一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜及其制备和应用的制作方法

本发明属于含磷蛋白质分离膜及其制备和应用领域，特别涉及一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜及其制备方法和应用。
背景技术：
：pvdf由于其优良的物理和化学性能(强度和耐腐蚀性)，可以作为优秀的蛋白质分离膜的基材，与固定金属螯合亲和层析技术相结合，不但能提高膜的物理性能便于改性，从而提高生产效率和分离效果。固定化金属螯合亲和层析技术(immobilizedmetal-chelatedaffinitychromatography，imac)是近年来出现的一种新型亲和层析技术，主要用于生物大分子的分离。1975年paroth提出这项技术，引起了广泛的关注，该方法利用的是蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。相对于传统的分离蛋白质技术，如凝胶过滤层析、吸附层析、离子交换层析等，亲和层析技术优点在于其在蛋白质的分离纯化过程中具有选择性和特异性，可以在某些复杂的环境中快速、简便、有针对性地得到纯度高的目标蛋白。正因如此，固定化金属螯合亲和层析技术越来越得到重视，除了应用在蛋白质检测、分离纯化外，还应用于蛋白质的定向固定、联用技术应用、蛋白质的复性与纯化、核酸的分离纯化、基因工程技术等。中国专利cn2007100129667公开了一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用而将钛离子固定于载体上，使用固定钛离子亲合色谱材料富集磷酸肽，磷酸肽由于与固定的钛离子之间的强螯合作用而保留在亲和色谱材料上使其获得分离，但固相载体大多为微球，生产控制比较困难，难以应用于实际生产。中国专利cn2017101304648公开了一种双功能亲和有机聚合基质毛细管整体柱的制备方法。该方法将含硼酸基团的单体、含磷酸基团的单体、交联剂、致孔剂、引发剂于室温下超声至完全溶解，再注入经乙烯基改性的石英毛细管内，经过处理制得毛细管整体柱。但分离效果有限，效果并不明显。中国专利cn2016103848454的发明属分析化学领域，涉及利用钛固定化磁微球萃取技术从生物样品中富集磷酸化合物的方法。该方法采用钛固定化磁微球的功能化磁性复合材料，在提取富集过程通过外部磁场的施加达到快速分离；对钛固定化磁微球活化后上样，采用一定的溶剂清洗和洗脱，提取生物样品中的磷酸化合物，经氮吹浓缩，以一定的溶剂复溶后用高效液相串联质谱或气相串联质谱分析，测定生物样品中磷酸化合物的含量。使用后的钛固定化磁微球经再生溶剂清洗后可重复使用。但微球的机械性能较差，重复使用率不高，同时化学性能不稳定。中国专利cn2008102117279涉及一种功能化修饰的开管毛细管柱离线及在线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法：制备一种内壁具有可选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质的磷酸锆功能基团的开管毛细管柱，负载样品后可以对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行富集，再利用清洗缓冲液除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白质和盐，然而开管毛细管柱的制造成本过高，同时效果不明显。中国专利cn2007101575241涉及磷酸化肽的高选择性富集，具体的说是一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法。本方法采用带有磷酸基团的单体进行聚合反应直接形成带有磷酸基团的聚合物材料。该材料用含锆离子的溶液作用后生成磷酸酯锆基团，使其可以从复杂的蛋白酶解液中特异地富集和纯化磷酸肽。但含磷酸基团单体聚合物的聚合程度不够高，物理化学结果不稳定，难以用于实际生产。因此，开发一种物理化学性能稳定，工艺简单，安全环保并便于工业生产的含磷蛋白质分离膜制备方法极具现实意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜及其制备和应用，以克服现有技术中传统固定金属螯合亲和微球磷酸化过程中使用高危险药品，且其机械性能差、不能多次反复吸附、成本高、效率慢等、特异吸附能力不高等缺陷。本发明采用了热致相分离与硅烷界面交联技术，有效解决了固定金属螯合亲和技术效率低，成本高的问题，提高了对于含磷蛋白的特异性吸附，提高了实验的安全性，应用前景广阔。本发明的一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜，所述膜是由乙烯基磷酸/乙烯基三乙氧基硅烷改性的pvdf膜固定金属锆得到。所述乙烯基磷酸/乙烯基三乙氧基硅烷改性的pvdf膜的制备方法包括：将乙烯基磷酸vpa与乙烯基三乙氧基硅烷vtes溶解于磷酸三乙酯与水混合溶液中，加入引发剂，得到预聚物，然后将pvdf膜浸没于预聚物中。所述乙烯基磷酸/乙烯基三乙氧基硅的结构式为：本发明的一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜的制备方法，包括：(1)将聚偏氟乙烯pvdf溶解在磷酸三乙酯中，搅拌，将得到的铸膜液静置，刮膜，刮完后迅速将带有铸膜液的玻璃板放入磷酸三乙酯与水的混合凝固浴中凝固(通过改变磷酸三乙酯与水的混合比例调控pvdf膜的结构)，再将其拿出放入纯水凝固浴中继续凝固，得到pvdf膜，其中铸膜液中pvdf的质量分数为15～18％；(2)将乙烯基磷酸vpa与乙烯基三乙氧基硅烷vtes溶解于磷酸三乙酯与水混合溶液中，加入引发剂，搅拌，得到含有磷酸基团的乙烯基预聚物溶液；将步骤(1)中pvdf膜浸没于含有磷酸基团的乙烯基预聚物溶液中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜，其中vpa、vtes、磷酸三乙酯与水混合溶液与引发剂质量比为2～4.5:1～5:100:0.05～0.09；(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于氯氧化锆溶液中固定金属锆，将得到的膜清洗(用去离子水)，烘干，得到固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜，其中氯氧化锆溶液的浓度为50～100mm。所述步骤(1)中搅拌温度为60～80℃，搅拌时间为8～10h。所述步骤(1)中静置时间为10～12h。所述步骤(1)中刮膜为：将铸膜液、刮膜板和玻璃板加热到50～80℃，并进行刮膜。所述步骤(1)中磷酸三乙酯与水的混合凝固浴中磷酸三乙酯与水的质量比为1:1～4:1。所述步骤(1)中凝固时间为5～60s；继续凝固时间为20～24h。所述步骤(2)中磷酸三乙酯与水混合溶液中磷酸三乙酯与水质量比为0.95～1.2:1。所述步骤(2)中引发剂为偶氮二异丁晴。所述步骤(2)中搅拌温度为60～80℃，搅拌时间为12-24h；浸没时间为3～8h。所述步骤(3)中浸没时间为8～24h。本发明的一种固定锆硅烷界面改性聚偏氟乙烯膜的应用。本发明的制备过程如下：配置一定浓度的pvdf溶液，在一定的温度下进行刮膜，先放入磷酸三乙酯与水的融合凝固浴中，再放入纯水的凝固浴中；同时将乙烯基磷酸与乙烯基三乙氧基硅烷按一定含量溶解在磷酸三乙酯与水的混合溶液中，加入引发剂，在一定温度下聚合一段时间，得到预聚物溶液；再将之前制备好的pvdf膜放入预聚物溶液中，浸没一段时间，再将其放入一定含量的氯氧化锆中一段时间，最后将所制备的膜清洗烘干，即得到固定金属锆乙烯基硅烷界面改性pvdf膜。本发明通过热致相分离和混合凝固浴的方法制成pvdf膜，采用乙烯基磷酸与乙烯基三乙氧基硅烷聚合以及硅烷界面交联的方式，然后通过磷酸基团固定金属锆，从而改性pvdf膜。有益效果(1)本发明采用了硅烷界面交联技术改性了pvdf膜，有效的提高了pvdf膜的亲和性，并赋予其磷酸基团。(2)本发明采用了固定金属螯合亲和层析技术与膜分离技术相结合，不但拥有对特异性蛋白的优异的吸附效果，同时提高了分离效率，降低了生产成本。(3)本发明采用了乙烯基磷酸与乙烯基三乙氧基硅烷聚合的方法进行硅烷界面交联技术来提高磷酸基团，极大避免了比较危险的磷酸化过程，提高了实验的安全性。(4)本发明所制备的亲和膜能用来分离吸附多种含磷蛋白质、生物酶以及其它生物制品，在蛋白质吸附领域有潜在的应用前景。附图说明图1是实施例7中pvdf膜(a)和pvdf/vpa-g-vtes膜(b)的红外光谱图；图2是实施例7中不同阶段的pvdf膜的上表面(a1，b1，c1)和下表面(a2，b2，c2)的sem图，其中a1和a2为pvdf膜，b1和b2为pvdf/vpa-g-vtes膜，c1和c2为zr+pvdf/vpa-g-vtes膜；图3是实施例7中pvdf膜(a)、pvdf/vpa-g-vtes膜(b)和zr+pvdf/vpa-g-vtes膜(c)的xrd谱图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实验材料来源如表1所示：表1材料名称规格生产厂家聚偏氟乙烯(pvdf)6020苏威(上海)有限公司乙烯基膦酸(vpa)分析纯阿拉丁化学试剂有限公司乙烯基三乙氧基硅烷(vtes)高纯国药集团化学试剂有限公司磷酸三乙脂(tep)分析纯国药集团化学试剂有限公司偶氮二异丁腈(aibn)化学纯国药集团化学试剂有限公司聚乙烯吡咯烷酮(pvp)化学纯国药集团化学试剂有限公司卵清蛋白生化试剂阿拉丁化学试剂有限公司实施例1(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为18％的pvdf溶液，在60℃的条件下溶解8h后，铸膜液静置10h倒在50℃刮膜板上，用300μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为1:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固20h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)60℃下将2g乙烯基磷酸(vpa)、1g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.05g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合12h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于50mmzrocl2的溶液中8h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构，将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为0.06％，其对卵清蛋白的吸附量为8.3mg/g。实施例2(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为18％的pvdf溶液，在65℃的条件下溶解8h后，铸膜液静置10h倒在60℃刮膜板上，用300μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为1:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)65℃下将2.5g乙烯基磷酸(vpa)、1.5g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.06g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合16h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于50mmzrocl2的溶液中12h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为1.529％，其对卵清蛋白的吸附量为10.5mg/g。实施例3(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在70℃的条件下溶解9h后铸膜液静置10h倒在60℃刮膜板上，用500μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为2:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)70℃下将2.5g乙烯基磷酸(vpa)、1.5g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.06g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于75mmzrocl2的溶液中16h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为2.34％，其对卵清蛋白的吸附量为21.1mg/g。实施例4(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在80℃的条件下溶解10h后铸膜液静置12h倒在70℃刮膜板上，用500μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为2:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)70℃下将3g乙烯基磷酸(vpa)、2g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.07g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于75mmzrocl2的溶液中20h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为4.32％，其对卵清蛋白的吸附量为34.5mg/g。实施例5(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在80℃的条件下溶解10h后铸膜液静置12h倒在70℃刮膜板上，用500μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为3:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)70℃下将3g乙烯基磷酸(vpa)、3g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.06g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于100mmzrocl2的溶液中20h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为4.462％，其对卵清蛋白的吸附量为38.8mg/g。实施例6(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在80℃的条件下溶解10h后铸膜液静置10h倒在60℃刮膜板上，用500μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为3:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)70℃下将3.5g乙烯基磷酸(vpa)、4g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.08g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中3h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于100mmzrocl2的溶液中20h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为6.750％，其对卵清蛋白的吸附量为53.8mg/g。实施例7(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在80℃的条件下溶解10h后铸膜液静置12h倒在80℃刮膜板上，用300μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为3:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)80℃下将4g乙烯基磷酸(vpa)、4.5g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.09g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中8h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于100mmzrocl2的溶液中20h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为8.740％，其对卵清蛋白的吸附量为161.7mg/g。图1表明：在反应的过程中pvdf膜内部会形成硅烷界面交联的结构从而使得膜内部具有磷酸基团以及si-o-si的建，图中曲线b在1260cm-1的强峰对应于p＝o，而p-o和poh基团的峰在830cm-1左右，并且由于si的特征峰也在1260cm-1左右的位置，表明改性pvdf膜含有硅和磷基团，证明了pvdf/vpa-g-vtes杂化膜成功地加入了磷酸基团。图2表明：从图中可以看出，相比于常规的pvdf膜，利用热致相分离的pvdf膜的膜孔更加疏松和均匀，所以这种方法制备的pvdf膜水通量也极高，并且下表面由于刮膜过程中贴紧玻璃板，使得其表面相比于上表面更加的致密。b1和b2是经过vpa和vtes硅烷界面交联改性的pvdf膜的上下表面图，从图中可以看出经过改性后的pvdf膜的表面出现了许多相互交联的结构，这就是vpa和vtes的预聚物在膜内形成的网状结构，相比与纯pvdf膜要更加致密。c1和c2是经过螯合金属锆之后的pvdf/vpa-g-vtes膜的上下表面图，从图中可以明显的看到螯合上去的金属锆，数量也非常的多。对比反应前后的三张膜可以发现，随着改性的进行膜的表面产生了明显的变化。图3表明：pvdf膜由于其分子链结构上含有很多氟(—f)基团，因而分子链之间会形成氢键，制备得到的纯pvdf膜会具有相对比较高的结晶度。实验中采用vpa和vtes硅烷界面交联改性的pvdf杂化膜使得膜内部形成了新的功能基团-磷酸基团。纯pvdf膜、硅烷界面交联改性后的pvdf膜和螯合金属锆之后的杂化膜的xrd测试结果如图3所示。作为一种结晶型聚合物，pvdf膜(a)在20°左右有一个明显的衍射峰，用vpa和vtes共混改性后(b)膜在17°位置产生了新的衍射峰，这个峰就是磷酸基团的衍射峰，而经过螯合金属锆之后的pvdf膜(c)由于金属锆的加入，使得膜结晶度提高，衍射峰更加尖锐。杂化膜的重复吸附效果：在重复4次之后仍能保持85％以上的解吸附率。同时进行了含磷蛋白与非含磷蛋白的混合吸附实验，通过凝胶电泳表征出改性后的杂化膜对于含磷蛋白有优良的特异性分离效果。实施例8(1)将pvdf完全溶解于磷酸三乙酯(tep)中配成质量分数为15％的pvdf溶液，在80℃的条件下溶解10h后铸膜液静置12h倒在80℃刮膜板上，用300μm的刮刀进行刮膜，随后将其放入tep与水质量比为4:1温度为25℃的混合液中凝固5s，之后放入纯水凝固24h，并随后将其剥离下获得pvdf膜。(2)80℃下将4.5g乙烯基磷酸(vpa)、5g硅烷偶联剂乙烯基三乙氧硅烷(vtes)和0.09g引发剂偶氮二异丁腈(aibn)溶解于100g磷酸三乙酯与水1:1(质量比)的融合溶液中，聚合24h，然后将步骤(1)中pvdf膜浸没在溶液中8h，浸没在溶液中的过程中预聚物扩散进入膜中，得到pvdf/vpa-g-vtes膜。(3)将步骤(2)中pvdf/vpa-g-vtes膜浸没于100mmzrocl2的溶液中24h螯合金属离子zr，放入zrocl2和纯水中使得硅烷偶联剂进行脱水缩合，形成网络结构。将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到pvdf/vpa-g-vtes金属螯合亲和膜。制得的膜所含金属锆的质量分数为9.456％，其对卵清蛋白的吸附量为221.0mg/g。对比例1在微柱液相色谱(μhplc)模式下，以10mmol/l，ph6.0的3-吗啉丙磺酸(mops)为流动相a，运行时间7min；以10％氨水为流动相b，运行时间从7min开始；泵流速为0.05ml/min；检测波长为280nm。以非磷酸化蛋白bsa和hb以及磷酸化蛋白β-酪蛋白为例，蛋白浓度均为1000μg/ml，在流动相a条件下，非磷酸化蛋白bsa和hb在整体柱上不保留而直接被洗脱出来，而磷酸化蛋白β-酪蛋白在酸性条件下整体柱中的zr4+形成螯合作用；当流动相切换到b条件下，β-酪蛋白得到洗脱，该专利通过两种洗脱对比来表明实验效果，同时没有给出一个明确的吸附效果，这样的话无法定量的对于实验进行表征，而本专利中对于含磷蛋白进行了定量的吸附测试，同时进行了含磷蛋白和非含磷蛋白的混合吸附实验，凸显了实验的分离效果以及特异性选择效果。当前第1页12