专利名称：一种石油污染土壤的原位生物修复方法
技术领域：
本发明涉及采用添加剂及多种工程手段强化混合微生物制剂对石油污染土壤的原位生物修复效率的方法。属于石油污染土壤的原位生物修复技术。
背景技术：
石油污染土壤的生物修复技术可分为原位生物修复和异位生物修复。原位生物修复方法适合大面积污染的治理，具有不需要移动土壤、成本低、操作简单等优点。在原位生物修复过程中通常需要添加具有高效降解石油烃能力的微生物制剂。原位修复发生在开放的土壤生态系统中，土壤结构的不均一性、生态系统的复杂性以及气候等环境因素的不可控性往往造成添加的微生物制剂生长代谢情况差，降解活性受到土著微生物的抑制，导致修复效率降低、周期延长。因此，开发高效微生物菌剂、开发能够促进菌剂在土壤中的生长代谢的助剂以及开发相关工程强化措施是推广应用原位生物修复方法的关键。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种适用性强、降解效率高的石油污染土壤的原位生物修复方法。该方法采用具有石油烃降解能力的真菌和细菌的组合物作为混合微生物制剂，将有效量的混合微生物制剂加入受石油污染的土壤中，添加有效量的土壤结构改良剂、微生物活性促进剂、有机肥和无机营养物质。采用灌溉、翻耕和保水保温的工程措施进一步保证修复过程的最佳条件。具体包括以下步骤1)在受石油污染的土壤中加入0.1～1kg/m2的液体混合微生物制剂、占土壤质量百分比为1％～10％的添加剂、占土壤质量百分比为1～5％的有机肥和无机营养物质，使土壤中元素比例为C∶N∶P∶K＝90～120∶10～12∶1～2∶2～4；所述的液体混合微生物制剂由真菌液体培养物和细菌液体培养物组成，真菌液体培养物与细菌液体培养物的混合比例为1∶0.1～10；所述的真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌或白腐真菌黄孢原毛平革菌的单株液体培养物，或是两种真菌液体培养物的混合物，真菌培养物中的真菌含量为10～80mg干重/ml；细菌液体培养物是具有石油烃降解能力的细菌菌株的单株液体培养物，细菌含量为106～1012个/ml；所述的添加剂为纤维素和木质素类天然生物质；2)采用保水保温措施覆盖多孔地膜，并采用灌溉和翻耕措施，保持土壤水份含量为20～30％；翻耕操作周期为1～4周1次。
本发明的技术方案中，所述的真菌培养物中的真菌含量优选为20～60mg干重/ml；细菌含量优选为108～1012个/ml。当真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合物时，刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合比例为1∶0.8～1。
本发明的技术方案中，具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、微球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或芽孢杆菌属中的一种或几种。
本发明中所述的纤维素和木质素的天然生物质采用木屑、秸秆、稻草等。该添加剂可以提高土壤的疏松度，促进氧气传递，帮助真菌在土壤中快速繁殖。
如上所述，本发明采用真菌-细菌液体混合微生物制剂，通过各种助剂和工程强化措施的作用保持并促进微生物制剂在污染土壤体系中的生物学活性，可达到所添加的微生物制剂在污染土壤中协同降解石油烃污染物的作用。该混合微生物制剂将具有石油烃降解能力的真菌和细菌混合制成微生物制剂，充分综合利用了细菌对低分子量烃类降解能力强、产生生物表面活性剂提高石油烃的生物可利用度、对真菌的可溶性中间代谢产物能够继续降解等优点，以及真菌产生降解能力强的胞外酶、能够降解结构复杂分子量较大的污染物、在土壤体系中延伸性好等优点，实现了真菌和细菌之间在土壤中的生态合作与代谢途径的互补，能够提高对石油烃的降解能力。本发明的在于提供了一种有利于真菌细菌混合微生物制剂在污染土壤中代谢生长的、适合工业应用的原位生物修复实施工艺，具有广阔的应用前景。
以下通过实施例进一步描述本发明，但不限制本发明。
具体实施例方式
本发明所述的具有石油烃降解能力的微生物可通过从石油污染的土壤中进行筛选或者从各国菌种保藏中心购买已知的石油烃降解菌株的方式得到。
在实施例中，采用EPA 3546所述微波溶剂萃取标准方法确定土壤中总石油烃含量。
实施例中使用的有机肥为鸡粪，无机营养物质为尿素、磷酸二铵和硫酸钾。具体用量见实施例1和实施例2所述。
实施例1本实施例中使用使用刺孢小克银汉菌1株和假单胞菌1株制备液体混合微生物制剂，制备方法如下在装有100ml液体马铃薯培养基的容积为300ml三角瓶中接种刺孢小克银汉菌，在28℃，160rpm条件下培养3天，收集培养物，真菌含量为20mg干重/ml。在装有100ml LB液体培养基的容积为300ml三角瓶中接种假单胞菌，在30℃，160rpm条件下培养1天，收集培养物，细菌含量为108个/ml。将得到的真菌培养物和细菌培养物按照混合比例为10∶1进行混合得到实施例中使用的液体混合微生物制剂。
本实施例中使用的添加剂为秸秆，有机肥为鸡粪，无机营养物质为尿素、磷酸二铵和硫酸钾。
实施例1治理的污染区域为采油五厂输油管道泄漏造成的原油污染。上述液体混合微生物制剂用量为1kg/m2土壤，秸秆添加量占土壤质量百分比为10％，鸡粪用量占土壤质量百分比为5％，尿素、磷酸二铵和硫酸钾的用量以能保证土壤中元素比例为C∶N∶P∶K＝90∶10∶1∶2。灌溉以保持土壤水份含量约为20％，翻耕频率为每1周1次，土壤表面覆盖多孔地膜。
同时进行一对照实验。在同一污染区域划分一块用于对照实验，差别在于不添加液体混合微生物制剂。
经过147天的原位生物修复，实施组中土壤中的总石油烃含量降解率达到72.32％，而对照组为25.10％。处理过程石油烃降解率的变化见表1。
表1.实施例1的处理效果
实施例2本实施例中使用使用黄孢原毛平革菌1株和红球菌1株制备液体混合微生物制剂，制备方法如下在装有100ml液体马铃薯培养基的容积为300ml三角瓶中接种黄孢原毛平革菌，在30℃，170rpm条件下培养3天，收集培养物，真菌含量为60mg干重/ml。在装有100ml LB液体培养基的容积为300ml三角瓶中接种假单胞菌，在30℃，200rpm条件下培养2天，收集培养物，细菌含量为1012个/ml。将得到的真菌培养物和细菌培养物按照混合比例为1∶10进行混合得到实施例中使用的液体混合微生物制剂。
本实施例中使用的添加剂为稻草，有机肥为鸡粪，无机营养物质为尿素、磷酸二铵和硫酸钾。
与实施例1不同之处在于本实施例治理的污染区域为采油二厂输油管道泄漏造成的原油污染。上述液体混合微生物制剂用量为0.1kg/m2土壤，秸秆添加量占土壤质量百分比为1％，鸡粪用量占土壤质量百分比为1％，尿素、磷酸二铵和硫酸钾的用量以能保证土壤中元素比例为C∶N∶P∶K＝120∶12∶2∶4。灌溉以保持土壤水份含量约为30％，翻耕频率为每4周1次，土壤表面覆盖多孔地膜。
同时进行一对照实验。在同一污染区域划分一块用于对照实验，差别在于不添加液体混合微生物制剂。
经过161天的原位生物修复，实施组中土壤中的总石油烃含量降解率达到60.10％，而对照组为27.75％。处理过程石油烃降解率的变化见表2。
表2.实施例2的处理效果
本发明已参照较优实施方案作了描述，熟悉上述详细描述的本领域的技术人员可以作出许多变动和替换，其均包含在本发明的范围和实质内容中。
权利要求
1.一种石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)在受石油污染的土壤中加入0.1～1kg/m2的液体混合微生物制剂、占土壤质量百分比为1％～10％的添加剂、占土壤质量百分比为1～5％的有机肥和无机营养物质，使土壤中元素比例为C∶N∶P∶K＝90～120∶10～12∶1～2∶2～4；所述的液体混合微生物制剂由真菌液体培养物和细菌液体培养物组成，真菌液体培养物与细菌液体培养物的混合比例为1∶0.1～10；所述的真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌或白腐真菌黄孢原毛平革菌的单株液体培养物，或是两种真菌液体培养物的混合物，真菌培养物中的真菌含量为10～80mg干重/m1；细菌液体培养物是具有石油烃降解能力的细菌菌株的液体培养物，细菌含量为106～1012个/ml；所述的添加剂为纤维素和木质素类天然生物质；2)采用保水保温措施覆盖多孔地膜，并采用灌溉和翻耕措施，保持土壤水份含量为20～30％；翻耕操作周期为1～4周1次。
2.按照权利要求1所述的一种石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于所述的真菌培养物中的真菌含量为20～60mg干重/ml；细菌含量为108～1012个/ml。
3.按照权利要求1所述的一种石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于当真菌液体培养物为刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合物时，刺孢小克银汉菌液体培养物与白腐真菌黄孢原毛平革菌液体培养物的混合比例为1∶0.8～1。
4.按照权利要求1、2或3任一权利要求所述的一种石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于所述的具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、微球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或芽孢杆菌属中的一种或几种。
5.按照权利要求1、2或3任一权利要求所述的一种石油污染土壤的原位生物修复方法，其特征在于所述的纤维素和木质素的天然生物质采用木屑、秸秆或稻草。
全文摘要
一种石油污染土壤的原位生物修复方法，本发明属于石油污染土壤的原位生物修复技术。本发明的技术特征在于添加真菌—细菌液体混合微生物制剂，添加土壤结构改良剂、有机肥和无机营养物质，采用灌溉、翻耕、覆盖多孔地膜和保水保温的工程措施完成石油污染土壤的原位生物修复过程。本方法可以保证原位生物修复过程中微生物生长代谢的最佳条件，强化微生物在土壤中的迁移和营养物质等的传质过程，从而提高原位生物修复过程的效率。本发明在石油污染土壤的生物修复领域具有广阔的应用前景。
文档编号B09C1/10GK1785539SQ20051013067
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者刘铮, 韩慧龙, 王福远, 佘鹏, 陈镇, 邢新会, 张敏莲, 金文标, 张坤, 江皓 申请人:中国石油化工股份有限公司, 清华大学