利用紫外线-紫花苜蓿-ddt降解菌联合修复ddt污染土壤的方法

专利名称：利用紫外线-紫花苜蓿-ddt 降解菌联合修复ddt 污染土壤的方法
技术领域：
本发明涉及生态环保领域，具体是ー种利用紫外线-紫花苜蓿-DDT降解菌联合修复DDT污染土壤的方法。
背景技术：
农药的使用是提高农作物单位面积产量的重要措施之一。农业生产中大量而持续 地使用农药，可导致其在土壌中不断积累，造成土壤农药污染。农药可通过土壤淋溶等途径污染地表水和地下水，通过土壌-作物系统迁移积累影响农作物的产量和质量，最终经由食物链直接或间接影响人群健康。农药残留对人类健康、土、水生态系统以及我国农业和农村经济的发展等方面已经造成了不可忽视的危害。双对氯苯基三氯こ烷(DDT)是ー种典型的有机氯杀虫剂，是首批列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公約》中的12种持久性有机污染物之一，具有持久性有机污染物的特征性质持久性、半挥发性、生物富集性和高毒性。研究表明，DDT具有神经毒性、肝脏毒性和生殖发育毒性，可以影响生物体的内分泌功能，具有典型的三致毒性(致癌、致崎、致突变)。据统计，我国DDT的累计用量约40多万吨，占国际用量的20%。从1983年开始，DDT的生产和使用受到了限制，目前仅作为三氯杀螨醇的中间体和病媒控制使用。DDT的使用受到控制，我国土壌中DDT残留量已有明显下降，但ー些地区残留量仍处于较高水平。我国现有I家DDT生产企业和3家大的三氯杀螨醇生产企业和数家小型三氯杀螨醇企业，在DDT和三氯杀螨醇的生产过程中产生的废液、废渣等容易污染环境。已经停产的DDT生产企业，原生产车间和废弃生产设备可能对周边土壤产生严重污染，受DDT严重污染的土壤等如果未经妥善安全地处理，都有可能成为DDT的污染源，对环境造成严重威胁。DDT通过环境介质或食物链，最终会在人体内蓄积，严重影响人的身体健康。就如何进行DDT废弃物的处理、修复受DDT污染的环境这一问题，很多专家相继开展了大量研究，开发出了许多可以控制和降解DDT废弃物、修复环境的技木，但其中相当一部分尚处于实验室阶段，应用于工程实践的技术不多。而我国有关DDT研究不多，主要是有关化学氧化法、生物法等方面的研究。紫外线是位于日光高能区的不可见光线，依据紫外线自身波长的不同，可将紫外线分为三个区域，即短波紫外线、中波紫外线和长波紫外线。紫外线降解残留农药的原理与光化学降解接近，主要是依靠中波紫外光(波长253. 7nm)的作用，紫外线照射产生的化学效应使农药主要组成物质双键断裂，破坏农药构成成分的有机碳及其它元素间的结合，将难降解的有机物分解为酸类、醇类、胺类或相应的氧化物等低分子化合物。如有机磷农药马拉硫磷，在紫外线照射下先生成马拉氧磷，继续反应分子断裂最終生成磷酸、硫酸、ニ氧化碳和水。植物修复是利用根系的吸收作用和体内发达的酶系统对污染进行治理的ー种修复方式。植物以太阳能作为驱动力，在修复土壌的同时还能浄化空气和水体、美化环境、防止水土流失，无二次污染，特别适用于大面积污染区域的治理。由于植物新陈代谢的差异，所以植物修复的作用机理也不尽相同，但总体上可分为5种(1)植物挥发利用植物将ー些挥发性污染物吸收到植物体内，然后将其转化为气态物质释放到大气中；(2)植物提取植物直接吸收ー种或几种污染物并在植物体内蓄积，之后将植物收获进行处理；(3)植物降解植物利用本身产生的各种酶的作用，将吸收到植物体内的污染物进行转化和降解的ー种方式；(4)植物根际作用利用植物根际微生物及根释放的各种酶的降解作用来转化有机污染物；(5)植物稳定又称植物钝化，通过植物与土壌的共同作用，将污染物吸附于根系及土壌表面，从而降低污染物的有效形态。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科蝶形花亚科苜蓿属植物，因其产草量高、富含蛋白质、适ロ性好、适应性强等特点而被称为“牧草之王”。紫花苜蓿是多年生植物，一般生长年限可达到10年左右，根系发达，茎叶繁茂。夏季它的茂密枝叶可以阻挡雨水对土壤的物理冲刷和地面径流，秋冬季地表覆盖度高，不会使表土受到大风的侵蚀，減少空气 中风沙含量。在水土流失严重的黄土高原区被誉为“水保先鋒”。紫花苜蓿根系发达入土深，一般可达到3-5米，最长可以达到10米以上，因此能吸收土壤深层的水分，抗旱能力自然就很高，而且庞大的根系上着生的大量根瘤，会进行生物固氮，每亩约固氮32. 9公斤，相当于2460kg的硫酸铵，这样大大提高了土壌肥力，这ー特性对草田轮作非常有利，可显著提高后茬作物的产量和品质，并減少了肥料的投入，降低了因大量的肥料投入而引起的环境污染。近年来，用紫花苜蓿进行有机农药污染土壤修复的方法常有报道，如专利文献I(CN 101966529A)中公开了使用紫花苜蓿修复多氯联苯污染土壤的方法，专利文献2 (CN102228899A)中公开了使用紫花苜蓿修复苯胺类化合物污染土壌的方法。微生物修复是利用微生物去除环境中污染物的技术。微生物种类丰富，代谢途径多祥，因此在转化、降解、分解各类有毒污染化合物方面潜力巨大。微生物对农药的作用方式可分为两大类ー类是微生物直接作用于农药，通过酶促反应降解农药，常说的农药微生物降解多属于此类，降解方式主要有氧化、脱氢、还原、水解、合成等几种反应类型；另ー类是通过微生物的活动改变了化学和物理环境而间接作用于农药。然而，目前国内外对DDT污染土壤实施紫外线-生物修复的有效案例还很少，尤其在植物与微生物种类选择及生物修复机制研究上还缺乏深入系统的研究。

发明内容
本发明的目的在于提供一种修复DDT污染土壤的有效方法。具体而言，本发明是ー种利用紫外线-紫花苜蓿-DDT降解菌联合修复DDT污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(I)对DDT污染土壤进行紫外线照射，然后进行土壌的耕翻、平整和灌水；(2)在紫花苜蓿种子上包覆含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂；(3)对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；(4)将包衣的紫花苜蓿种子播种到DDT污染土壌中；(5)出苗后进行田间管理。步骤(I)中，优选先在DDT污染土壤表面均匀喷洒20mg/L的ニ氧化钛(TiO2)悬浮溶液，然后进行紫外线照射。还优选在紫外线照射后，在土壌表面撒施膨润土(100公斤/亩)，并在撒施膨润土 24h以内进行土壌的耕翻、平整和灌水。此外，紫外线照射的波长优选为253. 7nm，照射时间优选为lh_2h。步骤(2)中，所述紫花苜蓿种子优选成熟、饱满、无虫蛀的种子，所述DDT降解菌优选假单胞菌(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis),所述苜猜根瘤菌优选苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。步骤(2)的エ艺流程优选如下把含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后，再加入紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂，种子与菌剂的质量比为1:7-10。其中，使用的粘着剂优选为选自羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶中的I种或2种以上。步骤(3)的エ艺流程优选如下把由步骤(2)得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上ー层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。其中，所述包衣材料优选为选自滑石粉、云母粉、陶土粉中的I种或2种以上。

步骤(4)中，优选的播种条件如下播种方式为条播，播种量为I. 5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。本发明的方法能够有效进行土壤中DDT的分解、降解和吸附，减少土壤中DDT残留，并且具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点，为大面积修复DDT污染土壤提供了有效方法。


图I是表示本发明实施例具体步骤的流程图。
具体实施例方式本发明是ー种利用紫外线-生物联合修复DDT污染土壌的方法。具体而言，本发明是ー种利用紫外线-紫花苜蓿-DDT降解菌联合修复DDT污染土壌的方法，其特征在干，所述方法包括如下步骤(I)对DDT污染土壤进行紫外线照射，然后进行土壌的耕翻、平整和灌水；(2)在紫花苜蓿种子上包覆含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂；(3)对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；(4)将包衣的紫花苜蓿种子播种到DDT污染土壌中；(5)出苗后进行田间管理。本发明修复DDT污染土壤是基于如下机制进行的(I)紫外线照射可以破坏DDT分子结构，尤其当同时使用ニ氧化钛(TiO2)吋，TiO2在紫外线照射下可以进行多相光催化氧化，分解DDT，提高DDT污染土壌的修复效果；(2)利用紫花苜蓿多年生、根系发达、可生物固氮以及可对污染土壤进行修复等生物特性并结合微生物修复技术进行DDT污染土壌的生物修复，具体而言，含有DDT降解菌的菌剂通过包覆在紫花苜蓿种子上并通过包衣材料进ー步的包裹作用，牢固地结合在紫花苜蓿种子上，当种子播入土壌中后，菌剂中包括DDT降解菌在内的微生物就会随着种子的发芽、根系的生长和延伸，沿着紫花苜蓿的根系进行分布、繁殖，从而可通过DDT降解菌的微生物降解作用和紫花苜蓿的植物修复的双重作用，有效分解、降解和吸附土壤表层乃至土壌深层污染的DDT。
综上所述，本发明在紫外线的化学修复、DDT降解菌的微生物修复和紫花苜蓿的植物修复的三重作用下，可有效分解、降解和吸附土壤表层乃至土壌深层污染的DDT，从而有效减少土壌中DDT残留。本发明的方法具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点，是ー种用于大面积修复DDT污染土壌的有效方法。在上述步骤(I)中，优选先在DDT污染土壤表面均匀喷洒20mg/L的ニ氧化钛(TiO2)悬浮溶液，然后进行紫外线照射。TiO2悬浮溶液作为催化剂，其催化原理是TiO2通过紫外线照射，产生游离电子及空穴，进而产生极强氧化作用的活性氧，活性氧可氧化分解DDT,从而提高DDT污染土壤的修复效果。还优选紫外线照射后，在土壌表面撒施膨润土。膨润土(Bentonite)是以蒙脱石为主的含水粘土矿，具有膨润性、粘结性、吸附性、催化性、触变性、悬浮性以及阳离子交換等特性。向土壌中加入膨润土作为吸附剂，可以有效抑制降雨过程导致的土壌中DDT的渗滤。膨润土的用量一般为75-150公斤/亩，优选100公斤/亩。此外，优选在膨润土撒施后24 小时以内对土壤进行耕翻、平整和灌水。耕翻深度一般为15-30厘米，优选为20厘米。步骤(I)中，优选使用波长为253. 7nm的中波紫外光，照射时间优选为l_2h。在上述步骤(2)中，紫花苜蓿种子优选成熟、饱满、无虫蛀的种子。使用这样的种子，可以得到更好的土壤修复效果。另外，为了避免灰尘等对菌剂包覆的影响，优选将种子在常温的清水中进行清洗，之后自然条件下干燥。苜蓿根瘤菌是与苜蓿共生形成根瘤并将空气中的氮还原成氨供植物营养的ー类革兰氏阴性菌。通过在菌剂中加入苜蓿根瘤菌，可促进紫花苜蓿根系的生长和固氮，从而提高土壤的修复效果。作为苜猜根瘤菌，优选苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。对使用的DDT降解菌没有特别限制，可以列举吉氏拟杆菌(Bacteroidesdistasonis)、假单胞菌(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、金孢展齿革菌(Phanerochaete Chrysosprium Burdsall)等，但从适应农药能力以及易诱发突变的角度来讲，优选假单胞菌。假单胞菌降解DDT的主要机理为通过自然突变形成新的变种，并由基因调控产生诱导酶，在新的微生物酶作用下产生与环境相适应的代谢功能，从而对DDT进行降解。另外，还可以在菌剂中添加鞘氨醇单胞菌。鞘氨醇单胞菌是在环境保护及エ业生产方面具有巨大应用潜力的一类细菌，对芳香化合物有极为广泛的代谢能力。作为菌剂，例如可以分别将苜蓿中华根瘤菌在YMA液体培养基中、假单胞菌在LB液体培养基中、鞘氨醇单胞菌在LB液体培养基中进行培养，收集各菌后进行混合，得到复合菌剂。各菌的混合比(质量比)优选为，苜蓿中华根瘤菌假单胞菌鞘氨醇单胞菌=1 5 8 :4飞，更优选为I 8 :6。对步骤(2)的具体エ艺没有特别限制，但优选使用如下方法把含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后，再加入紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂。通过使用该方法，菌剂可通过粘着剂的作用牢固地粘附于种子上，菌剂在播种过程中不易从种子上脱落，播种后菌剂中的微生物可有效地沿着紫花苜蓿的根系进行分布、繁殖，从而提高了土壌的生物修复效果。在上述方法中，种子与菌剂的质量比优选为1:7-10，更优选为I :8。对使用的粘着剂没有特别限制，但从防止土壤污染的角度来讲，优选来源于植物或动物的粘着剂或者对这些粘着剂进行改性得到的粘着剤。作为这样的粘着剤，可以列举羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶等。这些粘着剂可单独使用或两种以上混合使用。对步骤(3)的具体エ艺没有特别限制，但优选使用如下方法把由步骤(2)得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上ー层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。通过使用该方法，可以使包衣材料均匀地包裹在种子外粘附的菌剂上，从而更有效地改善了菌剂与种子之间的复合作用，提高土壌的生物修复效果。对使用的包衣材料没有特别限制，但从防止土壤污染的角度来讲，优选天然的矿物质材料。作为这样的包衣材料，可以列举滑石粉、云母粉、陶土粉等。这些包衣材料可单独使用或两种以上混合使用。从材料来源广泛、价格便宜的角度来讲，优选滑石粉。步骤(4)的播种条件优选如下播种方式为条播，播种量为I. 5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。 步骤(5)中的田间管理是指及时的灌水、杂草防除和病虫害防治等。实施例下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实验分析所用的农药标准品0，p’ -DDT、p，p’ -DDT标准样品，纯度〉99%，均购自美国Supelco公司。实验分析方法采用《土壤类型与污染浓度对漆酶修复DDT污染土壤的影响》(生态环境，2008年17卷第2期，611-614页)。具体步骤如下(如图I所示)①DDT污染土壌制作试验地选择在大连民族学院环境与资源学院实验基地，试验地面积50平方米，2011年7月10日用含有下述DDT异构体的溶液(总浓度为0. 18mg/kg)进行均匀喷洒:0，p，-DDT (终浓度0. 08mg/kg)、p，p，-DDT (终浓度0. lmg/kg)。随机取5个土样进行DDT分析。②DDT污染土壤处理和耕作先对DDT污染土壤表面均匀喷洒20mg/L的ニ氧化钛(TiO2)悬浮溶液(TiO2粒径15nm，锦州市朋大钛白粉制造有限公司生产)，然后进行紫外线照射，照射波长为253. 7nm，照射时间为2h。紫外线照射后，在土壌表面撒施膨润土 100公斤/亩，之后进行20厘米耕翻、平整和灌水。③紫花苜蓿种子的筛选、清洗和干燥筛选成熟、饱满、无虫蛀的公农一号紫花苜宿(Medicago sativa L. cv. Gongnong NO. I)种子0. 15公斤(购自吉林省农业科学院畜牧科学分院草地研究所)，在常温的清水中进行清洗后，自然条件下干燥。④菌株培养和菌剂制作取苜猜中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(购自上海艾研生物科技有限公司)、假单胞菌(Pseudomonas)(购自上海志研生物科技有限公司)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(购自上海抚生实业有限公司),分别在28°C的条件下于液体培养基中摇床培养48h后，收集各菌，混合各菌得到复合菌剂。所用菌株和使用的培养基为苜蓿中华根瘤菌-YMA液体培养基(80ml)、假单胞菌-LB液体培养基(640ml)、鞘氨醇单胞菌-LB液体培养基(480ml);苜蓿中华根瘤菌假单胞菌鞘氨醇单胞菌(质量比)=1 8 :6。⑤包覆菌剂粘着剂使用羟甲基纤维素钠，取上述复合菌剂(约1200克)加入到质量浓度为5%的羟甲基纤维素钠水溶液(IOOOml)中，搅拌均匀后，再加入种子，反复搅拌，使每一粒种子都粘有复合菌剂。⑥种子包衣包衣材料为滑石粉，把上述粘附有复合菌剂的种子放入到装有滑石粉的包衣机中，经过包衣机反复震荡混合包衣，使姆一粒种子都裹上ー层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。⑦播种2011年7月11日进行条播播种，播种量I. 5-2公斤/亩，播种深度2-3厘米。 ⑧田间管理出苗后及时进行灌水、杂草防除和病虫害防治。检测分析结果如下2011年11月10日随机取5个土样进行DDT消解分析，土壤中o，p’-DDT、p，p’-DDT的含量降低幅度分别为38. 52%和34. 28%，总平均降幅36. 40% ；2012年7月10曰随机取5个土样进行DDT消解分析，土壤中O，p’ -DDT、p，p’ -DDT的含量降低幅度分别为45. 39%和40. 07%,总平均降幅42. 73% ;说明本发明的方法能够有效修复DDT污染土壌。
权利要求
1.一种利用紫外线-紫花苜蓿-DDT降解菌联合修复DDT污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (1)对DDT污染土壤进行紫外线照射，然后进行土壤的耕翻、平整和灌水； (2)在紫花苜蓿种子上包覆含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂； (3)对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣； (4)将包衣的紫花苜蓿种子播种到DDT污染土壤中； (5)出苗后进行田间管理。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，先在DDT污染土壤表面均匀喷洒20mg/L的二氧化钛悬浮溶液，然后进行紫外线照射。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，紫外线照射后，在土壤表面撒施膨润土，膨润土用量为100公斤/亩，撒施膨润土 24h以内进行所述土壤的耕翻、平整和灌水。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，紫外线照射的波长为253. 7nm，照射时间为lh_2h。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述紫花苜蓿种子为成熟、饱满、无虫蛀的种子。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DDT降解菌为假单胞菌和鞘氨醇单胞菌。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述苜蓿根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)的工艺流程如下把含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后,再加入紫花苜蓿种子,反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂，种子与菌剂的质量比为1:7-10。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述粘着剂为选自羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶中的I种或2种以上。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)的工艺流程如下把由步骤(2)得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上一层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述包衣材料为选自滑石粉、云母粉、陶土粉中的I种或2种以上。
12.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，播种方式条播，播种量为I.5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。
全文摘要
本发明公开了一种利用紫外线-紫花苜蓿-DDT降解菌联合修复DDT污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)对DDT污染土壤进行紫外线照射，然后进行土壤的耕翻、平整和灌水；(2)在紫花苜蓿种子上包覆含有DDT降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂；(3)对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；(4)将包衣的紫花苜蓿种子播种到DDT污染土壤中；(5)出苗后进行田间管理。本发明能够有效进行土壤中DDT的分解、降解和吸附，减少土壤中DDT残留，并且具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点。
文档编号B09C1/00GK102764758SQ20121027368
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者刘淼, 姜健, 杨宝灵, 温小红, 王冰, 范方 申请人:大连民族学院