塞不能处理相关的眼纤维变性，事实上，甚至可诱导伤口愈合反应，从而导致进一步的并发症。目前许多其它眼病疗法常采用机构性方法，如外科手术包括激光手术来去除或切除眼内异常的膜或组织，而不是针对介导眼病理过程的生长因子和其它病理学分子。
总之，目前尚无治疗方法能成功地预防或抑制眼科疾病中病理过程，包括例如新血管形成，纤维增生、细胞增生、细胞迁移、炎症等的产生和发展。因此，需要一种广泛应用于治疗各种眼病而不论其起因或发展的治疗方法。还需要一种能处理导致眼病发生和发展的常见眼病理过程的治疗方法。具体说，需要这种疗法针对黄斑变性极其普遍的纤维化过程和眼疤痕、糖尿病性视网膜病、白内障和角膜纤维化(包括角膜瘢疤形成或模糊)和青光眼。
本发明之前，结缔组织生长因子(CTGF)在各种眼科疾病和相关疾病中的作用仍然未明。已报道在培养的视网膜血管内皮细胞、晶状体上皮细胞和家兔角膜或纤维细胞中有CTGF表达(见例如Suzuma等，J.Bilo Chem 27540725-312000；Lee和Joo，Invest Ophthalmol Vis Sci 402025-2032，1999；Park等，Biochem BiophysRes Commun 284966-971，2001；Folger等，Invest Ophthalmol Vis Sci 422534-2541，2001)。观察到角膜瘢疤形成组织和后角膜中人动脉囊下性白内障和囊后性浑浊的膜中，及表视网膜和视网膜后的纤维血管膜中有CTGF mRNA表达。(Wunderlich等，Ophthalmologica 214，341-349，2000；Wunderlich等，Curr Eye Res 21，627-636，2000；Meyer等，Ophthalmologica 216.284-291，2002)。这些初步观察提示，本领域目前需要更全面了解和特性分析CTGF在眼病中的作用。
总之，需要能用于预防或治疗眼科疾病和对这些疾病反应或与之相关而发生的各种生理过程的治疗方法。还需要了解CTGF在眼科疾病中和许多这些疾病共同的生理通路中的总体作用。本发明通过鉴定CTGF在眼科疾病发生和发展相关的病理过程的作用，并通过提供抑制和预防这些过程的方法回答了这些需要。本发明还通过提供能用于治疗和预防眼科疾病和相关疾病的方法和制剂解决了目前这些需要。
发明概述本发明涉及抑制或预防眼病理过程的方法，提供用于治疗和预防眼科疾病的方法和治剂，诊断眼科疾病的方法和相关的试剂盒，以及筛选用于所述方法的试剂的方法。
一实施例中，本发明提供抑制或预防对象中CTGF相关眼科病理过程的方法，所述方法包括给予能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。这些方法可用于体内或体外。在不同实施例中，所述对象是一种细胞或动物，优选哺乳动物，最优选人。
本发明一方面，所述药物选自抗体，反义寡核苷酸和小分子。另一方面内容是将所述药物输送给患病眼睛，特别考虑将所述药物输送给眼表面。优选将所述药物以滴眼剂型输送。
优选实施例中，所述眼病理过程还与眼细胞相关。某些实施例中，所述眼细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星状细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星形细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。
另一实施例中，所述眼病理过程还与眼球结构相关，在不同实施例中，本发明所述的眼球结构选自视网膜、视网膜色素上皮层、脉络膜、黄斑、角膜、晶状体、虹膜、巩膜、小梁网、房水腔、玻璃体、睫状体、视盘、乳头和视网膜中央凹。
抑制或预防CTGF相关的眼病理过程的方法，包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性(其与眼科疾病的眼病理过程相关)的药物，这是特别要考虑的。特别考虑将本发明方法用于任何CTGF相关性眼科疾病。具体实施例中，所述眼科疾病选自青光眼、白内障、脉络膜新血管形成，视网膜剥脱，增生性玻璃体视网膜病变，黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜瘢疤形成形成和角膜浑浊。优选实施例中，所述眼病理过程还与眼纤维变性相关。
抑制或预防眼细胞外基质产生或沉积的方法，包括给予对象本文专门提供的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。抑制或预防眼疤痕形成的方法，包括给予对象专门提供的能降低CTGF或其表达或活性的药物。一实施例中，本发明提供抑制和预防眼内新血管形成的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。其它实施例中，所述新血管形成是视网膜新血管形成，脉络膜新血管形成、虹膜新血管形成、小梁新血管形成。抑制或预防眼睛炎症的方法，包括给予对象本发明提供的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
本发明还考虑抑制或预防眼细胞增生的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。不同实施例中，所述眼细胞增生选自上皮细胞增生、内皮细胞增生、视网膜色素上皮细胞增生和脉络膜内皮细胞增生。
一方面，本发明提供抑制或预防眼细胞迁移的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。具体实施例中，所述眼细胞迁移选自上皮细胞迁移、、视网膜色素上皮细胞迁移、内皮细胞迁移和脉络膜内皮细胞迁移。
本发明还提供抑制或预防对象中CTGF相关眼病理过程的方法，所述方法包括给予能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物，其中所述眼病理过程还与手术有关。不同方面，所述眼科手术选自屈光纠正手术、放射状角膜切开术、LASIK、视网膜剥脱治疗术、角膜移植术、青光眼渗滤术、白内障摘除术、晶状体置换术、玻璃体切除术、视网膜下手术和视网膜易位术。
本发明具体提供治疗或预防眼病理过程的方法。一实施例中，本发明提供治疗或预防眼科病理过程的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。另一方面，提供治疗或预防眼纤维变性的方法，所述方法包括给予对象特别考虑的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
一方面，本发明提供治疗或预防与新血管增生相关的眼内疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。不同方面，所述新血管形成选自视网膜新血管形成，脉络膜新血管形成、虹膜新血管形成、小梁新血管形成。一实施例中，治疗或预防脉络膜新血管形成伴黄斑变性是特别考虑的。
一种治疗或预防与胞外基质产生或沉积相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物；还提供治疗或预防与炎症相关的眼病理过程的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
一实施例中，本发明考虑治疗或预防与细胞增生相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。各种实施例中，所述细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星状细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。
另一实施例中，提供治疗或预防与细胞迁移相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象提供能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。某些实施例中，所述细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星形细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。另一方面，本发明提供治疗或预防与眼细胞迁移改变、趋化、增生和粘附相关的眼科疾病的方法。
一种治疗或预防与眼膜形成或改变相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予受试者特别考虑的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。各种方面，所述眼膜选自表视网膜、视网膜下膜、玻璃体膜、细胞性膜、脉络膜新生血管膜和纤维膜。
某些实施例中，给予治疗或预防眼科疾病的方法在手术之前、手术时或接近手术时，以治疗或预防可能与手术相关而发生的眼科疾病。各种方面，所述手术选自屈光纠正手术、放射状角膜切开术、LASIK、视网膜剥脱治疗术、角膜移植术、青光眼渗滤术、白内障摘除术、晶状体置换术、玻璃体切除术、视网膜下手术和视网膜易位术。
本发明提供一种维持或改进受试者视力的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
特别考虑诊断眼科疾病的方法。一实施例中，本发明提供一种诊断与CTGF相关的眼科疾病的方法，所述方法包括获得受试者的样品；测定所述样品中CTGF或其片段的水平；将所述样品的CTGF或其片段的水平与标准水平相比较，若所述样品的CTGF或其片段的量升高，表明存在眼科疾病；本发明提供一种鉴定发生与CTGF相关的眼科疾病易感性的方法，所述方法包括获得受试者的样品；测定所述样品中CTGF或其片段的水平；将所述样品的CTGF或其片段的水平与标准水平相比较，若所述样品的CTGF或其片段的量升高，表明存在发生眼科疾病的易感性。
本发明还提供用于诊断与CTGF相关的眼科疾病的试剂盒，所述试剂盒包括检测样品中CTGF水平的工具。一方面，所述试剂盒或用于诊断与CTGF相关的眼眼科疾病。另一方面，所述试剂盒或用于鉴定发生与CTGF相关的眼科疾病易感性。一优选实施例中，本发明的诊断试剂盒可用于诊断眼纤维变性。另一优选实施例中，本发明的诊断试剂盒可用于鉴定发生眼纤维变性的易感性。
本发明也提供可用于抑制或预防眼病理过程药物的鉴定方法。
一实施例中，本发明提供可用于抑制或预防与CTGF相关的眼病理过程药物的鉴定方法，所述方法包括使候选药物与CTGF或其片段接触；测定样品中CTGF或其片段的表达或活性水平；和将所述样品中CTGF或其片段的表达或活性水平与标准的CTGF或其片段的表达或活性水平相比较，若所述样品中CTGF或其片段的表达或活性降低，表明此药物能治疗或预防与CTGF相关的眼科疾病。
本发明提供治疗或预防黄斑变性的方法。本发明所述任一方法可用于治疗或预防任何类型的黄斑变性，包括老年黄斑变性.、干性黄斑变性也称为非渗出性黄斑变性、退化性、萎缩性黄斑变性，严重时为局限性萎缩；湿性黄斑变性也称为渗出性黄斑变性、新生血管或盘状黄斑变性。一优选实施例中，本发明提供治疗或预防与黄斑变性相关的脉络膜新血管形成。另一实施例中，本发明提供治疗或预防糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病和非增生性糖尿病性视网膜病的方法。一优选实施例中，本发明提供治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变的方法。一方面，本发明提供治疗或预防视网膜剥脱的方法。另一方面，本发明提供治疗或预防青光眼的方法。还有一方面，本发明提供治疗或预防白内障的方法。一实施例中，本发明提供治疗或预防角膜瘢疤形成的方法。另一实施例中，本发明提供治疗或预防角膜浑浊的方法。
本领域技术人员在阅读了本文公开内容后不难明白这些和其它实施方式，所有这些实施方式都是专门考虑的附图简要说明

图1A和1B分别显示在视网膜色素上皮细胞和脉络膜内皮细胞中表达的结缔组织生长因子mRNA。
图2A和2B分别显示在视网膜色素上皮细胞用转化生长因子-β或血管内皮细胞生长因子处理后结缔组织生长因子的表达。
图3A和3B分别显示在脉络膜内皮细胞用转化生长因子-β或血管内皮细胞生长因子处理后结缔组织生长因子的表达。
图4A和4B显示结缔组织生长因子对视网膜色素上皮细胞和脉络膜内皮细胞附着于纤连蛋白的作用。
图5A和5B显示结缔组织生长因子对视网膜色素上皮细胞和脉络膜内皮细胞趋化迁移的作用。
图6A和6B显示结缔组织生长因子及其N端片段对视网膜色素上皮细胞迁移的剂量依赖性刺激。
图7A和7B显示结缔组织生长因子刺激N端片段对视网膜色素上皮细胞增生的剂量依赖性刺激。
图8A和8B显示结缔组织生长因子刺激脉络膜内皮细胞管道的形成。
图9显示用转化生产因子β处理的视网膜色素上皮细胞中，含额外结构域A的纤连蛋白刺激结缔组织生长因子的表达。
图10显示用视网膜色素上皮细胞中，纤连蛋白刺激结缔组织生长因子的表达。
图11显示抗α5β1整合素抑制视网膜色素上皮细胞中，纤连蛋白诱导的结缔组织生长因子的表达。
图12显示人增生性玻璃体视网膜病理性膜中结缔组织生长因子的表达。
图13A、13B、13C和13D显示老年性黄斑变性患者的人脉络膜新生血管膜中结缔组织生长因子的表达。
图14显示从增生性玻璃体视网膜病变患者取出的玻璃体液中的结缔组织生长因子及其片段。
图15显示从脉络膜新血管形成和视网膜新血管形成患者手术取出玻璃体液中的结缔组织生长因子及其片段。
图16A和16B显示结缔组织生长因子诱导的增生性玻璃体视网膜病变实验模型中的纤维增生。
图17显示增生性玻璃体视网膜病变各种实验模型家兔玻璃体液中的结缔组织生长因子表达。
发明详述首先，应理解本文所描述的本发明蛋白质、核酸序列和方法不是限于本发明于具体描述的方法学、方案、细胞系载体和试剂，因为这些都可以改变。也应理解本文所用的专门术语目的是描述具体的实施例，不意味着限制本发明的范围，此范围只受权利要求书的限制。
必须注意，本文和权利要求书中所用的单数形式的单词包括复数，除非另有说明。例如“一个宿主细胞”包括宿主细胞复数，“抗体”指一种或多种抗体及本领域技术人员已知的等价物等等。
除非另有规定，本文所用所有技术和科学专业词汇具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然可采用类似于或等价于本文所述的方法和材料来实施或检验本发明，但现在所述的方法、装置和材料是优选的。纳入本文参考文献的本文中提到的所有出版物，目的是描述这些出版物中报告的可用于本发明的细胞系、载体和方法。本文中没有什么可解释为允许本发明有权将本发明内容说成比先前发明所公开内容更早。本文引用的各参考文献其整体内容纳入本文作为参考。
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药物学的常规方法，这是本领域技术范围之内。文献中有这些技术的全面阐述。见例如Gennaro，A.R.编Reminton’s Phannaceutical Sciences，第18版，1990，MackPublishing Co；Colowick等，Methods in Enzymology.Academic Press INC.；Handbook of Experimental Immunology，I-IV卷，(D M.Weir和C C.blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publication)；Maniatis等，1989 MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，I-III卷，Cold Spring Harlor LaboratoryPress；Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，JohnWiley & Sons；Ream等编，1998，Molecular Biology TechinquesAa IntensiveLaboratory Course Acadenic Press，PCR(Introduction to BiotechniquesSeries)，第二版，(Newton & Graham编，1997，Springer Verlag)。
术语“眼病”或“眼科疾病”用于指任何偏离正常的状况。具体说，术语“眼病”或“眼科疾病”指眼睛的任何不正常情况。眼科疾病可由于影响到眼睛的任何急性或慢性疾病或事件所引起，包括损伤、创伤、疾病、外科手术等。眼科疾病可能与各种眼内结构相关，例如视网膜、黄斑、玻璃体液、房水、晶状体、角膜、巩膜、脉络膜、睫状体、虹膜、视盘、乳头、视网膜中央凹或眼睛的其它部分。此外，眼科疾病可能与各种眼细胞有关，如RPE细胞、视网膜和脉络膜内皮细胞、小梁网细胞、成纤维细胞、角膜成纤维细胞、胶质细胞、米勒细胞、上皮细胞如晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞等。
眼科疾患或疾病可能与一种或多种不同的眼病理过程有关，例如，新血管形成、细胞增生、细胞迁移、炎症、胞外基质产生和沉积(如纤维增生)等。眼科疾病的例子包括例如增生性玻璃体视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病，增生性糖尿病性视网膜病，糖尿病黄斑水肿、干性黄斑变性、湿性黄斑变性、老年性黄斑变性与黄斑变性相关的色素上皮剥脱，Stargardt病(青少年黄斑变性)、青光眼包括原发性开放角和继发性青光眼、新生血管青光眼与增生性糖尿病性视网膜病，与青光眼渗滤手术相关的伤口愈合，特发性前视网膜纤维增生，视网膜下纤维增生，葡萄膜疾病例如葡萄膜炎综合征和葡萄膜炎症，眼眶特发性巩膜炎症，涉及眼眶的多病灶纤维硬化，具有眼病症状的疤痕性类天疱疮、系统性红斑和中心浆液性脉络膜视网膜病变，具有原发性玻璃体增生的眼膜疾病，伏格特一小柳一原田综合症，黄斑水肿，视网膜剥脱和相关并发症，包括视网膜剥离手术，白内障黄斑穿孔视网膜撕裂，急性视网膜坏死综合症，脉络膜视网膜创伤性病变，普尔夏视网膜病变(挫伤)、视网膜水肿、角膜上皮受伤、角膜瘢疤形成形成、角膜浑浊并发的激光辅助原位屈光性角膜性移植术(LASIK)、斯耶格伦综合症、角膜新血管形成、虹膜新血管形成，脉络膜新血管形成，玻璃体新血管形成、眼内新血管形成、眼睛炎症、视网膜变性、视网膜局部缺血、玻璃体视网膜疾病，未知病因的眼纤维变性，镰状细胞视网膜病变，早熟性视网膜病变，视网膜剥脱，眼局部缺血，眼创伤和放射致视网膜病变。
本文“纤维增生”广义指胞外基质蛋白的过度产生和沉积。纤维增生包括纤维组织的异常病理过程或纤维瘤或纤维样变性，纤维增生是各种损伤或疾病的结果，通常涉及胞外基质成分的异常产生积累或沉积，包括例如胶原蛋白和纤连蛋白的过度产生和沉积增加。术语“眼纤维变性”指影响到眼睛或其某些部分的纤维增生。
“眼细胞是与眼睛的内部或外部结构有关的细胞”包括内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星形细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞、双极性细胞等。
“结缔组织生长因子”或“CTGF”指任何动物种类，优选哺乳动物包括大鼠、家兔、牛、羊、猪、小鼠和马，最优选人类的CTGF和任何来源不论是天然的、合成的、半合成的或重组的CTGF。先已报道和描述了结缔组织生长因子(见例如，美国专利5,408,040；Bradham等，J Cell Biology 114.1285-1294，1991)。一方面内容中，“结缔组织生长因子”或“CTGF”指含有CTGF的N-末端片段至少一部分的多肽序列。另一方面，“结缔组织生长因子”或“CTGF”指含有CTGF的C-末端片段至少一部分的多肽序列。术语“N-末端片段”参见CTGF，指含有CTGF多肽羧基末端部分或其变体或其片段的序列(见例如国际专利出版物WO 00/35939，国际专利出版物WO 00/35936，和美国专利申请10/245,977)。
短语“CTGF相关性眼科疾病”本文用来指与CTGF或其片段的异常或不适当表达或活性相关的眼科病况和疾病。此术语特别指与眼细胞增生、眼细胞迁移、眼内胞外基质产生和沉积相关的疾病和病况，包括眼纤维增生和疤痕形成，与眼睛炎症相关的病症和眼血管生成和血管再生。
增生性病理过程是本文所指的疾病，包括特征为连续性细胞增殖导致组织中细胞群过度产生的病理状态。所述细胞群不一定是转化的致瘤性或恶性细胞，但也可包括正常细胞，例如CGTF可通过诱导视网膜各种细胞，如视网膜色素上皮细胞的增殖反应，或通过刺激新血管形成而参与病理过程。
术语“血管生成”和“血管再生”指新的或现有的毛细血管或血管的形成或生长。
术语“激动剂”用于CTGF时指能提高或延长某具体分子如CTGF或其片段的生物或免疫学活性的程度，或作用时间的一类分子。激动剂可包括能增强CTGF或其片段效能的蛋白、核酸、碳水化合物，抗体小分子或其它分子。
术语“拮抗剂”用于CTGF时，指能降低某具体分子如CTGF或其片段的生物或免疫学活性的程度或作用时间的一类分子。拮抗剂可包括能降低CTGF或其片段效能的蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体、小分子或其它分子。
术语“抗体”指获自任何来源的免疫球蛋白或抗体，单克隆或多克隆抗体，这类来源包括细胞系或动物如小鼠、大鼠、家兔、鸡、火鸡、羊、马、人等。抗体也可获自遗传修饰的细胞或经工程改造能制造对宿主而言是非内源性抗体的转基因植物或动物。抗体可以是同种型包括如IgA、IgD、IgE、IgG-2、IgG-3、IgG-4和IgM等。本文用的抗体包括完全抗体及其片段，如Fab、F(ab)2和FV片段(它们能结合表位决定簇)，嵌合抗体如二价和三价抗体(能结合一种或多种独特抗原)。
术语“反义”指一种组合物，其含有的核酸序列与某特定核酸序列的“有效”链互补。反义分子可用该领域已有方法包括合成或转录方法产生。一旦将该互补分子导入细胞，其就能与该细胞产生的天然序列结合形成双链体，而阻断相应的天然序列转录或翻译。
“氨基酸序列”或“多肽”这些术语本文用于指寡肽、多肽或蛋白质序列及其片段，天然产生或合成的分子。多肽或氨基酸片段是某多肽保留了其至少一种结构和/或功能特性的部分。CTGF片段包括了其至少一种结构或功能特性的CTGF多肽序列的一部分。“氨基酸序列”指天然产生的蛋白质分子的多肽序列，“氨基酸序列”等术语不意味着限制该氨基酸序列与相关蛋白质分子为完全天然序列。
术语“核酸”或“多肽苷酸”指寡核苷酸、核苷酸序列多核苷酸或其片段，指天然来源的或合成的DNA或RNA，可以是单链或双链，可以是有义或反义链，指肽核酸(PNA)或指DNA样或RNA样物质、天然来源或合成的。多核苷酸片段是保留了某多核苷酸至少一种结构或功能特性的该多核苷酸序列的一部分。多核苷酸片段长度可以不同。例如长度多于60个多核苷酸，至少长100个核苷酸，至少长1000个核苷酸，或至少长100000个核苷酸。
“改变的”多核苷酸包括含有缺失、插入或不同核苷酸取代但该多核苷酸仍可编码相同的或功能上相同的多肽的那些多核苷酸，此定义中包括显示多态性，用具体寡核苷酸探针可能或可能不易检测的序列，或通过不适当的缺失或与等位基因来预计到的杂交而含有对象多核苷酸序列正常染色体基因座以外的一基因座的序列。
“改变的”多肽可含有能产生沉默性改变导致功能上相等的多肽的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性或/或两性上的相似程度进行精心安排的氨基酸取代，只要能保留所编码多肽的生物和免疫学活性。例如阴电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，阳电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，具有相似疏水性值的不带电极性头部基因的氨基酸，包括亮、异亮和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
多肽或氨基酸“变体”是某具体氨基酸序列中一个或多个氨基酸已改变的氨基酸序列。多肽变体可含有保守性改变，其中取代的氨基酸具有与被取代氨基酸相类似的结构或化学性能，如亮氨酸取代异常氨酸。变体也可含有非保守性改变，其中取代氨基酸的物理性能与被取代氨基酸的不相同，如甘氨酸取代色氨酸。同类性微小变体也可包含氨基酸缺失或插入或二者。优选氨基酸变化保留某具体多肽的某些结构和功能特性。可找到确定那些氨基酸残基可被取代、插入或缺失的指南，例如采用该领域熟知的计算机程序，如LASER GENE软件(DNASTAR Inc.，Madion WI)。
多核苷酸变体是某特定多核苷酸序列的变体，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的多核苷酸序列与该特定多核苷酸序列相同。本领域技术人员懂得作为遗传密码子的简并性，可以产生编码某特定蛋白质的多个变体多核苷酸序列，某些与已知的天然产生基因的多核苷酸具有同源性。因此，本发明认为，根据可能的密码子选择，通过选择性组合可产生各种可能的多核苷酸序列的变体。可按照标准的密码子三遗传码进行这些组合，认为所有这些变体都已具体公开了。
“缺失”是氨基酸或核苷酸序列中除去一个或多个氨基酸残基或核苷酸导致的变化。
术语“插入”或“加入”指多肽或多核苷酸序列中，与天然产生的分子相比分别加入了一个或多个氨基酸残基或核苷酸导致的变化。
术语“功能等价物”本文用于指具有某特定多肽或多核苷酸至少一个功能或结构特征的多肽或多核苷酸。功能等价物可含有执行某特定功能的修饰。术语“功能等价物”包括某分子的片段、突变体、杂交体、变体、同源体或化学衍生物。
术语“样品”本文中作广义应用，样品可取自任何来源，例如体液、分泌物、组织、细胞或培养的细胞，包括但不限于玻璃体液，房水、眼泪、唾液、血液、尿、血清、血浆、滑液、胶脊液、羊水和器官组织(如活检组织)、染色体、细胞器或从细胞分离的其它膜，基因组DNA、CDNA、RNA、mRNA等和排泄的细胞或组织，或这些细胞或组织的印迹或痕迹。样品可取自任何来源，如细胞、病人、非人哺乳动物对象等，也考虑从患病动物模型中取得样品。样品可以是液体，或者例如可固定于或结合于某底物。样品可提供适合于检测是否存在CTGF及其片段，或提供适合于筛选能结合CTGF及其片段的物质。获得样品的方法在本领域技术水平之内。
术语“胞外基质”或“胞外基质蛋白”本文用于广义的非细胞性基质，通常包括蛋白质、糖蛋白、复杂的碳水化合物和其它巨分子。胞外基质蛋白包括，例如胶原蛋白如I型和IV型胶原蛋白，纤维蛋白、层连蛋白和血小板。
术语“微阵列”指在某基底上核酸、氨基酸，抗体等分子的排列。此基底可以是任何合适的载体，如珠、玻璃、纸、硝酸纤维等、尼龙和合适的膜等，基底可以是坚硬的或半坚硬的载体，包括但不限于膜、滤膜、晶片、芯片、玻片、纤维、珠(包括磁珠或非磁珠)凝胶，管板、聚合物、微粒、毛细管等。该基底可提供包被表面和/或具有各种类型表面，如井孔、钉、沟、通道和孔洞，可供核酸，氨基酸等结合。
术语“增生性玻璃体视网膜病变”或“PVR”指各种眼内病理变化，包括表视网膜，视网膜下区等的病理变化，视网膜剥脱伴星状折叠、玻璃体牵拉、动脉环牵拉等。PVR还包括与视网膜剥脱程度相关的眼细胞增生。

发明内容
本发明涉及抑制或预防与细胞增生，细胞迁移、新血管形成、炎症、纤维增生等相关的眼病理过程的方法，还提供预防和治疗眼科疾病的方法。
急性或慢性疾病或事件，例如损伤、创伤、疾病、手术等与一种或多种眼病理过程的发生和发展相关联，可导致眼内各种结构性、病理性、生理性和细胞性变化。这些病理过程包括例如基底膜基质组分的改变；可导致纤维增生生和疤痕形成的胞外基质产生增加和沉积；新血管形成；毛细血管通透性增加；眼细胞增生、眼细胞增殖、眼细胞迁移；眼膜如细胞膜、纤维膜、视网膜下区膜，表视网膜、玻璃体膜、脉络膜新生血管膜的产生等。
这些眼病理过程与许多眼科疾病相关，并可经常彼此相关连地发生。多种眼病理过程之间的相关性例如在PVR中得到证实。PVR中，RPE细胞增生和PRE细胞迁移与玻璃体内形成细胞和纤维性膜(玻璃体膜)，或视网膜内表面或外表面上形成细胞纤维性膜(表视网膜)相关联。糖尿病性视网膜病与视网膜内部血管损伤或改变相关，导致出血和肿胀，液体漏入视网膜，在视网膜表面生出新血管并长入玻璃体内。CNV与脉络膜上此细胞粘附，迁移和增殖的增加，胞外基质过量产生与其说视网膜下纤维血管膜的产生相关联。因此可理解，各种眼病理过程相互关联，从而提供了对于影响眼睛的各种疾病的共同治疗途径。抑制和预防这些病理过程及治疗和预防相关眼科疾病的有效方法可获得广泛应用。
本发明涉及到以下发现，即CTGF是各种眼病理过程的诱导产生和发展的中心因素。本发明还证明CTGF的表达和活性，总体上与眼科疾病的发作和程序相关联，特别是与上述病理过程有关的疾病相关联。
眼病理过程和眼科疾病中的CTGFCTGF参与了眼病理过程和眼科疾病本发明证明各种眼病理过程中和相关眼科疾病中CTGF的表达增加，例如，诊断为某些眼病的病人玻璃体中，和眼病动物模型中CTGF表达升高(见实施例14、15和22)。取自患有常见与伤口愈合有关眼病理过程，如新血管形成和纤维增生病人的玻璃体样品中CTGF水平最高(见实施例14和15)。在获自视网膜剥脱无PVR、视网膜剥脱加PVR、表视网膜、黄斑孔洞、CNV视网膜血管再生、增生性糖尿病性视网膜病和相关黄斑变性病人的玻璃体中发现CTGF表达升高。(见实施例14)此外，本发明发现获自患眼科疾病，如PVR、糖尿病性视网膜病和CNV(包括伴黄斑变性的CNV)个体的眼组织中CTGF表达升高。例如免疫组化资料显示视网膜剥脱患者手术切除的PVR膜中有CTGF表达(见实施例12)。观察到临床诊断为老年性黄斑变性患者的CNV膜CTGF表达升高(见实施例13)。分离的CNV膜中CTGF主要位于新生血管膜以及细胞周围的血管中。因此，CTGF与新血管形成，眼纤维增生和眼膜形成相关联。
本发明还证明各种眼细胞，包括RPE细胞、CEC和视网膜米勒细胞中有CTGF表达，本发明证明各种眼细胞的CTGF表达受到与各种眼病和眼病理过程相关的不同生长因子和胞外基质组分的差异性调节。具体说，TGFβ刺激RPE细胞中的CTGF表达，VEGF刺激CEC细胞中的CTGF表达(见实施例2)。纤连蛋白，一种与眼细胞迁移和增生相关的胞外基质组分，刺激RPE细胞中的CTGF表达(见实施例10)。
CTGF诱导了眼纤维变性本发明提供了第一次证明CTGF诱导了眼纤维变性(胞外基质产生和沉积增加)。本发明人发现在验证的眼病动物模型中CTGF诱导了病理性体内眼纤维增生，玻璃体中加入CTGF刺激了眼纤维增生的产生和发展(见实施例13和19)。CTGF诱导了眼纤维增生与表视网膜RPE膜转化成少细胞性成肌纤维细胞性和致密的纤维性表视网膜。将CTGF注射入患轻度PVR的家兔玻璃体内导致形成致密的纤维性膜并产生和发展眼纤维增生(见实施例17和19)。另外本发明人显示，CTGF诱导RPE细胞中纤连蛋白(一种胞外基质组分)表达刺激了胞外基质的产生(见实施例9)。这些结果直接证明CTGF诱导了眼纤维变性，因此，CTGF提供了抑制眼内纤维性病理过程(即眼纤维增生)发生发展和治疗相关眼科疾病的靶标。
本发明证明刺激了眼细胞中眼纤维增生特征的胞外基质产生。具体说本发明人证明了CTGF诱导了RPE细胞中的纤连蛋白表达(见实施例9)。
CTGF诱导眼血管生成和新血管形成本发明人也提供了证据显示CTGF诱导眼血管生成和眼新血管形成。新血管形成与各种眼科疾病和眼病理过程，包括例如眼膜的发生发展、增生性新血管形成和脉络膜新血管形成相关联。
采用内皮细胞发生增殖、迁移和分化的体外管道形成试验，本发明人证明，单层培养的CEC显示在对CTGF的反应中提高了管道形成能力，因此确定CTGF参与了眼血管生成和新血管形成。(见实施例18)。
另外的发现显示CTGF主要定位于新生血管膜以及CNV相关的细胞周围血管中(见实施例13)。本发明人因而能够确定CTGF参与了眼血管生成和新血管形成及新血管膜的形成。
CTGF刺激眼细胞增生和移行在许多眼科疾病中，眼细胞增生和移行与各种眼病理过程的发生发展相关，并与眼科疾病相关。本发明证明CTGF刺激了参与眼病理过程如细胞增殖，细胞迁移、新血管形成物和纤维增生的关键性眼细胞的增生和移行。例如，CTGF刺激了RPE细胞增殖(见实施例7)。此外，CTGF刺激了RPE细胞、CEC细胞和视网膜米勒细胞的移行(见实施例6和11)抑制预防眼病理过程和眼科疾病的方法本发明涉及抑制或预防眼病理过程的方法。还提供用于治疗或预防眼科疾病的方法和药物，诊断眼科疾病的方法和相关试剂盒，筛选用于该项方法的试剂的方法。
一实施例中，本发明提供抑制或预防对象中与CTGF相关的眼病理过程的方法，所述方法包括给予能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。这些方法可可用于体内或体外。在不同的实施例中，所述对象是细胞、动物，优选哺乳动物，最优选人。
一方面，所述药物选自抗体，反义寡核苷酸和小分子。另一方面内容是将所述药物输送给患病眼睛，特别考虑将所述药物输送给眼表面的方法。一优选方面，将所述药物以滴眼剂型输送。另一方面，所述药物以油膏输送。
优选实施例中，所述眼病理过程还与眼细胞相关。某些实施例中，所述眼细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星形细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。
另一实施例中，所述眼病理过程还与眼球结构相关，在不同实施例中，本发明提供的眼球结构选自视网膜、视网膜色素上皮层、脉络膜、黄斑、角膜、晶状体、虹膜、巩膜、小梁网、房水腔、玻璃体、睫状体、视盘、乳头和视网膜中央凹。
抑制或预防CTGF相关的眼病理过程的方法，包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性(其与眼科疾病的眼病理过程相关)的药物，这是特别要考虑的。特别考虑将本发明方法用于任何CTGF相关性眼科疾病。具体实施例中，所述眼科疾病选自青光眼、白内障、脉络膜新血管形成，视网膜剥脱，增生性玻璃体视网膜病变、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜瘢疤形成形成和角膜浑浊。优选实施例中，所述眼病理过程还与眼纤维变性相关。
一种抑制或预防眼细胞外基质产生或沉积的方法，包括给予对象本文专门提供的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。抑制或预防眼疤痕形成的方法，包括给予对象专门提供的能降低CTGF或其表达或活性的药物。一实施例中，本发明提供抑制和预防眼内新血管形成的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。其它实施例中，所述新血管形成是视网膜新血管形成，脉络膜新血管形成、虹膜新血管形成、小梁新血管形成。抑制或预防眼睛炎症的方法规，包括给予对象本发明提供的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
本发明还考虑抑制或预防眼细胞增生的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。不同实施例中，所述眼细胞增生选自上皮细胞增生、内皮细胞增生、视网膜色素上皮细胞增生和脉络膜内皮细胞增生。
一方面，本发明提供抑制或预防眼细胞迁移的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。具体实施例中，所述眼细胞迁移选自上皮细胞迁移、、视网膜色素上皮细胞迁移、内皮细胞迁移和脉络膜内皮细胞迁移。
本发明还提供抑制或预防对象中，CTGF相关眼科病理过程的方法，所述方法包括给予能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物，其中所述眼病理过程还与手术有关。不同方面，所述眼科手术选自屈光纠正手术、放射状角膜切开术、LASIK、视网膜剥脱治疗术、角膜移植术、青光眼渗滤术、白内障摘除术、晶状体置换术、玻璃体切除术、视网膜下手术和视网膜易位术。
治疗或预防眼病理过程和眼科疾病的方法本发明具体提供治疗或预防眼病理过程的方法。一实施例中，本发明提供治疗或预防眼科病理过程的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。另一实施例中，，提供治疗或预防眼纤维变性的方法，所述方法包括给予对象特别考虑的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
一方面，本发明提供治疗或预防与新血管增生相关的眼内疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。不同方面，所述新血管形成选自视网膜新血管形成，脉络膜新血管形成、虹膜新血管形成、小梁新血管形成。一实施例中，治疗或预防脉络膜新血管形成伴黄斑变性是特别考虑的。
一种治疗或预防与胞外基质产生或沉积相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物；还提供治疗或预防与炎症相关的眼病理过程的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
一实施例中，本发明考虑治疗或预防与细胞增生相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。各种实施例中，所述细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星形细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。
另一实施例中，提供治疗或预防与细胞迁移相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予对象提供能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。某些实施例中，所述细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星状细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。另一方面，本发明提供治疗或预防与眼内细节移行改变、趋化、增生和粘附相关的眼科疾病的方法。
一种治疗或预防与眼膜形成或改变相关的眼科疾病的方法，所述方法包括给予受试者特别考虑的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。各种方面，所述眼膜选自表视网膜、视网膜下膜、玻璃体膜、细胞性膜、脉络膜新生血管膜和纤维膜。一具体实施例中，本发明提供维持或改进对象视力的方法，所述方法包括给予对象有效量的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
某些实施例中，给予治疗或预防眼科疾病的方法在手术之前、手术时或接近手术时，以治疗或预防可能与手术相关而发生的眼科疾病。各种方面，所述手术选自屈光纠正手术、放射状角膜切开术、LASIK、视网膜剥脱治疗术、角膜移植术、青光眼渗滤术、白内障摘除术、晶状体置换术、玻璃体切除术、视网膜下手术和视网膜易位术。
本发明提供治疗或预防黄斑变性的方法。本发明所述任一方法可用于治疗或预防任何类型的黄斑变性，包括老年黄斑变性.、干性黄斑变性也称为非渗出性黄斑变性、退化性、萎缩性黄斑变性，严重时为局限性萎缩；湿性黄斑变性也称为渗出性黄斑变性、新生血管或盘状黄斑变性。一优选实施例中，本发明提供治疗或预防与黄斑变性相关的脉络彩色电视机新血管形成。另一实施例中，本发明提供治疗或预防糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病和非增生性糖尿病性视网膜病的方法。一优选实施例中，本发明提供治疗或预防增生性玻璃体视网膜病变的方法。一方面，本发明提供治疗或预防视网膜剥脱和方法。另一方面，本发明提供治疗或预防青光眼的方法。还有一方面，本发明提供治疗或预防白内障的方法。一实施例中，本发明提供治疗或预防角膜瘢疤形成的方法。另一实施例中，本发明提供治疗或预防角膜浑浊的方法。
本发明提供一种维持或改进受试者视力的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
诊断方法特别考虑了诊断眼科疾病的方法。一实施例中，本发明提供诊断与CTGF或其片段有关的眼科疾病的方法，所述方法包括获得对象的样品，检测样品中CTGF或其片段的水平，将样品中CTGF或其片段水平与标准水平相比较，样品中CTGF或其片段的量升高表明存在眼科疾病。另一实施例中，本发明提供鉴定产生与CTGF相关的眼科疾病易感性的方法，所述方法包括获得对象的样品，检测样品中CTGF或其片段的水平，将样品中CTGF或其片段水平与标准水平相比较，若样品中CTGF或其片段的量升高表明有发生眼科疾病的易感性。
本发明还提供用于诊断与CTGF相关的眼科疾病的诊断试剂盒。本发明的诊断试剂盒包括检测样品中CTGF水平的试剂和测定样品中CTGF水平的工具。一方面，该诊断试剂盒可用于诊断与CTGF相关的眼科疾病。另一方面，所述试剂盒可用于鉴定发生与CTGF相关的眼科疾病的易感性。优选实施例中，本发明的试剂盒用于诊断眼纤维变性。另一优选实施例中，本发明的试剂盒用于鉴定发生眼纤维变性的易感性。
本发明另一方面提供诊断眼科疾病，如PVR、糖尿病性视网膜病、黄斑变性，或与CTGF或其片段的表达或活性相关的眼科疾病的方法。
一优选方法中，通过测定对象样品中CTGF或其片段的水平进行眼科疾病的诊断。一实施例中，所述对象是人。另一实施例中，所述方法包括测定组织活检样品中CTGF或其片段的水平，并将此水平与正常组织或样品，即无CTGF相关眼病对象的活检样品中CTGF或其片段的水平相比较。前一样品中CTGF或其片段的水平升高表明有所述病理状况。(见2002年9月18提交的美国专利申请10/245,977，纳入本文参考文献)更通常，或通过免疫试验，如采用抗体检测蛋白质标记的存在的ELISA、RIA、或其它试验.，来检测CTGF或其片段。优选项ELISA和RIA，可采用例如本发明的多克隆或单克抗体来检测CTGF或其片段的水平。通过免疫试验检测第一标准样品中CTGF或其片段的水平，并与第二样品中CTGF或其片段的水平比较，该第二样品获自己知患难与共有CTGF相关眼病的病人，或已知不患CTGF相关眼病的病人，以确定此病的存或发展。
在本发明的诊断方法中，宜建立CTGF或其片段的表达或活性的正常或标准值，以提供诊断CTGF相关眼病或CTGF相关眼病易感性存在的基础。本发明一方法中，这可通过在适合复合物形成的条件下混合得自正常对象的体液(如玻璃体房水)、活检组织、或细胞抽提物与抗CTGF或其片段的抗体来实现。这些条件是本领域熟知的。将正常样品中抗体-靶复合物水平与阳性对照(其中已知量的抗体与已知浓度有纯化CTGF或其片段混合)的系列稀释液作比较，可测定标准复合物形成的量。例如，在一具体实施例中，可将正常样品获得的标准值与怀疑患有CTGF相关眼病，或怀疑具有发生CTGF相关眼病易感性对象的获得的值作比较。标准值和对象值之间的差别表明对该病存在易感性。本发明的诊断方法还涉及检测对眼科疾病如PVR、糖尿病性视网膜病或黄斑变性等的易感性或倾向性。
本发明提供诊断样品，具体是液体样品或组织活检样品中CTGF或其片段的试剂盒。一具体实施例中，所述试剂盒包括结合于一载体的CTGF或其片段的特异性单克隆或多克隆抗体，和CTGF或其片段不同表位的酶标记的特异性第二单克隆或多克隆抗体。所述试剂盒还包括检测酶标单克隆或多克隆抗体的试剂。所述试剂盒采用免疫学方法测定样品中CTGF或其片段，而检测和诊断眼科疾病，具体是CTGF相关的眼科疾病。另一实施例中，所述试剂盒包括放射标记的或荧光标记的抗体来代替酶标抗体。
一实施例中，本发明的诊断试剂盒包括采用免疫组化方法，用于检测组织样品中CTGF或其片段的组分。所述试剂盒可与，例如通过摄影分析或其它比较技术测定组织样品中CTGF或其片段的软件程序结合。另一实施例提供检测或测定组织样品中CTGF mRNA水平的诊断试剂盒。一实施例中，所述试剂盒包括用于逆转录CTGF mRNA为DNA的试剂。该试剂还包括扩增CTGF特异性DNA必须的试剂，包括与编码CTGF或其片段的多核苷酸互补的引物。所述试剂盒也包括用于定量样品中CTGF mRNA水平的竟争性模拟物或突变体cDNA。
一优选实施例中，本发明的诊断试剂盒经过包装的标记，例如在含有所述试剂盒必须的组分的盒子或容器中，包括所述试剂盒便用的指导和说明书。
筛选方法本发明还提供鉴定可用于抑制或预防眼病理过程的药物的方法。
一实施例中本发明提供鉴定可用于抑制或预防CTGF相关眼病理过程的方法，所述方法包括使候选药物与CTGF或其片段接触，检测样品中CTGF表达或活性水平，将样品中CTGF表达或活性水平与CTGF表达或活性的标准水平相比较。若样品中CTGF或其片段的表达和活性水平降低，表明该药物可抑制或预防CTGF相关眼病理过程。
本发明另一实施例中，提供鉴定可用于治疗或预防与CTGF相关的眼科疾病的药物的方法，所述方法包括使候选药物与CTGF或其片段接触，检测样品中CTGF表达或活性水平，将样品中CTGF表达或活性水平与CTGF表达或活性的标准水平相比较。若样品中CTGF或其片段的表达和活性水平降低，表明该药物可治疗或预防CTGF相关眼病理过程。
本发明提供筛选或鉴定可用于治疗或预防眼病理过程和相关眼科疾病药物的方法。用本发明筛选方法鉴定的化合物可给予对象以产生所需的作用，如降低CTGF或其片段的表达。或者本发明可提供鉴定能降低眼细胞，如RPE细胞、CEC细胞等中CTGF或其片段的表达或活性药物的方法。
本发明考虑筛选或鉴定有用的药物，包括可特异性识别CTGF或其片段的激动剂或拮抗剂。能结合CTGF或其片段的药物可抑制这些多肽的活性。这些药物包括抗体或其片段、小分子、多肽(合成的、天然的、酶解或重组产生的)和aptamer。本发明还考虑鉴定通过降低CTGF或其片段活性或表达用于治疗或预防眼科疾病的有用方法。
一方面，本发明的筛选试验包括使CTGF或其片段与筛选药物接触，检测CTGF的活性或表达水平，将此活性或表达水平与用本领域已知方法获得的标准水平作比较。这些方法包括，例如将CTGF或其片段结合于固相载体，无细胞制品，或天然或合成产品的混合物，设计出抗体单克隆或多克隆抗体直接或间接结合于CTGF或其片段，或与CTGF或其片段竞争结合的试验，如ELISA试验。
该领域已知其它的筛选技术，可提供高通量筛选对CTGF或其片段具有适当结合亲和力的药物，或对可用于调节、改进或抑制CTGF或其片段或活性的其它靶多肽具有适当结合亲和力的药物。例如可制备，利用载有测试化合物的微阵列，并用该领域现有方法进行分析(见国际专利出版物WO95/35502国际专利WO95251116；美国专利5,474,796；美国专利5,605,662)。
也可用其它各种筛选技术来鉴定能降低CTGF活性或表达的小分子药物，这些筛选技术可鉴定能与CTGF或其片段相互反应而可作为本发明方法中的药物和治疗剂的抗体和其它药物(见Enna等，Current Protocol in Pharmacology，1998，JohnWiler and Sons)。这些试验将提供该化合物结合蛋白质或细胞靶子有关的可检测信号。例如可通过荧光团，酶偶联物或其它该领域熟知的可检测标记来检测这种结合。可定性或定量分析这些结果。
药物制剂和给药途径本发明考虑给予能调节CTGF活性或表达的化合物或药物进行治疗的方法，例如体内给药来影响CTGF的活性。如本领域所熟知，这些药物可直接输送，或与合适的运载体或赋形剂一起以药物组合物输送。该治疗方法包括给予需要治疗的对象有效量的能抑制CTGF或其片段活性或表达的药物。优选实施例中，所述对象是哺乳动物，最优选实施例中，所述对象是人。本领域已有各种配方和药物输送系统(见Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上)。一方面，所述药物选自抗体，反义寡核苷酸和小分子药物。另一方面，将药物输送给眼睛，特别考虑将药物输送至眼表面，一优选方面，药物以滴眼剂输送，另一方面，药物以眼油膏输送。
合适的给药途径，例如可以包括口服、直肠、经粘膜、鼻内或肠内给药和肠胃道外输送，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，可以局部或全身给予药物，例如，可通过注射或靶向药物输送系统。如贮存器、导管或缓释剂，输送适当的药物。眼局部给药可包括，例如眼内、玻璃体内、视网膜下、巩膜下、结膜下、巩膜外层下或巩膜内注射或应用。也可将合适的药物直接施加于角膜或巩膜。
对于本治疗方法所用的组合物或药物，可用本领域熟知的各种技术初步估计治疗有效剂量。例如，在细胞培养试验确定的剂量，可在动物模型中改进，以获得循环浓度范围，包括IC50。当需要抑制CTGF活性或表达时，例如可测定测试药物达到CTGF活性最大半数抑制的浓度。例如利用细胞培养试验和其它动物研究获得的资料，可确定适合病人的剂量范围。某药物的治疗有效量指该药物导致治疗对象症状缓解或存活期延长的量。
可采用该领域熟知的方法产生抗CTGF或其片段的抗体。这类抗体可包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合性和单链抗体以及Fab片段，包括F(ab)2和FV片段。可通过例如Fab表达文库产生这些片段。治疗应用特别优选能抑制CTGF活性的中和抗体。
生产抗体的方法是该领域熟知的。例如，用目标多肽或其免疫源性片段或肽段注射，免疫接种不同的宿主动物，包括羊、兔、小鼠、大鼠、鸡、火鸡、人等。体内和体外产生单克隆或多克隆抗体的技术是该领域熟知的(见Pound(1998)Immunochemical Protocols Humana Press Totowa，NJ；Halow和Lone(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice第二版Academic Press；Schook(1987)Monclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker.Inc.)上述抗体还可用于鉴定样品如血液、活检组织、玻璃体、眼泪等中的CTGF或其片段或亚单位。可通过例如定量成象分析，EUSA或免疫组化技术，测定CTGF或其片段存在的量。也可通过例如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或该领域熟知的其它方法，利用活检组织的一部分检测CTGF mRNA水平。具体讲，所述方法中，可将组织样品的总mRNA，或CTGF或其片段或亚单位的特异性mRNA转录成DNA，然后用特异性引物序列作PCR扩增。可采用等体积的病人样品和一系列已知的递减浓度的模拟物或突变体cDNA片段进行竞争反应，来测定CTGF对应mRNA的量。
本发明考虑采用能与CTGF或其片段或亚单位特异性反应的抗体，来中和CTGF或其片段的生物学活性。本方法中给予的抗体可以是完整的抗体、或其抗原结合片段，例如Fab、F(ab’’)2和Fv片段，它们能结合表位决定簇。本方法中所用的抗体可以是多克隆抗体，更优选单克隆抗体，可用该领域熟知方法从含有CTGF蛋白的抗原片段制备具有不同表位特异性的单克隆抗体。(见Ausubel等，同上)本发明中，治疗应用包括采用抗CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗体。人源化抗体是具有与亲代抗体(即通常为小鼠来源)相同结合特性并增加了人特征的抗体或抗体片段。可采用例如链置换或噬菌体展示技术来获得人源化抗体。例如将含有CTGF特异性非人抗体重链或轻链可变区的多肽与人互补(轻或重)链可变区的文库组合，选出对感兴趣抗原特异的杂交对。所选杂交对中的人链可再与人互补可变区(重或轻链)文库组合，选出能特异结合该抗原的人源化抗体多肽二聚体。可用于本发明方法中产生人源化抗体的技术描述可参见，例如美国专利5,565,332；5,585,089；5,694,761和5,693,762。另外，在转基因小鼠中产生人抗体的技术描述可参见，例如美国专利5,545,806和5,569,825。
反义核酸本发明提供采用反义技术来抑制CTGF或其片段的表达和活性的治疗方法。具体是可采用能直接中止编码CTGF的DNA转录或CTGF mRNA翻译的治疗方法，来改变CTGF或其片段的表达和活性。
反义技术通过反义序列与编码靶蛋白或指导其表达的靶序列特异性结合，来调节靶蛋白质的表达。(见Agrawal，S.编，(1996)Antisense Theropeutics，HumanaPress Inc.Totawa NJ；Alama等；Pharmacol Res 36(3)L171-178，1997；Crooke(1997)，Adv，Pharmacol 401-49，1997；Lavrosky等，Biochem Mol Med 62(1)；11-22，1997)进行反义序列的输送可有各种方法，例如采用表达载体或直接给予反义寡核苷酸通过细胞内输送。
可通过采用重组表达载体，如嵌合性病毒或胶体分散系统胞内输送，反义治疗序列等。经转录产生与编码靶蛋白细胞序列至少一部分互补的序列(见Slater等，Allergy Cli Immunol 102(3)469-475，1998)。也可通过各种病毒载体，包括逆转录病毒和腺相关病毒载体来进行反义序列的输送。(Miller Bood 76271，1990Uckert和Walther，Pharacol Ther 63(3)323-347，1994)。可用于反义基因治疗的载体包括但不限于腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或优选RNA病毒如逆转录病毒。
可用于将反义序列输送给靶细胞的其它基因输送方法，包括胶质分散和脂质体系统、人造病毒包膜和该领域技术人员已有的其它系统(Rossi，Br Med Bull51(1)217-225，1995；Morris等；Nucl Acids Res25(14)2730-2736，1997；Boado等，J Pharm Sci 87(11)1308-1315，1998)。例如输送系统可采用巨分子复合体、纳米胶束、微球、珠和脂质系统，包括水泡油乳液，胶束、混合胶束和脂质体。
以下实施例更详细地说明了本发明，给出以下制备方法和实施例使本领域技术人员能更清楚了解和实施本发明。然而本发明不限于例举的实施例范围，各实施例目的是阐述本发明的一方面而已，功能等价的方法属于本发明范围内。事实上，本领域技术人员从以上描述和附图中将会明白除本文所述外的本发明的各种变化。这些变化都在本发明权利要求的范围内。
实施例实施例1.RPE细胞和CEC细胞表达CTGF mRNA如下获得人RPE细胞。从Anatomic Gift Fundation(Woodbine GA)获得人胚胎眼睛(妊娠后18-26周)。用前述方法(Jin等IOVS，414324-4332，2000)，分离人胚眼的RPE细胞。所有研究中采用传代2-4次的RPE细胞。可采用添加10％胎牛血清(Gibco/BRL，Gathersbery MD)2mM谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)的Dulbecco’s Eagles培养基(FisherScientific Pittsburgh PA)培养RPE细胞。用抗以下抗原的抗体细胞角蛋白(编号M021，Dako，Carpinteria CA)、内皮细胞抗原von Willebrand因子(编号M0616，Dako)和巨噬细胞抗原CD11c(编号M0732.Dako)，作免疫细胞化学染色，评价培养的RPE细胞的纯度。这些研究所用的RPE培养细胞根据所用的这些细胞特异性标志作免疫细胞化学染色，纯度通常为99％。
用前述方法(Hoffmann等，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 236779-784，1998)分离牛眼CEC细胞。简言之，用包被Lycopersicon esculentum(SigmaChemical Co，一种特异性内皮细胞标志)的磁珠(Dynabeads)，分离牛眼的CEC细胞。牛眼分离的CEC细胞经von Willebrand因子免疫染色阳性，以及分离的CEC细胞能结合稀释的乙酰化低密度脂蛋白(Hoffmann等，同上)，从而证实为血管内皮细胞。
用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)检测培养的人RPE细胞和牛CEC细胞中的CTGF mRNA表达。用FastTrack试剂盒(Invitrogen.San Diego CA)分离RPE和CEC细胞的多聚(A)+RNA，按厂商所述方法进行。用M-MLV逆转录酶(Gibco/BRL)和寡d(T)引物(编号C110 A，Proniega，Modison N/I)在42℃合成第一链CDNA。用人或牛CTGF的特异性寡核苷酸引物序列进行PCR，用PCR扩增RPE细胞的人CTGF序列的引物序列是5’-gcatccgtactcccaaaatc-3’(SEQ 1D NO1)和5’-cttcttcatgacctcgccgt-3’(SEQ 1D NO2)。用于PCR扩增CEC细胞的牛CTGF序列的引物序列是5’-gatcataggactgtattagtgc-3’(SEQ 1D NO3)和5’-ctgacttagagacgaacttg-3’(SEQ 1D NO4)用PeKin-Elmer/Centur DNA热循环仪，以以下条件进行CPR94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸45秒。30轮PCR后在1.2％琼脂糖凝胶上分析扩增产物，溴化乙锭染色凝胶后观察如预期那样，采用这些引物产生了210碱基对(人CTGF)和220碱基对CTGF特异性DNA扩增产物。
检测培养的RPE和CEC细胞中的CTGF mRNA。图1A和1B(右侧泳道)显示如存在的210bpT 220bp的CTGF RT-PCR扩增产物所证明，RPE和CEC细胞为CTGF mRNA表达阳性。图1A和1B(左测泳道)中显示的分子量标记为100bpDNA梯级(Gibco/BRL)。成人RPE细胞中未观察到CTGF mRNA(资料未显示)。这些结果证明参与许多眼科疾病病理过程，包括PVR和CNV的产生的RPE和CEC细胞表达CTGFmRNA。因此各种眼细胞能表达。
实施例2.RPE和CEC细胞表达CTGF多肽研究了RPE和CEC细胞的CTGF多肽表达，如实施例1所述分离得到RPE和CEC细胞，并培养在6孔组织培养板中，在无血清DMEM中饥饿培养的RPE细胞24小时。在无血清的必需基础培养基(EBM，Biowhittaker Walkersville.MD)含0.1％胎牛血清白蛋白中饥饿培养的CEC细胞24小时。用含转化因子β2(TGFβ2，1-30ng/ml)或血管内皮生长因子(VEGF，10-50ng/ml)的新鲜无血清培养基替代无血清RPE细胞培养基。用含0.1％胎牛血清白蛋白和VEGF(10-50ng/ml)或TGFβ2(1-30ng/ml)的新鲜培养基替代无血清CEC培养基。在存在生长因子时再培养二种细胞48小时。收集细胞裂解液并在Tris-HCl，10％聚丙烯酰胺凝胶(Ready Gel Bio-RodLaboratories，Hercules，CA)上电泳，将蛋白质从凝胶转移到PVDF印迹膜上(Millipore，Bedford.MA)。用Western印迹分析检查细胞裂解液中存在的CTGF。用抗CTGF多克隆抗体探测膜上的CTGF，该抗体用该领域已知的标准方法制备，然后用标准方法制备HRP-偶联羊抗兔第二抗体(Vector Laboratories Burlingame，CA)。加入ECL化学发光检测液(Amersham Pharmacia Biotech，Cleveland，OH)并暴露于Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)。
培养的RPE细胞表达了CTGF多肽。如图2A和2B中Western印迹所显示，不加TGFβ2或VEGF时，RPE细胞裂解液中未观察到可检测水平的CTGF蛋白。用含不同浓度TGFβ2(1-30ng/ml)的无血清培养液刺激RPE细胞48小时，导致其CTGF蛋白表达高于未处理对照细胞(图2A)。TGFβ2刺激RPE细胞表达CTGF为剂量依赖形式，见图2A。用浓度低于1ng/ml的TGFβ2多肽处理的RPE细胞中观察到CTGF表达增高(超过对照)。这些结果表明RPE细胞合成了CTGF多肽。RPE细胞的CTGF表达受到TGFβ2以剂量依赖方式上调。而用VEGF处理的RPE细胞中未测见CTGF表达增高(图2B)。
也发现培养的CEC细胞表达CTGF蛋白。图3A和3B的Wastern印迹显示，CEC细胞的裂解液中未见有可检测水平的CTGF蛋白。用含不同浓度VEGF(10-50ng/ml)的无血清培养液刺激CEC细胞48小时，导致其CTGF蛋白表达高于未处理对照细胞。VEGF刺激CEC细胞表达CTGF为剂量依赖形式，图3B。而用TGFβ2处理的CEC细胞中未测见CTGF表达增高(图3A)。综合在一起，这些结果证明，在许多眼科疾病(如PVR和CNV)的病理过程中具有重要作用的RPE细胞中的CTGF表达受到TGFβ2和VEGF差别性调节。
除了显示眼细胞表达了CTGF蛋白外，这些结果还证明眼细胞中CTGF的表达受到位于眼中各种生长因子和细胞因子的调节。此外，这些结果显示不同眼细胞的CTGF表达受差别性调节。具体讲，TGFβ2刺激RPE细胞中CTGF表达升高。眼中玻璃体含有高水平的TGFβ2(Limbetal Eye，5686-693，1991)。各种眼病与RPE细胞暴露于玻璃体相关。因此，TGFβ2刺激眼细胞如RPE表达CTGF，可导致各种眼科疾病的发生、发展和维持。已报道眼新生血管中VEGF表达增高(Lopez等；InvestOphthalmol Vis Sci 77855-868，1996)，因此，各种眼科疾病中当脉络膜或视网膜内皮暴露于VEGF时，VEGF表达增高显示与CTGF增高相关联。
通过ELISA分析测定培养的RPE细胞上清液中的CTGF水平。如上所述，用或不用TGFβ2(20ng/ml)处理培养的人RPE细胞48小时，收集上清液，5000rpm离心5分钟澄清。样品-70℃保持至进行ELISA试验。ELISA数据表明未处理的对照RPE细胞分泌了CTGF(9ng/ml)，TGFβ2处理的RPE细胞分泌提高水平的CTGF(47ng/ml)，综合在一起，结果表明眼细胞合成和分泌CTGF。此外，这些结果显示可定性和测定眼细胞合成的CTGF。
实施例3产生重组人CTGF如下制备重组人CTGF(rhCTGF)。从Gary Gortendrst博士(迈阿密大学医学院)获得全长人CTGF cDNA(DB60r32)(Bradham等；J Cell Biol，1141285-1294，1991)。用聚合酶链反应产生有开放读框的CTGF cDNA，所用模板为DB60R32DNA，引物如下5’-gctccgccctcagtgggatccatgaccgccgcc-3’(SEQ ID NO5)和5’-ggatccggatcctcatgccatgtctccgta-3’(SEQ ID，NO6)，其加到扩增产物任一段的BamHI限制性酶切位点(下划线)。用BamHi消化产生的扩增DNA片段，在琼脂糖凝胶上纯化，直接克隆入杆状病毒(供体)表达质粒pFastBacl(Invitrogen，Carlsbad，CA)的BamHI位点。将pFastBacl/CTGF cDNA载体构建物转入，按厂商方案见(BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统手册，Invitrogen)。产生的DNA和重组杆状病毒中，用该领域已知的标准方法进行重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞滴度的扩展(Murphy和Piwnica-Worms，Current Protocls in Molecular Biology第二卷(Ausubel等编)John Wiley & Sons Inc)。
如下表达和产生rhCTGF。在SF900II培养基(Invitrogen)中培养已适应于悬浮生长的H1GH，FIVE昆虫细胞，到细胞密度1.0×106细胞/。用含CTGF的杆状病毒以10∶1感染复数感染该细胞。
离心沉降细胞，收集含CTGF的条件培养液，以0.22μn滤膜过滤。将该条件培养液直接加到5ml Hi-Trap肝素柱(Amersham.Biosciences Corp，Piscataway，NJ)上，此柱已用50mM Tris pH7.2预先平衡。用100ml 350mM Nacl/50mM Tris pH7.2洗肝素柱。并用15倍体积的350mM-1200mM NaCl线性梯度液洗脱结合的rhCTGF。SDS-PAGE分析各组分中存在的rhCTGF。
合并含rhCTGF组分，用50mM Tris pH7.5作1∶4稀释。将rhCTGF合并液加到羧甲基(CM)，离子交换柱(POROS CM柱，PerSeptive Biosystems.Framingham.MA)上，此柱预先用10倍柱体积的50mM Tris pH7.5平衡。用350mM Nacl/50mM TrispH5.2液洗涤CM柱，再用15倍体积的350-1200mM NaCl线性梯度液洗脱结合的rhCTGF。SDS-PAGE分析各组分中存在的rhCTGF合并含rhCTGF组分，用作rhCTGF材料。
实施例4rhCTGF N端和C端片段的产生如下制备rhCTGF N端和C端片段。如上所述制备重组人CTGF并纯化，用糜蛋白酶珠(Sigma Chemical.Co.St、Louis.Mo)处理进行消化，每单位糜蛋白酶处理1.5mg rhCTGF，室温下用糜蛋白酶处理rhCTGF6小时。离心消化产物和糜蛋白酶珠，丢弃糜蛋白酶珠，用50mM Tris pH7.5液1∶5稀释含酶切割的rhCTGF的上清液。将该稀释的上清液加到Hi-Trap肝素柱上。收集的流穿液中含有rhCTGF的N端片段。用350mM NaCl洗涤肝素柱，如上所述，用350-1200mM NaCl线性梯度液洗脱结合的rhCTGF C端片段和未消化的rhCTGF。用SDS-PAGE分析各组分中存在的rhCTGF的C端片段。按观察到的C端rhCTGF纯度合并含rhCTGF的C端片段组分。
调整含rhCTGF的N端片段的肝素柱流穿液，使含0.5M硫酸铵/50mM Tris pH7.5。将含rhCTGF N端片段的样品加到15ml苯基Sepharose HP柱(AmershamPharmacia.Biotech)上，此柱预先用0.5M硫酸铵/50mM Tris pH7.5平衡。然后用15倍柱体积的0.5M硫酸铵/50mM Tris pH7.5液洗涤苯基Sepharose HP柱。用约15倍体积的0.5M-0.0M硫酸铵/50mM Tris pH7.5线性梯度液洗脱结合的rhCTGF N端片段。用SDS-PAGE分析各组分中存在的rhCTGF的N端片段。合并含rhCTGF N端片段的组分。用Amicon超滤YM10膜浓缩含rhCTGF N端片段的合并液，并将缓冲液换成50mM Tris，400mM NaCl pH7.2。
实施例5CTGF刺激RPE细胞和CEC细胞附着于纤连蛋白在介导各种眼细胞活动，包括眼细胞分化，附着、移行和增生中，胞外基质分子起着关键作用。为检验CTGF在眼细胞和眼科疾病胞外基质产生中的作用，通过以下试验研究了CTGF对RPE细胞和CEC细胞附着于纤连蛋白的作用。
如实施例1所述，分离和培养RPE细胞或CEC细胞(1×105细胞/ml)，胰酶消化从组织培养板上取得该细胞，将RPE细胞悬浮培养在含0.4％胎牛血清的细胞培养液中，使其附着于平板，加不同浓度rhCTGF(10-100ng/ml培养37℃48小时。从板上脱下RPE细胞将1×104个细胞(0.1ml)加入预先包被了纤连蛋白(50ng/ml)的96孔组织培养板()中。使细胞附着于纤连蛋白包被板37℃60分钟。用磷酸缓冲盐水土保持(PBS)轻轻洗涤板孔二次支队未附着细胞。各孔加入含20μl的5ng/mlMTT(3-(4.5-二甲 -2-b噻唑基)-2.5-二苯基-2H溴化四唑)液的新鲜培养液(150μl)37℃培养含附着细胞的板5小时，除去孔中上清液，用100μl的100％DMSO(Sigma Chemical.Co)溶解与附着细胞结合的甲(formazan)沉淀物，然后将板置于摇床上10分钟。用Dyn tech MR600微孔板读数仪测定550nm吸光值。该MTT试验提供了衡量保持粘附于纤连蛋白的包被组织培养板上细胞数量的定量分析。摇动平板后进行此试验，因而与细胞粘附于纤连蛋白的强度相关。粘附细胞的数目与所述MTT试验测定的吸光值成比例。
RPE(图4A)和CEC(图4B)细胞经rhCTGF处理后与未处理对照细胞相比，显示对纤连蛋白的粘附提高。rhCTGF对REP和CEC细胞粘附纤连蛋白的作用是剂量依赖性的，见图4A和4B。与对照细胞相比，在rhCTGF浓度为50或100ng/ml时，其处理的RPE和CEC细胞显著提高了对纤连蛋白的粘附图4A和4B中星号表示p＜0.05。这些结果表明CTGF对眼细胞中产生胞外基质的作用至少部分是通过刺激RPE和CEC细胞产生纤连蛋白所致。
实施例6CTGF刺激RPE和CEC细胞的趋化眼细胞迁移和趋化与许多眼科疾病，包括脉络膜新血管形成和PVR相关联。研究了CTGF对RPE和CEC细胞趋化的作用。为研究趋化作用，用先前报道(He等Biochem Biophys Res Commun 249253-257，1998)的Boyden小室改进试验进行了细胞迁移试验。如实施例1所述RPE和CEC细胞，培养在24孔Boyden小室板的纤连蛋白包被(50ng/ml)插片上，培养液含0.4％，胎牛血清。在试验板孔下部加入不同浓度(1-50ng/ml)的rhCTGF，测定CTGF对RPE和CEC细胞的趋化活性。培养细胞5小时后，用PBS洗涤小室插片3次，用冰冷的100％甲醇固定10分钟，苏木精反染色20分钟，用相关显微镜(320X)计数迁移的细胞数，测定每张插片随机选择4个视野中迁移的细胞数。
图5A和5B显示rhCTGF以剂量依赖方式刺激RPE和CEC细胞迁移和趋化。图5A显示加入了30或50ng/mlrhCTGF后RPE细胞的迁移明显高于对照(图5A中星号表示P＜0.01)。加入50ng/mlrhCTGF，RPE细胞的迁移程度类似于血小板衍生生长因子(PDG，20ng/ml，一种RPE细胞的强烈趋化吸引因子，作为趋化吸引因子的阻性对照)。因此rhCTGF对RPE细胞显示了强烈趋化吸引活性，刺激趋化的效果相当于已知的强烈趋化吸引因子PDGF。
如图5B所示，rhCTGF刺激CEC细胞迁移和趋化高于未处理对照细胞所见。加入10、30和50ng/mlrhCTGF后CEC细胞迁移的提高显著高于未处理对照(图5B中星号表示P＜0.05)。加入30或50ng/mlrhCTGF后刺激的CEC细胞迁移至少效果如同VEGF(10ng/ml，一种CEC细胞的强烈趋化吸引因子)。因此，rhCTGF对CEC细胞显示了强烈趋化吸引活性，刺激CEC细胞趋化的效果相当于已知的强烈的趋化吸引因子VEGF。综合在一起这些结果表明CTGF是各种眼细胞的一种强烈趋化因子。
还研究了CTGF片段对RPE细胞趋化的效果。在如上所述细胞迁移试验中测试了不同浓度的rhCTGFN端片段(10-100ng/ml)和C端片段(5-30ng/ml)。图6A显示，rhCTGF C端片段以齐整依赖方式刺激RPE细胞迁移和趋化。当加入20ng/mlrhCTGFC端片段时观察到CTGF在RPE细胞中的最大趋化作用。加入20ng/mlrhCTGF C端片段时RPE细胞迁移的程序类似于加PDGF所见。此外20ng/mlrhCTGF C端片段所见的RPE细胞趋化反应基本上相当于30ng/mlrhCTGF所见(见此实施例以上部分和图5A)崦用CTGF N端片段处理RPE细胞所见的细胞迁移只比对照略为提高(图6B)。
总之，这些结果表明，CTGF及其片段刺激了眼细胞的趋化和移行。因此，CTGF及其片段提供了抑制与各种眼科疾病相关的眼细胞迁移的新的治疗目标。
实施例7CTGF刺激RPE细胞增殖正在情况健康眼睛中，RPE细胞是静默的不增殖。然而许多眼科疾病中观察到眼细胞增殖，包括RPE细胞增殖，并与各种眼科疾病的发生发展相关联。因此如下研究了CTGF对眼细胞增殖的作用。
用3H-胸腺嘧啶摄入/掺入试验测定RPE细胞增殖，如实施例1所述RPE细胞，培养在24孔组织培养板中48小时，培养液为DMEM，含有1％胎牛血清，加有或不加不同浓度的rhCTGF(1-100ng/ml)。然后用3H-胸腺嘧啶(1μCi/孔，Amersham)脉冲标记培养的RPE细胞再培养16小时。如(He等同上)所述测定培养细胞摄入的3H-胸腺嘧啶。
图7表明rhCTGF对RPE细胞显示了有丝分裂源活性.具体说，rhCTGF处理48小时后刺激RPE细胞中3H-胸腺嘧啶，掺入的剂量依赖怀增加。rhCTGF增加浓度50和100ng/ml时刺激RPE细胞中3H-胸腺嘧啶摄入增加约20％，统计学上显著高于对照(图7中星号表示P＜0.05)。这些结果证明CTGF诱导了RPE细胞增殖。因此CTGF可刺激眼细胞增殖。
实施例8CTGF诱导CEC细胞形成管道血管生成和新血管形成到一系列复杂而高度协调的细胞活动和内皮细胞功能的变化，包括增生，移行和分化。为测试CTGF对眼内内皮细胞功能和新血管形成的作用对CEC细胞，行了以下管道形成试验。此管道形成试验是一种复杂的三维试验，检查培养中的内皮细胞形成原始脉管结构或脉管的能力。用此起彼伏试验要进成脉管内皮细胞需经历增生，移行、分化和组织成为三维结构。因此，用此试验检查了CTGF对CEC管道形成的作用。
如实施例1所述，分离牛CEC细胞，在纤连蛋白包被6孔板上培养CEC单层培养物。去除培养液用含1％胎牛血清的新鲜EGM培养液替换，将重组人CTGF(20ng/ml)加入培养物中再培养9天，用相差显微镜每日监看和拍照管道的形成。
CEC单层培养物显示对加入的rhCTGF反应中管道形成提高。如图8A所示，不加rhCTGF时CEC保持为单层培养物。图8B显示存在rhCTGF时粘附的内皮细胞变成伸长形，形成细胞间接触，并建立了管状结构的分支网络(见图8B中箭头)。这些结构类似于显示VEGF(一种已知的血管生成因子)对内皮细胞管道形成具有作用的先前报道(Murata等，Invest Ophthalmol Vis Sci 412309-2317，2000)。因此，这些结果证明了rhCTGF可诱导培养的提示CTGF可诱导眼内新血管形成，包括与各种眼科疾病相关的新血管形成。
实施例9CTGF诱导RPE细胞表达纤连蛋白额外结构域A纤连蛋白额外结构域A(EDA(+)FN)表达的增加与组织损伤，包括眼组织损伤相关联。具体讲，在获自PVR和CNV病人的组织样品中鉴定到细胞纤连蛋白的表达。为检查CTGF对眼细胞表达纤连蛋白的作用进行了以下实验。
如实施例1所述培养人胚胎RPE细胞(2-4代)细胞成为接近铺满。然后用rhCTGF(30ng/ml)、TGFβ2(30ng/ml)或这两种生长因子处理已血清饥饿为接近铺满。然后用rhCTGF培养基中培养48小时。然后，收集RPE细胞，用裂解液裂解。使得到细胞匀浆通过25G针头以去除DNA，冰上培育30分钟，4℃12000rpm离心10分钟。用FNEDA特异性单克隆抗体(克隆IST-9 Accurate Chemicals Westbury.NY)作出Western印迹分析检测样品中细胞纤连蛋白表达(EDA(+)FN同I型)。如图9所示，只加入rhCTGF结果RPE细胞中未测到EDA(+)FN表达。只加入TGFβ2结果RPE细胞中有EDA(+)FN表达。当加入CTGF和GTF32二者到培养的RPE细胞中时，观察到EDA(+)FN强表达。这些结果表明CTGF增强了TGFβ2刺激眼细胞产生胞外基质的能力。
实施例10纤连蛋白诱导RPE细胞表达CTGFPVR和视网膜或脉络膜新血管形成相关眼病中有丰富的纤连蛋白表达。为检验CTGF对眼细胞中纤连蛋白表达的作用，进行了以下实验。如实施例11所述RPE细胞，接种在预包被不同量纤连蛋白(10ng-5μg)的6孔塑料板中。24小时后用EUSA测定上清液中CTGF的表达。用Western印迹分析测定细胞匀浆的CTGF表达。图10显示如细胞匀浆的Western印迹显象密度度分析所测定那样，接种在纤连蛋白上的RPE细胞CTGF表达显剂量依赖性增加。接种在低至10ng纤连蛋白上的RPE细胞显示CTGF表达的增加高于接种在0.1％BSA上对照RPE细胞所见。纤连蛋白诱导了接种在其上的RPE细胞的匀浆液中CTGF表达高于对照80％。EUSA分析揭示这些细胞的上清液中CTGF及其N端片段水平倍增(资料未显示)。这些结果证明当RPE细胞迁移到含有纤连蛋白的各种眼内环境中时(发生于各种眼科疾病)，纤连蛋白刺激了RPE细胞表达CTGF。
平行实验中，用针对α5β2整合素(一种纤连蛋白特异性整合素)的中和抗体预处理细胞显著阻断了细胞匀浆和上清液中CTGF表达的增加(图11)。加入抗αVβ3整合素和αVβ1整合素抗体对纤连蛋白诱导的CTGF表达无显著影响。这些结果进一步提示纤连蛋白在刺激眼细胞产生CTGF中的作用，因为α5β2整合素与RPE细胞粘附纤连蛋白的相关联。
实施例11CTGF表达及其对视网膜米勒细胞迁移的作用在与实施例1所述RPE细胞培养的相同培养液中，培养获自己建立的细胞素(Satrty等，Invest Ophthalmol Vis Sci 39(1)212-216，1998)的大鼠视网膜米勒细胞。用RT-PCR检测培养的视网膜米勒细胞中的CTGF mRNA表达。分离米勒细胞mRNA和合成cDNA的方法与RPE相同(见实施例1详述)，进行PCR扩增检测细胞中CTGF mRNA表达。采用大鼠CTGF特异性寡核苷酸序列引物。人鼠CTGF引物序列是5’-ctccagtctgcagaaggtattc-3’(SEQ ID NO7)和5’-caaccgcaagattggagtgt-3’(SEQ ID NO8)，产生480bp大鼠CTGF DNA片段扩增。用于PCR扩增的条件如下94℃1分钟、60℃1分钟72℃延伸2分钟，共35轮。将大鼠视网膜米勒细胞CTGF的PCR产物在琼脂糖凝胶上分辨。用RT-PCR检测培养的视网膜米勒细胞中CTGF mRNA的表达。观察到了预计大小的PCR扩增产物(资料没显示)，表明大鼠视网膜米勒细胞表达了CTGF。
如实施例6中所述，采用改进的Boyden小室试验测定了米勒细胞的移行。CTGF以剂量依赖方式诱导了米勒细胞的移行。剂量39ng/ml和50ng/ml的CTGF刺激了纤连蛋白上米勒细胞迁移明显提高(资料末显示)。这些结果表明CTGF是米勒细胞的趋化因子。这些结果表明了PVR发生中CTGF对米勒细胞迁移的作用，因为米勒细胞存在于PVR膜上。
实施例12人PVR膜组织中CTGF的表达用免疫组化分析检验了获自眼科疾病患者的人PVR膜中CTGF的表达。手术切除病人因眼睛创伤或视网膜剥脱而形成的PVR膜。制备分离的PVR膜如下进行免疫染色。急速冻结分离的PVR膜，用冷冻切片机切成6微米切片，风干融化的组织切片，用PBS(pH7.4)复水后以5％正常羊血清封闭15分钟。切片与兔抗CTGF多克隆抗体(第一抗体，用本领域已知方法制备)培育60分钟。然后，用PBS洗切片三次，每次5分钟，去除末结合的抗-CTGF抗体。切片再与生物素化抗兔抗体(第二检测抗体，稀释1∶400，Vector，Burlingame，CA)一起培育，用PBS洗5分钟。加入链霉亲和素过氧化物酶并用AEC试剂盒(Zymed)显色。切片用苏木精反染，用甘油-凝胶培养液固定。
如免疫组化所证实，被检的所有10个分离的PVR膜均CTGF表达染色阳性。PVR膜中，CTGF定位于胞外间隙或纤维性PVR膜的细胞中，见图12所示。正常的非患病RPE切片中末测见CTGF免疫染色(资料末显示)。这些结果表明眼科疾病中表达了CTGF。
也对分离的人PVR膜切片起家行了免疫过氧化物酶和碱性过氧化物酶双重染色。将融化的冰冻切片用10％中性福尔马林缓冲液(Polyscience，Inc.Warrington，PA)固定10分钟，用Tris-HCl(pH7.4)洗三次(每次5分钟)，用5％羊血清封闭15分钟。如上所述，用抗-CTGF抗体对切片作CTGF免疫染芭后，用Tris-HCl缓冲液洗切片三次，加入细胞角蛋白(在视网膜中，细胞角蛋白是PRE细胞的特异性标记)特异性第一抗体和CD-31(一种内皮细胞特异性标记)特异性第一抗体，室温培育切片1小时。用Tris-HCl缓冲液洗切片三次，将切片与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠抗体(Vector，1∶500稀释)共培育30分钟。再用Tris-HCl缓冲液洗切片三次。切片加入Vector兰显色15分钟。
免疫组化分析证实，分离的人PVR膜中表达了CTGF(图12)。分离的人PVR膜切片双标记揭示许多CTGF阳性细胞细胞角蛋白(视网膜中PRE细胞特异性标记)染色也阳性。这些结果表明PVR膜中的RPE细胞表达CTGF。
实施例13CNV膜中的CTGF表达用免疫组化染色检验了CNV膜中的CTGF表达。手术切除临床诊断为老年黄斑变性病人的CNV膜。制备分离的CNV膜，用实施例12所述的PVR膜CTGF免疫染色方法，免疫染色分析其CTGF表达。
受检CNV膜CTGF表达染色阳性。大多数CTGF染色发生在该膜的血管化区域，见图13A中的箭头所示。图13A显示CTGF阳性细胞胞浆着染(箭头所指)。胞核着染苏木精。各种眼科疾病中，某些膜显示活跃的新血管形成，而其它显示纤维疤痕和极少的新血管形成。此结果表明，CNV、CTGF主要定位于新生血管膜，然而某些CTGF染色也见于非新生血管膜中。CNV膜中血管区域的CTGF染色强度和程度比非血管膜和纤维膜中所见高几倍。此外，CNV膜中周围血管有CTGF阳性细胞。
在某些些分离的CNV膜中观察到部分完整的PRE单层。如图13B中箭头所指，与PRE单层相关的区域染成CTGF强阳性。完整PRE单层中CTGF阳性细胞双染色表明，许多CTGF阳性细胞的细胞角蛋白免疫反应也是阳性，见图13C中箭头所指。图13B的箭头显示CTGF阳性细胞从RPE单层迁移出来。这些结果表明，分离的CNV膜中所见的CTGF阳性细胞是转分化的RPE细胞，显示其形态从典型的视网膜色素上皮细胞转变成更象成纤维细胞的外观。图13D箭头显示，如用内皮细胞标记CD-31和CTGF双标记证实的那样，含有内皮细胞的CNV膜中存在其它CTGF阳性细胞。也检查了正常成人视网膜的CTGF表达，然而这些样品的RPE或CEC细胞中未测见CTGF免疫反应(资料未显示)。
综合在一起，这些结果证明，与眼科疾病相关的CNV膜中表达了CTGF。CNV膜中CTGF的表达大多数位于膜的血管区域中。CTGF表达位于基质RPE和CEC细胞以及残留单层中的RPE细胞。残留RPE单层中存在CTGF提示，CTGF可能激活了正常的其下内皮，导致部分通过调节CEC功能刺激了脉络膜血管生成和新血管形成。
实施例14PVR中的CTGF表达调查了临床诊断为PVR的病人玻璃体中CTGF及其片段的表达。玻璃体样品获自患不同眼科疾病病人，包括视网膜剥脱和PVR(RD+PVR)、视网膜剥脱无PVR(RD)、表视网膜(ERM)、和与PVR无关的黄斑孔洞(MH)。采用检测CTGF及其片段的特异性ELISA试验检测这些玻璃体液中的CTGF及其片段的水平。
如图14所示，在获自各种眼科疾病，包括MH，ERM，RD和RD+PVR的病人的玻璃体液中测到了CTGF(空心棒)及其N-未端片段(实心棒)。所有测试样品中测到的CTGF N-端片段水平高于CTGF。获自PVR病人的玻璃体中，观察到比获自非PVR眼病，如MH病人的玻璃体中明显更高水平的CTGF N-端片段(图14)。具体说，RD病人玻璃体中的CTGF N-端片段水平约为10ng/ml，而RD并发PVR病人的玻璃体中CTGF N-端片段水平约为20ng/ml(图14)。因此，单独RD不伴有CTGF N-端片段水平的显著升高。然而，RD伴有PVR时，CTGF N-端片段升高，提示CTGF在RD发生PVR中起了作用。
这些结果表明，可测定无细胞玻璃体液样品中CTGF及其片段水平。这些结果还表明，患有与纤维增生(纤维化)相关的眼科疾病，如PVR的病人玻璃体中CTGF水平大大升高，或无纤维增生，如MH的病人玻璃体中CTGF水平升高较低。
实施例15CNV和视网膜新血管形成中的CTGF表达调查了临床诊断为各种眼新血管形成病人的玻璃体中的CTGF表达。玻璃幕体样品得自临床诊断为CNV和视网膜新血管形成(RNV)的病人。CNV样品包括老年性黄斑变性(AMD)和无AMD的CNV(CNVM-非AMD)。RNV样品包括增生性糖尿病性视网膜病(PDR)、PDR伴玻璃体出血(PDR伴VH)和VH无PDR(VH非PDR)。用特异性检测CTGF及其片段的ELISA试验测定CTGF及其片段。
如图15所示，在得自各种眼科疾病，包括AMD，CNVM非AMD，PDR，PDR伴VH和VH非PDR的病人玻璃体液中，测到了CTGF(空心棒)及其N-未端片段(实心棒)。所有测试样品中测到的CTGF N-端片段水平高于CTGF。获自诊断为PDR的病人的玻璃体样品中CTGF N-端片段的水平最高。这些结果表明，PDR病人玻璃体中的CTGF水平大大升高。此外，这些结果表明，CTGF表达与伴有新血管形成和眼细胞增生的眼科疾病相关联。
实施例16涉及用PDGF注射RPE细胞的PVR动物模型进行了采用眼科疾病动物(产生色素的家兔)模型的实验。在这些眼科疾病的动物模型中每只动物用一只眼睛(通常为右眼)做实验，另一只眼睛作为不处理对照。由于体内动物模型的固有的变异性，各试验组一般包括6只家兔，以产生足够的数量而达到统计学验证结果。在这种已建立的PVR家兔模型中，将分离的RPE细胞和PDGF注射入家兔眼中。此模型中注射RPE和PDGF的兔眼94％在注射两周内发生了视网膜剥脱。
分离成年家兔眼睛(用于此研究的家兔重2.5-3.5kg)的兔RPE细胞，培养在添加10％胎牛血清的DMEM液中。所有以后的注射采用接近铺满的兔RPE细胞培养物(通常为第2-4代)。通过胰酶消化从培养板中取得培养的兔RPE细胞，重悬在PBSK(250,000细胞/0.1ml)。将RPE细胞注射入兔眼前，用25号针头从各眼中取出0.2ml房水。用检眼镜间接控制，将连接了含有RPE细胞的结核菌素针筒的27号针头，在距巩膜边缘后3mm点正好位于视盘上方处剌穿巩膜。注射RPE细胞后，用与注射RPE细胞相同的技术通过同一进入口注射含150ng PDGF-BB的0.1ml PBS。注射后用检眼镜间接随时检查动物。随时监测PVR的发生和程度，并根据临床发现按照Fastenberg所述的参数，分类为五期之一(Fastenberg等.Am J Ophthalmol93565-572，1082)。此家兔模型中PVR发展的分期概括在下表1中。
表1家兔眼中的PVR分期

PVR动物模型受处理眼的组织学检查显示，存在中等程度的细胞膜和轻度纤维化。当将注入的RPE细胞数从上述的250.000减少到100,000时，产生的PVR是轻度的，只有微弱而细胞成分少的非纤维膜产生。此外，注射减少数量的RPE细胞眼中产生的膜是局灶性和局限化的，未见视网膜剥脱。
实施例17CTGF诱导PVR动物模型产生PVR采用改进的上述实施例16的PVR家兔模型，研究了CTGF对PVR发生的作用。先将不同量的rhCTGF注入兔眼中。检测了玻璃体内只注射rhCTGF对RPE的影响和所导致的PVR。如表2所示，健康家兔眼内玻璃体注射200ng或400ng的rhCTGF对RPE未测到有作用。然而，视网膜下注射200ng rhCTGF导致轻微的RPE变化，包括轻度局灶性RPE单层结构破坏。载见显著的细胞增生和膜形成。
表2家兔眼中玻璃体注射rhCTGF

在上述实施例16的PVR家兔模型中，RPE细胞与PDGF一起注入家兔眼中，导致注射二周内产生轻度PVR，特征是形成了含中等纤维的细胞膜。为检查该轻度家兔模型中的CTGF作用，如上所述，将RPE细胞与不同量的rhCTGF(无PDGF)注入家兔眼中。如下表3所示，当RPE细胞与200ng rhCTGF一起注入家兔眼中时，3周后产生了1期PVR。注射眼组织学检查未见存在表视网膜或视网膜剥脱。
当RPE细胞与400ng rhCTGF一起注入兔眼时，3周后发生了2级PVR。注射眼组织学检查，产生了小而簿的膜。表3小结了兔眼注射不同量rhCTGF和RPE细胞的结果。综合在一起，这些结果表明，rhCTGF当玻璃体内注射时，对RPE作用很小。
表3兔眼中玻璃体内注射RPE细胞和rhCTGF

此动物模型中发生PVR的阳性对照是玻璃体内注射100,000个RPE细胞和50ngPDGF。注射后三周，注射眼中观察到牵拉性视网膜剥脱，伴有簿的细胞成分少的膜(见下表4)。在平行实验中，注射100,000个RPE细胞和50ng PDGF。后一周，玻璃体内注射200ng rhCTGF。两周后，检查眼内有无变化。在此实验条件下，产生了簿的纤维性膜，代表PVR三期。这些结果显示，当将CTGF注入已有轻度PVR的兔玻璃体内时，此膜变成致密的纤维性膜。因此，在轻度PVR动物模型中，将CTGF注入玻璃体内刺激并增强了眼内发生的纤维增生。这些结果还显示间接证明CTGF诱导了眼科疾病动物模型体内的病理性纤维增生。这些结果还显示CTGF诱导眼细胞增生，并至少部分与其它眼科疾病相关生长因子一起作用，诱导了眼纤维变性。
表4CTGF增强家兔模型中PDGF诱导的PVR

1注射RPE细胞和PDGF后一周注射rhCTGF。
实施例18腺病毒-CTGF表达载体的构建设计并构建了遥病毒表达载体用于各种体内外实验中的遥病毒介导的CTGF及其片段的表达。采用购自Qbiogene(Montreal，Canada)的pAdEasy系统制备含CTGF的遥病毒表达载体构建物(pAd-CTGF)。此系统的组成包括pAdEasy-1(病毒骨架，分类号AES1010)和pShuttle-CMV(分类号AES1021)。全长人CTGF(DB60R32，GenBank登录号M92934，GI180923)获Dr.Gary(迈阿密大学医学院)(Bradham等，J CellBiol 1141285-1294，1991)。用限制性酶BamHi(其切割pBluescript II KS的689位点)和SwaI(其切割CTGF cDNA的1277位点)在5’端下游1277位点处(即位于3’)，从pBluescript II KS(DB60R32)切下CTGF cDNA。用标准的分子克隆技术，将CTGF cDNA片段插入事先已用限制性酶BgIII和EcoRV消化的pShuttle-CMV中。用标准方法蛋白的舜时表达和Western印迹分析证实得到的pShuttle-CMV-CTGF构建物的CTGF表达。
按厂商程度，用pShuttle-CMV-CTGF表达质粒通过细菌与pAdEasy-1的重组产生重组的腺病毒。简而言之，线性化pShuttle-CMV-CTGF，然后与pAdEasy-1一起共转染(电穿孔)入感受态大肠杆菌BJ-5183。在LB-KM培养基中培养产生的克隆16小时，用碱抽提法抽提重组pAd-CTGF质粒。也制备了对照质粒pAd-GFP(含绿荧光蛋白)和pAd-e1E3del。pSCMV(不含插入物的对照腺病毒质粒)。用几种限制性酶用限制性酶谱证实该重组质粒序列。用ABI prism 310自动DNA测序仪自动DNA测序进一步证实pAd-CTGF中的CTGF cDNA序列。将分离得到的质粒转化入稳定的大肠杆菌JM109细胞中。然后用限制性酶Pac1线性化重组的质粒，并用Lipofectamine(GIBCO/BRL，Grsnd Island NY)转染入含E1和E3基因的293包装细胞中。转染后收集细胞进行三轮冻融，收集上清液。用CsCI梯度超离心纯化病毒颗粒，所用1.30重量的CsCI液用10mM Tris-HCl，pH7.4液配制。用PFU测定病毒滴度。
如下构建含编码人CTGF N-端片段或C-端片段的复制缺陷性重组腺病毒。用FastTrack试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)，按厂商所述方法分离培养的人RPE细胞的多聚(A)+RNA。42℃用M-MLV逆转录酶(Gibco/BRL)合成第一链cDNA。选用标准方法，用人N-端CTGF和C-端CTGF的特异性寡核苷酸引物序列进行PCR反应。采用这些引物导产生致编码人CTGF N-端片段和CTGF C-端片段的CTGF特异性DNA扩增产物。
用Perkin-Ellmer/Centur DNA热循环仪进行PCR扩增，所用条件例如如下94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸45秒，进行30轮PCR。分离得到的扩增产生并亚克隆入载体pCR2.1(Invitrogen Corp.)。用ABI prism 310自动测序仪(ABI，USA)测序证实CTGF N-端和C-端片段cDNA的DNA序列。用限制性酶XbaI和XhoI消化从pCR2.1载体上切下CTGF N-端片段cDNA和C-端片段cDNA的序列。分离得到的限制性片段并亚克隆入pAdTrack-CMV穿梭载体(ADENO-QUEST，QuantumBiolab Inc.Montreal，Canada)的XbaI-XhoI克隆位点。pAdTrack-CMV是一种穿梭质粒，用于同源重组，含有以下元件腺病毒5型、大肠杆菌复制起点、卡那霉素抗性基因、eGFP基因(增强的绿荧光蛋白，Clontech，Palo Alto，CA，其表达受人巨细胞病毒立即早期启动了/增强子的驱动)和其中可亚克隆DNA和由CMV启动子表达的多个克隆位点。用限制性酶Pme1线性化pAdTrack-CMV载体包含CTGF N-端片段cDNA或CTGF C-端片段cDNA的序列，然后电穿孔与pAdEasy-1(ADENO-QUEST，Quantum Biolab Inc)共转染入感受态大肠杆菌BJ-5183细胞。
在LB-KM培养基中培养所得克隆16小时，用碱抽提法抽提重组质粒(pAdEasy-CTGF-N，pAdEasy-GFP)。用上述方法构建对照载体pAdEasy-GFP，但不插入CTGF cDNA。用几种限制性酶(如EcoR1、Xho1、Sal1、BamH1和Pac1)通过限制性酶谱证实该重组质粒序列。将分离的质粒转化入稳定的大肠杆菌JM109细胞中。用限制性酶Pac1线性化该重组质粒，并用Lipofectamine(GIBCO/BRL，GrsndIsland NY)转染入含E1和E3基因的293包装细胞中。用ABI prism 310自动测序仪自动测序DNA证实该载体中的CTGF cDNA序列。转染后收集细胞、冻融三次。收集上清液。用CsCI梯度超离心纯化病毒颗粒，所用1.30重量的CsCI液用10mMTris-HCl，pH7.4液配制。用PFU测定病毒滴度。
实施例19含PAD-CTGF感染的RPE细胞的PVR动物模型如以上实施例所示，本发明确定RPE细胞可表达CTGF并对CTGP反应。与人PVR膜相关的RPE的CTGF蛋白表达阳性。这些资料表明CTGF在诱导、形成、发展和维持PVR和PVR膜相关各种眼科疾病中的作用。实施例17所述实验中，将RPE细胞与外源加入的rhCTGF一起注射入家兔眼内，所见作用相对轻微(见表3)，可能是因为眼内环境中缺乏持续的CTGF接触或存在。
为了研究进行性眼科疾病中眼内所见的持续表达和接触CTGF的后果。改进了上述PVR兔眼模型以提供眼内CTGF的持续表达。改进包括如下所述注射事先感染了可表达rhCTGF的腺病毒构建物的RPE细胞。
无血清培养液洗涤铺满的兔RPE细胞培养物，并用实施例18构建的含CTGF的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-CTGF)103PFO感染。60分钟后，用含2％胎牛血清的新鲜培养液替换原培养液，37℃培育感染细胞48-72小时，然后膜酶消化取出板中的细胞，洗涤，重悬于PBS中成为1×107细胞/ml。用此方法，80％以上培养的RPE细胞感染Ad-CTGF腺病毒。
以下研究中检验了三组动物。阴性对照动物注射来感染腺病毒的RPE细胞，实验组动物注射感染Ad-CTGF的RPE细胞。第三姐动物注射感染Ad-CTGF的RPE细胞。作为腺病毒对照。此外，由于Ad-CTGF感染细胞(感染腺病毒的确良或对照RPE细胞)注入着色兔眼之前，通过由吸0.2ml房水(用23号针头)先降低兔眼的眼内压。利用操作显微镜将含10万个腺病毒感染RPE细胞的0.1mlPBS液，用连接结核菌针筒的27号针头刺入巩膜缘后3mm处，流入玻璃体内。
静脉内注射感染Ad-CTGF的10万个RPE细胞，导致形成由视神经产生的厚膜并伸展入玻璃体内(图16A和16B)，组织学分析显示存在细胞和纤维性表视网膜，注射14天后发生玻璃体浑浊，而眼前房仍清沏。
注射Ad-CTGF的眼睛发生PVR，无见视网膜破裂。PVR证据包括出现前视网膜，髓样纤维畸变和视网膜管，固定性视网膜折叠和牵拉视网膜剥脱。此外，眼杯中存在纤维组织块。组织学分析显示有致密的纤维性表视网膜。注射盐水对照的动物，注射腺病毒对照的动物或注射无腺病毒感染的RPE细胞对照动物，均未产生PVR或形成纤维性表视网膜。
综合这些结果表明，玻璃体内注射过度表达CTGF的RPE细胞诱导了眼纤维变性。具体说，激活的RPE细胞或细胞性RPE膜中加入CTGF，受刺激的形成眼纤维变性，包括细胞性RPE膜转化成髓成纤维细胞致密的纤维性表视网膜。此外，这些结果表明CTGF的过度表达引发了PVR，无需加入PVR膜中常见的外源生长因子或细胞因子，如PDGF、TNFα、TGFβ、HGF、VEGF、TL-1和TL-6，因此在这些眼科疾病动物模型中，CTGF提供了最初的触发作用，另致在发展的非纤维性细胞性表视网膜中发生纤维增生。这些结果显示了CTGF体内诱导眼科疾病动物模型中的纤维增生的直接证据。
实施例20视网膜F-玻璃体内注射腺毒辣的模型在着色家兔巩膜缘后3mm用手术切作切口。用操作显微镜和插入的接触目镜在目视控制下，插入连接一显微针筒的玻璃显微移液管。在距视盘2-3园盘直径处用该显微移流管轻轻接触视网膜，产生家财小孔，由于此操作而发生出血的眼睛不再用于进一步研究。该研究检查了二组动物，实验组动物注射50μl Ad-CTGF，当第二组动物注射Ad-CTGF作为对照载体和通过监测绿荧光蛋白标记的表达确定细胞是否已被感染。
实施例21PVR的分解酶模型通过视网膜下注射分散酶将PVR导入家兔眼内，所用模型和方法铜陵先前所述(Frenzel等，Invest.Ophthalmol Vis Sci 392157-2164，1998)。如上所述用含50μl(0.05u)的分解酶手术(Sigma Chanicla Co)的PBS形成了视网膜下出血。手术后一击约75％注射家兔中，手术后二周约100％注射家兔诱发了视网膜剥脱。表视网膜呈现中等程度纤维增生，对这些动物的玻璃体吸出液进行Western印迹分析见以上实施例22。如实施例17泳道4所示，这些动物的玻璃体显示CTGF及基片段的表达高于对照动物所见(图17，泳道1)。
实施例22PVR动物模型玻璃体吸出液的Western印迹分析用免疫印迹分析检查了各种PVR动物模型家兔玻璃体吸出液。进行此试验以确定在患PVR家兔的玻璃体中是否积累了CTGF或其片段。这些实验的结果见图17。图17中箭头所指为CTGF及其片段的位置，正常家兔玻璃体含低水平的CTGF如实施例19所述，玻璃体内注射事先感染Ad-CTGF的兔RPE细胞诱导了PVR。这些动物中，一周后先发生PVR(图17泳道3)。二周后进展为纤维化(图17泳道2)。这些动物的玻璃体中主要表达CTGF片段(约15KD)。
实施例23CTGF对小鼠器官培养PVR模型中胶质增生发展的作用眼胶质增生与眼胶质细胞的增生增殖相关。眼胶质细胞包括米勒细胞和星开细胞维持生理环境并向视网膜提供结构性支撑。眼胶质增生可影响视网膜收缩和提高视网膜剥脱的发生。
采用小鼠品系C57B1/6的眼睛，在赤道线处切开眼球，取出角膜和晶状体。将切下的眼后部置于24孔培养板中，以含10％FBS的Neurobasal培养液培养。组织培养第二天培养液中加入CTGF(50ng/ml)。七天后观察培养物变化，包括视网膜折叠的产生和视网膜边缘卷曲。拍照和组织学观察作出判断。与对照培养物比较，CTGF刺激了视网膜折叠的形成和缘卷曲。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体作免疫组化染色，表明病理区域中有GFAP胶质增殖。这些结果表明CTGF诱导了周围血管星形细胞的胶质增生。用这些植入培养物获得的结果还提示CTGF通过刺激视网膜胶质增生和收缩在PVR发病过程中起着重要作用。
通过以上描述本领域技术人员会明白，除了本文所显示和描述的以外，可对本发明进行各种修饰，但这些修饰都包括在本发明权利要求书范围内。
序列表<110>D.R.辛顿(Hinton，David R.)S.何(He，Shikun)N.A.奥利弗(Oliver，Noelynn A.)<120>抑制眼病理过程的方法<130>FP0813 PCT<150>US 60/339,547<151>2001-12-11<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gcatccgtac tcccaaaatc20<210>2<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2cttcttcatg acctcgccgt20<210>3<211>22<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>3gatcatagga ctgtattagt gc 22<210>4
<211>20<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>4ctgacttaga gacgaacttg20<210>5<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5gctccgcccg cagtgggatc catgaccgcc gcc 33<210>6<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6ggatccggat cctcatgcca tgtctccgta 30<210>7<211>22<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>7ctccagtctg cagaaggtat tc 22<210>8<211>20<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>8caaccgcaag attggagtgt20
权利要求
1.一种在对象中抑制或预防与结缔组织生长因子(CTGF)相关的眼过程的方法，其特征在于，所述方法包括给予能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是体内给药。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是体外给药。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象是细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象是动物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物选自抗体、反义寡核苷酸和小分子。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物被输送到眼中。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物被输送到眼表面。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物以滴眼剂型输送。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼过程还与眼细胞相关。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述眼细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞、脉络膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、角膜上皮细胞、小梁网细胞、外膜细胞、星状细胞、微胶质细胞、血管周围胶质细胞、米勒细胞、血管周围星状细胞、杆状体、锥形体、神经节细胞和双极性细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼过程还与眼构造有关。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述眼构造选自视网膜、视网膜色素上皮层、脉络膜、黄斑、角膜、晶状体、虹膜、巩膜、小梁网、房水、房水室、玻璃体、睫状体、视盘、乳头和视网膜中央凹。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼过程还与眼科疾病相关联。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述眼科疾病选自青光眼、白内障、脉络膜新血管形成、视网膜剥脱、增生性玻璃体视网膜病变、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜瘢疤形成和角膜浑浊。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼过程还与眼纤维变性相关联。
18.一种抑制或预防眼细胞外基质产生或沉积的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
19.一种抑制或预防眼新血管形成的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述新血管形成是视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、虹膜新血管形成或小梁新血管形成。
21.一种抑制或预防眼睛炎症的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
22.一种抑制或预防眼细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述眼细胞增殖选自上皮细胞增殖、内皮细胞增殖、视网膜色素上皮细胞增殖和脉络膜内皮细胞增殖。
24.一种抑制或预防眼细胞迁移的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述眼细胞迁移选自上皮细胞迁移、视网膜色素上皮细胞迁移、内皮细胞迁移和脉络膜内皮细胞迁移。
26.一种抑制或预防眼瘢疤形成的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述眼过程还与眼外科手术相关联。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述外科手术选自屈光纠正手术、放射状角膜切开术、LASIK、视网膜剥脱治疗术、角膜移植术、青光眼渗滤术、白内障摘除术、晶状体置换术、玻璃体切除术、视网膜下手术和视网膜易位术。
29.一种治疗或预防眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
30.一种治疗或预防眼纤维变性的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
31.一种治疗或预防与新血管形成相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
32.一种治疗或预防与胞外基质产生或沉积相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
33.一种治疗或预防与炎症相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
34.一种治疗或预防与细胞增生相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
35.一种治疗或预防与细胞迁移相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
36.一种治疗或预防与眼膜形成或改变相关的眼科疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述眼膜选自表视网膜、视网膜下膜、玻璃体膜、细胞膜、脉络膜新生血管膜和纤维膜。
38.一种维持或改进受试者视力的方法，其特征在于，所述方法包括给予受试者治疗有效量的能降低CTGF或其片段的表达或活性的药物。
39.一种诊断与CTGF相关的眼科疾病或鉴定产生眼科疾病易感性的方法，其特征在于，所述方法包括(a)获得受试者的样品，(b)测定所述样品中CTGF或其片段的水平，(c)将所述样品的CTGF或其片段的水平与标准水平相比较，若所述样品的CTGF或其片段的量升高，表明存在眼科疾病或具有发生眼科疾病的易感性。
40.一种用于诊断与CTGF相关的眼科疾病或鉴定发生与CTGF相关的眼科疾病的易感性的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括(a)检测样品中CTGF水平的试剂；和(b)测定样品中CTGF水平的试剂。
41.一种用于诊断眼纤维变性或鉴定发生眼纤维变性易感性的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括(a)检测样品中CTGF水平的试剂；和(b)测定样品中CTGF水平的试剂。
42.一种鉴定可用于抑制或预防与CTGF相关的眼过程的药物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使候选药物与CTGF或其片段接触；(b)测定样品中CTGF或其片段的表达或活性水平；和(c)将所述样品中CTGF或其片段的表达或活性水平与标准的CTGF或其片段的表达或活性水平相比较，若所述样品中CTGF或其片段的表达或活性降低，表明此药物能抑制或预防与CTGF相关的眼科疾病。
43.一种鉴定可用于治疗或预防与CTGF相关的眼科疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使候选药物与CTGF或其片段接触；(b)测定样品中CTGF或其片段的表达或活性水平；和(c)将所述样品中CTGF或其片段的表达或活性水平与标准的CTGF或其片段的表达或活性水平相比较，若所述样品中CTGF或其片段的表达或活性降低，表明此药物能治疗或预防与CTGF相关的眼科疾病。
全文摘要
本发明涉及抑制或预防CTGF相关眼病理过程的方法，用于治疗或预防眼科疾病的方法和药物，诊断眼科疾病的方法和相关试剂盒，还提供筛选用于所述方法的试剂的方法。
文档编号C07H21/04GK1602207SQ02824730
公开日2005年3月30日 申请日期2002年12月11日 优先权日2001年12月11日
发明者D·R·辛顿, S·何, N·A·奥利弗 申请人:法布罗根股份有限公司, 南加利福尼亚大学