本发明涉及土壤修复技术领域，具体是一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺。
背景技术：
石油污染土壤的生物修复技术根据具体操作以及菌种的来源可以分为自然衰减法、生物刺激法和生物强化法。自然衰减和生物刺激对污染物降解效率低，且易产生迁移性能更强的中间代谢产物，因此应用越来越少。通过微生物操作筛选能够高效降解石油烃污染物的微生物，并作为外源高效菌种添加到污染土壤中，降解转化石油烃污染物的方法，即为生物强化法。
理论上生物强化修复技术可以通过添加外来高效石油烃降解菌来实现石油烃的高效去除。但由于石油烃组成复杂，毒性强，且其生物可利用度较低等原因，使得原位生物强化修复的效率低。同时，外加菌种受生态系统中环境因素的复杂性和波动性的冲击，接种微生物生物数量和活性迅速降低至无法达到预期目标；换言之，外源微生物的生存能力、活性和迁移能力与环境因素之间的关系直接决定着生物强化修复的治理效果。制约生物强化修复技术发展的主要生态原因有生物因素和非生物因素两种。多数非生物因素可通过工程措施，如调控土壤含水量、ph，添加有机碳源和无机营养物等进行调控；在生物强化修复过程中，受土壤多相复杂结构的限制，外源微生物在土壤中迁移困难，造成微生物无法与污染物有效接触并摄取污染物，微生物对污染物摄取困难是原位生物修复的一个瓶颈。
本发明旨在提供一种微生物与植物联合协作，以提高石油污染土壤的修复效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种测定免疫水平的诊断制剂及其制备方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选；
(2)将步骤(1)所得微生物与海藻酸钠溶液混合，并加入壳聚糖溶液、交联剂和棉花种子，搅拌反应后，制得改性棉花种子；
(3)将肥料缓释剂加入被石油污染的土壤中，并控制土壤含水量，静置反应；
(4)将步骤(2)所得改性棉花种子施入经步骤(3)处理的被石油污染的土壤中，控制土壤含水量，培养6～9个月。
作为优化，所述石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，主要处理步骤如下：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选：
(a)初筛：将1～5g被石油污染的土壤接入100～300ml细菌培养液中，于温度为为30℃的条件下恒温培养30h，得混合培养液，取5～10ml混合培养液接入200ml混合无机盐培养基中，于温度为30℃的条件下恒温培养2～3h后，得富集培养液，将富集培养液涂布于固体平板细菌培养基上，待长出菌落后划线培养，分离得降解石油微生物坯料；
(b)复筛：将步骤(a)所得降解石油微生物坯料接种入降油培养基中，于温度为30℃的条件下混合培养7天后，分离，得降解石油微生物；
(2)将步骤(1)所得降解石油微生物与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按质量比1：80混合，并加入海藻酸钠溶液质量0.15～0.30倍的壳聚糖和海藻酸钠溶液质量0.3～0.4倍的棉花种子，搅拌混合后，再依次加入海藻酸钠溶液质量0.02～0.10倍的氯化钙和海藻酸钠溶液质量0.04倍的戊二醛，搅拌反应后，过滤，干燥，得改性棉花种子；
(3)将肥料缓释剂按0.5～1.0kg/m2的使用量施入被石油污染的土壤中，控制土壤含水量为25％，持续反应5～7天；
(4)将步骤(2)所得改性棉花种子按0.1～0.2kg/m2的使用量施入经步骤(3)所处理的被石油污染的土壤中，控制被石油污染土壤的含水量为10％，培养6～9个月。
作为优化，步骤(1)所述细菌培养液为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.1～0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.1～0.3倍的胰蛋白胨和葡萄糖质量0.1倍的琼脂，搅拌混合后，灭菌，得细菌培养液。
作为优化，其特征在于，步骤(1)所述混合无机培养基为将琼脂与水按质量比1:50混合，并加入琼脂质量0.2倍的磷酸二氢钾，琼脂质量0.1倍的硫酸镁，琼脂质量0.08倍的硫酸亚铁，琼脂质量0.06倍的硝酸铵和琼脂质量0.5倍的石油，搅拌混合，得混合无机盐培养基。
作为优化，步骤(1)所述降油培养基为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.1～0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨，葡萄糖质量0.1倍的琼脂和葡萄糖质量00.5倍的石油，搅拌混合，得降油培养基。
作为优化，步骤(3)所述肥料缓释剂为将胆固醇与吡啶按质量比1:35混合，并加入胆固醇质量0.8倍的丁二酸酐，搅拌反应后，减压蒸馏，得胆固醇-丁二酸酯，将胆固醇-丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：40混合，并加入胆固醇-丁二酸酯质量10倍的氯化亚砜，搅拌反应后，旋蒸浓缩，得胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液；将葡聚糖与二甲基亚砜按质量比1：120混合，并以3～5ml/min的速率滴入葡聚糖质量0.3～0.8倍的胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液，搅拌反应后，透析，得改性葡聚糖；将改性葡聚糖与聚乳酸按质量比1:1混合，并加入改性葡聚糖质量5～10倍的二甲基亚砜，搅拌反应后，得肥料缓释剂坯料，将肥料缓释剂坯料先于水中透析3h后，再于质量分数为30％的过磷酸钙与碳酸氢铵的混合溶液中透析6h后，过滤，干燥，得肥料缓释剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明在修复石油污染土壤的工艺中先使用自制肥料缓释剂处理污染土壤，然后加入经微生物改性的棉花种子进行修复；首先，在被石油污染的土壤中加入自制肥料缓释剂可有效提高土壤中氮元素和磷元素的含量，从而提高土壤的肥力，并使土壤中的微生物对石油进行初次降解，从而提高修复效果；并且，肥料缓释剂外壳中含有可降解聚乳酸，在外壳经降解破裂后，内层含有疏水基团和亲水基团的葡聚糖暴露，从而可将部分石油迁移至土壤上层，进而进一步提高修复效果；其次，在修复工艺中加入改性棉花种子，一方面，棉花种子作为根系植物具有良好的降解性能，从而可进一步提高修复效果，并且，棉花种子在自制肥料缓释剂的作用下可加速生长，进一步提高了修复效率，另一方面，棉花种子在经过改性后，棉花种子表面在海藻酸钠和壳聚糖的作用下可固着降油微生物，从而在施入被石油污染的土地中后，可快速分解种子周围的石油，促进棉花生长，进一步提高吸附效果，并且种子表面覆盖的海藻酸钠和壳聚糖，在降解后可作为微生物和种子生长所需的营养，进而可进一步提高修复效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中经石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺修复后的土壤的各指标测试方法如下：
含油率：将各实施例修复后的土壤与对比例修复厚度土壤用红外测油机测试没100g土壤中的含有率，分别测试1个月、3个月和6个月后的土壤含油率。
实施例1
一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选；
(2)将步骤(1)所得微生物与海藻酸钠溶液混合，并加入壳聚糖溶液、交联剂和棉花种子，搅拌反应后，制得改性棉花种子；
(3)将肥料缓释剂加入被石油污染的土壤中，并控制土壤含水量，静置反应；
(4)将步骤(2)所得改性棉花种子施入经步骤(3)处理的被石油污染的土壤中，控制土壤含水量，培养6个月。
作为优化，所述石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，主要处理步骤如下：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选：
(a)初筛：将5g被石油污染的土壤接入200ml细菌培养液中，于温度为为30℃的条件下恒温培养30h，得混合培养液，取10ml混合培养液接入200ml混合无机盐培养基中，于温度为30℃的条件下恒温培养2h后，得富集培养液，将富集培养液涂布于固体平板细菌培养基上，待长出菌落后划线培养，分离得降解石油微生物坯料；
(b)复筛：将步骤(a)所得降解石油微生物坯料接种入降油培养基中，于温度为30℃的条件下混合培养7天后，分离，得降解石油微生物；
(2)将步骤(1)所得降解石油微生物与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按质量比1：80混合于烧杯中，并向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.18倍的壳聚糖和海藻酸钠溶液质量0.3倍的棉花种子，于温度为30℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合80min后，再依次向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.04倍的氯化钙和海藻酸钠溶液质量0.04倍的戊二醛，于温度为32℃，转速为280r/min的条件下搅拌反应4h后，过滤，得滤饼，将滤饼于温度为38℃的条件下干燥10h，得改性棉花种子；
(3)将肥料缓释剂按0.7kg/m2的使用量施入被石油污染的土壤中，控制土壤含水量为25％，持续反应5天；
(4)将步骤(2)所得改性棉花种子按0.2kg/m2的使用量施入经步骤(3)所处理的被石油污染的土壤中，控制被石油污染土壤的含水量为10％，培养6个月。
作为优化，步骤(1)所述细菌培养液为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨和葡萄糖质量0.1倍的琼脂，搅拌混合后，灭菌，得细菌培养液。
作为优化，其特征在于，步骤(1)所述混合无机培养基为将琼脂与水按质量比1:50混合，并加入琼脂质量0.2倍的磷酸二氢钾，琼脂质量0.1倍的硫酸镁，琼脂质量0.08倍的硫酸亚铁，琼脂质量0.06倍的硝酸铵和琼脂质量0.5倍的石油，搅拌混合，得混合无机盐培养基。
作为优化，步骤(1)所述降油培养基为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.2倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨，葡萄糖质量0.1倍的琼脂和葡萄糖质量00.5倍的石油，搅拌混合，得降油培养基。
作为优化，步骤(3)所述肥料缓释剂为将胆固醇与吡啶按质量比1:35混合，并加入胆固醇质量0.8倍的丁二酸酐，搅拌反应后，减压蒸馏，得胆固醇-丁二酸酯，将胆固醇-丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：40混合，并加入胆固醇-丁二酸酯质量10倍的氯化亚砜，搅拌反应后，旋蒸浓缩，得胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液；将葡聚糖与二甲基亚砜按质量比1：120混合，并以5ml/min的速率滴入葡聚糖质量0.5倍的胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液，搅拌反应后，透析，得改性葡聚糖；将改性葡聚糖与聚乳酸按质量比1:1混合，并加入改性葡聚糖质量10倍的二甲基亚砜，搅拌反应后，得肥料缓释剂坯料，将肥料缓释剂坯料先于水中透析3h后，再于质量分数为30％的过磷酸钙与碳酸氢铵的混合溶液中透析6h后，过滤，干燥，得肥料缓释剂。
实施例2
一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选；
(2)将步骤(1)所得微生物与海藻酸钠溶液混合，并加入壳聚糖溶液、交联剂和棉花种子，搅拌反应后，制得改性棉花种子；
(3)将步骤(2)所得改性棉花种子施入被石油污染的土壤中，控制土壤含水量，培养6个月。
作为优化，所述石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，主要处理步骤如下：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选：
(a)初筛：将5g被石油污染的土壤接入200ml细菌培养液中，于温度为为30℃的条件下恒温培养30h，得混合培养液，取10ml混合培养液接入200ml混合无机盐培养基中，于温度为30℃的条件下恒温培养2h后，得富集培养液，将富集培养液涂布于固体平板细菌培养基上，待长出菌落后划线培养，分离得降解石油微生物坯料；
(b)复筛：将步骤(a)所得降解石油微生物坯料接种入降油培养基中，于温度为30℃的条件下混合培养7天后，分离，得降解石油微生物；
(2)将步骤(1)所得降解石油微生物与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按质量比1：80混合于烧杯中，并向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.18倍的壳聚糖和海藻酸钠溶液质量0.3倍的棉花种子，于温度为30℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合80min后，再依次向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.04倍的氯化钙和海藻酸钠溶液质量0.04倍的戊二醛，于温度为32℃，转速为280r/min的条件下搅拌反应4h后，过滤，得滤饼，将滤饼于温度为38℃的条件下干燥10h，得改性棉花种子；
(3)将步骤(2)所得改性棉花种子按0.2kg/m2的使用量施入被石油污染的土壤中，控制被石油污染土壤的含水量为10％，培养6个月。
作为优化，步骤(1)所述细菌培养液为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨和葡萄糖质量0.1倍的琼脂，搅拌混合后，灭菌，得细菌培养液。
作为优化，其特征在于，步骤(1)所述混合无机培养基为将琼脂与水按质量比1:50混合，并加入琼脂质量0.2倍的磷酸二氢钾，琼脂质量0.1倍的硫酸镁，琼脂质量0.08倍的硫酸亚铁，琼脂质量0.06倍的硝酸铵和琼脂质量0.5倍的石油，搅拌混合，得混合无机盐培养基。
作为优化，步骤(1)所述降油培养基为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.2倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨，葡萄糖质量0.1倍的琼脂和葡萄糖质量00.5倍的石油，搅拌混合，得降油培养基。
实施例3
一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选；
(2)将步骤(1)所得微生物与海藻酸钠溶液混合，并加入壳聚糖溶液、交联剂和腐殖酸，搅拌反应后，制得改性腐殖酸；
(3)将肥料缓释剂加入被石油污染的土壤中，并控制土壤含水量，静置反应；
(4)将步骤(2)所得改性腐殖酸施入经步骤(3)处理的被石油污染的土壤中，控制土壤含水量，培养6个月。
作为优化，所述石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，主要处理步骤如下：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选：
(a)初筛：将5g被石油污染的土壤接入200ml细菌培养液中，于温度为为30℃的条件下恒温培养30h，得混合培养液，取10ml混合培养液接入200ml混合无机盐培养基中，于温度为30℃的条件下恒温培养2h后，得富集培养液，将富集培养液涂布于固体平板细菌培养基上，待长出菌落后划线培养，分离得降解石油微生物坯料；
(b)复筛：将步骤(a)所得降解石油微生物坯料接种入降油培养基中，于温度为30℃的条件下混合培养7天后，分离，得降解石油微生物；
(2)将步骤(1)所得降解石油微生物与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按质量比1：80混合于烧杯中，并向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.18倍的壳聚糖和海藻酸钠溶液质量0.3倍的腐殖酸，于温度为30℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合80min后，再依次向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.04倍的氯化钙和海藻酸钠溶液质量0.04倍的戊二醛，于温度为32℃，转速为280r/min的条件下搅拌反应4h后，过滤，得滤饼，将滤饼于温度为38℃的条件下干燥10h，得改性腐殖酸；
(3)将肥料缓释剂按0.7kg/m2的使用量施入被石油污染的土壤中，控制土壤含水量为25％，持续反应5天；
(4)将步骤(2)所得改性腐殖酸按0.2kg/m2的使用量施入经步骤(3)所处理的被石油污染的土壤中，控制被石油污染土壤的含水量为10％，培养6个月。
作为优化，步骤(1)所述细菌培养液为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨和葡萄糖质量0.1倍的琼脂，搅拌混合后，灭菌，得细菌培养液。
作为优化，其特征在于，步骤(1)所述混合无机培养基为将琼脂与水按质量比1:50混合，并加入琼脂质量0.2倍的磷酸二氢钾，琼脂质量0.1倍的硫酸镁，琼脂质量0.08倍的硫酸亚铁，琼脂质量0.06倍的硝酸铵和琼脂质量0.5倍的石油，搅拌混合，得混合无机盐培养基。
作为优化，步骤(1)所述降油培养基为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.2倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨，葡萄糖质量0.1倍的琼脂和葡萄糖质量00.5倍的石油，搅拌混合，得降油培养基。
作为优化，步骤(3)所述肥料缓释剂为将胆固醇与吡啶按质量比1:35混合，并加入胆固醇质量0.8倍的丁二酸酐，搅拌反应后，减压蒸馏，得胆固醇-丁二酸酯，将胆固醇-丁二酸酯与三氯甲烷按质量比1：40混合，并加入胆固醇-丁二酸酯质量10倍的氯化亚砜，搅拌反应后，旋蒸浓缩，得胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液；将葡聚糖与二甲基亚砜按质量比1：120混合，并以5ml/min的速率滴入葡聚糖质量0.5倍的胆固醇-丁二酸酯酰氯溶液，搅拌反应后，透析，得改性葡聚糖；将改性葡聚糖与聚乳酸按质量比1:1混合，并加入改性葡聚糖质量10倍的二甲基亚砜，搅拌反应后，得肥料缓释剂坯料，将肥料缓释剂坯料先于水中透析3h后，再于质量分数为30％的过磷酸钙与碳酸氢铵的混合溶液中透析6h后，过滤，干燥，得肥料缓释剂。
对比例
一种石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选；
(2)将步骤(1)所得微生物与海藻酸钠溶液混合，并加入壳聚糖溶液、交联剂和腐殖酸，搅拌反应后，制得改性腐殖酸；
(3)将步骤(2)所得改性腐殖酸施入被石油污染的土壤中，控制土壤含水量，培养6个月。
作为优化，所述石油污染土壤微生物及植物联合原位修复工艺，主要处理步骤如下：
(1)取被石油污染的土壤进行菌群筛选：
(a)初筛：将5g被石油污染的土壤接入200ml细菌培养液中，于温度为为30℃的条件下恒温培养30h，得混合培养液，取10ml混合培养液接入200ml混合无机盐培养基中，于温度为30℃的条件下恒温培养2h后，得富集培养液，将富集培养液涂布于固体平板细菌培养基上，待长出菌落后划线培养，分离得降解石油微生物坯料；
(b)复筛：将步骤(a)所得降解石油微生物坯料接种入降油培养基中，于温度为30℃的条件下混合培养7天后，分离，得降解石油微生物；
(2)将步骤(1)所得降解石油微生物与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按质量比1：80混合于烧杯中，并向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.18倍的壳聚糖和海藻酸钠溶液质量0.3倍的腐殖酸，于温度为30℃，转速为300r/min的条件下搅拌混合80min后，再依次向烧杯中加入海藻酸钠溶液质量0.04倍的氯化钙和海藻酸钠溶液质量0.04倍的戊二醛，于温度为32℃，转速为280r/min的条件下搅拌反应4h后，过滤，得滤饼，将滤饼于温度为38℃的条件下干燥10h，得改性腐殖酸；
(4)将步骤(2)所得改性腐殖酸按0.2kg/m2的使用量施入被石油污染的土壤中，控制被石油污染土壤的含水量为10％，培养6个月。
作为优化，步骤(1)所述细菌培养液为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.3倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨和葡萄糖质量0.1倍的琼脂，搅拌混合后，灭菌，得细菌培养液。
作为优化，其特征在于，步骤(1)所述混合无机培养基为将琼脂与水按质量比1:50混合，并加入琼脂质量0.2倍的磷酸二氢钾，琼脂质量0.1倍的硫酸镁，琼脂质量0.08倍的硫酸亚铁，琼脂质量0.06倍的硝酸铵和琼脂质量0.5倍的石油，搅拌混合，得混合无机盐培养基。
作为优化，步骤(1)所述降油培养基为将葡萄糖与水按质量比1:10混合，并加入葡萄糖质量0.2倍的氯化钠，葡萄糖质量0.2倍的胰蛋白胨，葡萄糖质量0.1倍的琼脂和葡萄糖质量00.5倍的石油，搅拌混合，得降油培养基。
效果例
下表1给出了采用本发明实施例1至3修复工艺修复后的土壤与对比例工艺修复后的土壤的含有率分析结果。
表1
从表1中实施例1与对比例的实验数据比较可发现，在修复工艺中加入改性棉花种子和自制废料缓释剂可有效减少土壤中石油的含量，从而提高修复效果；从实施例1与实施例2的实验数据比较可发现，当在修复工艺中不事先使用肥料缓释剂对被室友污染的土壤进行处理时，土壤中石油含量过高，肥力较低，导致施入改性棉花种子后，种子生长受到影响，从而降低修复效果；从实施例1与实施例3的实验数据比较可发现，当在修复工艺中用腐殖酸代替棉花种子时，由于腐殖酸缺乏生物活性，在施入被石油污染的土壤中后，只能对施入区域的土壤进行修复，无法修复土壤内层，因此降低修复工艺的修复效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。