分层结构的微流控芯片及其应用的制作方法

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种分层结构的微流控芯片及其应用。

背景技术：

微流控是一种精确操纵微小流体的技术平台。微流控与分析检测结合使体外诊断开始往小型化、集成化、自动化发展。越来越多的微流控免疫检测装置能够对个体生物标志物进行超快速、精确的检测。近年来，人们对临床诊断中多种分析物的自动化和高通量检测的兴趣和需求日益增加。与单个分析物的检测相比，多个分析物的并行检测具有分析时间更短，分析步骤更简单，样品消耗更少，检测效率更高，成本效益更高的优点。在一个测定中检测多个生物标志物可以避免假阳性或假阴性结果，提供更多诊断信息并增加生物标志物的诊断价值。在以前的工作中，许多免疫测定装置具有检测多种生物标志物的能力，包括化学发光，荧光，比色法等。然而，这些方法不能很好地解决“单样本多指标”问题。它们仍然不能满足临床使用的需求。它们中的大多数仍然需要进行过多的手动操作，并且耗时也太长。最关键的是它们中很少有人解决检测具有不同浓度区间的多种生物标志物，这严重阻碍了这些方法在临床应用中发挥重要作用。因此，开发出具有可调检测区间的多重免疫分析系统是亟待解决的问题。

技术实现要素：

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种分层结构的微流控芯片及其应用。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“poct”是指：即时检验(point-of-caretesting)。

术语“crp”是指：c反应蛋白。

术语“pct”是指：降钙素原。

术语“il-6”是指：“白介素6”。

术语“ccd”是指：电荷耦合器件。

术语“pmt”是指：光电倍增管。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种分层结构的微流控芯片，所述微流控芯片包括以下三层结构：流体层，基底层和抗体图案条带。

根据本发明第一方面的分层结构的微流控芯片，所述抗体图案条带是由微纳米纤维堆叠而成的多孔薄膜；

优选地，所述微纳米纤维的直径为1000μm～100nm，优选为20μm～500nm，最优选为1μm；

更优选地，所述多孔薄膜的厚度为1000μm～1μm，优选为100μm～5μm，最优选为10μm；

进一步优选地，所述多孔薄膜中孔的孔径为100μm～500nm，优选为10μm～1μm，最优选为5μm。

优选地，所述多孔薄膜的制备方法选自以下一种或多种：离子刻蚀、烧结、纺丝、化学沉积；

更优选地，所述多孔薄膜的制备方法采用静电纺丝方法制备。

进一步优选地，所述静电纺丝薄膜的材料选自以下一种或多种：聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

根据本发明第一方面的分层结构的微流控芯片，所述抗体图案条带还包括功能化修饰的微纳米颗粒；

优选地，所述微纳米颗粒的粒径为10μm～50nm，优选为1μm～100nm，最优选为200nm。

优选地，所述微纳米颗粒选自以下一种或多种：金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、四氧化三铁磁纳米颗粒、聚苯乙烯微球；

更优选地，所述微纳米颗粒为金纳米颗粒。

本发明的第二方面提供了一种具有可调检测区间的多重免疫分析系统，所述分析系统包括：

第一方面所述分层结构的微流控芯片，和

配套的自动便携式仪器。

根据本发明第二方面的多重免疫分析系统，所述自动便携式仪器包括：

阀门控制器；

液体驱动器；

光路；和

ccd相机或光电倍增管。

本发明的第三方面提供了第二方面所述的免疫分析系统的使用方法，所述方法包括以下步骤：

(1)对所述抗体图案条带选择性包被抗体；

(2)裁剪所述抗体图案条带，进行芯片组装；

(3)将生物样品和试剂注入芯片，自动便携式设备进行检测。

本发明的第四方面提供了第一方面所述分层结构的微流控芯片或第二方面所述的免疫分析系统在制备用于同时检测未稀释样品中多种生物标记物的产品中的应用，所述未稀释样品优选为人血清样品，所述多种生物标记物的范围优选接近十个数量级。

本发明的第五方面提供了一种免疫检测设备，所述设备包括；

第一方面所述分层结构的微流控芯片，或

第二方面所述的免疫分析系统；

优选地，所述设备可以根据检测物浓度的不同动态调节其检测区间。

传统检测都在医院检验科或者第三方的检验室进行，随着技术的不断进步，人们对于poct的需求也逐步增大。体外诊断也慢慢拓展到检验科以外，如急诊室、移动护理站、手术房、重镇监护室甚至患者家里。基于微流控的poct免疫测定平台可以快速准确地检测生物标记物。但很少有人能够解决同时检测多种生物标志物的挑战，特别是这些生物标志物具有不同的浓度区间，这在许多临床环境如早期败血症诊断中是常态。本发明无与伦比的优势在于该系统可以同时检测未稀释人血清样品中的多种生物标记物，其检测浓度范围接近十个数量级。该系统可以根据检测物浓度的不同动态调节其检测区间，使其满足临床检验的需求。在检测性能方面，本发明的一键操作模式不仅避免了人为操作的错误，而且也有助于其应用于poct。同时，本发明的系统可以检测从μg/ml到pg/ml的多种标记物。本发明人系统独特而无与伦比的优势在于本发明人的系统可以同时检测未稀释人血清样品中的多种生物标记物近十个数量级。在检测性能方面，本发明的一键操作模式不仅避免了人为操作的错误，而且也有助于其应用于poct。同时，本发明人的免疫分析系统可以检测从μg/ml到pg/ml的多种标记物。

本发明的具有可调检测区间的多重免疫分析系统可以具有但不限于以下有益效果：

快速定量多种生物标志物的浓度对于疾病诊断和提高人们的生活质量具有重要意义。然而，生物标志物浓度的巨大差异使得难以在单个测定中快速检测多个指示物。该系统的微流控免疫测试芯片，用于在浓度差异很大的情况下同时检测多种生物标记物。该芯片包含微纳米纤维堆叠而成的三维基底和功能化的纳米颗粒，以同时控制图案化捕获抗体的浓度和化学发光信号强度，动态调节免疫测定的检测区间，使本发明能够对浓度差异达10个数量级的生物标志物进行联合检测。配合本发明的便携式仪器，本发明可以通过一滴血清样本快速自动化的完成整个实验，这对poct具有重要意义。该系统具有检测多种生物标记物的能力，可以用于一系列应用，例如社区健康中心，流动诊所甚至患者家中。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明多重免疫分析系统的结构。

图2示出了本发明微流控芯片的结构。

图3示出了本发明多重免疫分析系统的信号放大。

图4示出了本发明多重免疫分析系统对多种生物标志物的联合检测原理。

图5示出了本发明多重免疫分析系统对不同浓度范围的生物标志物通过不同的信号放大方式在一个芯片里实现了联合检测。

图6示出了试验例1中c反应蛋白的检测结果。

图7示出了试验例2中白介素6的检测结果。

图8示出了试验例3中c反应蛋白，降钙素原和白介素6的联合检测结果。

附图标记：

1、电荷耦合器件(ccd)相机；2、电路板；3、反射器；4、阀门控制器；5、芯片；6、负压连接器；7、液体驱动器；8、蠕动泵；9、镜头。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：柠檬酸钠，氯金酸和k2co3购自西格玛阿拉丁，辣根过氧化物酶和抗体购自上海叶民生物有限公司，牛血清蛋白购自博士德生物工程有限公司。

仪器：

ccd相机购自光速视觉有限公司(中国北京)。用于将来自微流体芯片的化学发光信号反射到ccd相机的透镜和反射器购自启赛电子有限公司(中国北京)。蠕动泵由宝定斯诺流体技术有限公司(河北保定)获得。用于硬件模块自动化的定制印刷电路板(pcb)由巨峰华强电子科技有限公司(中国深圳)制造。其它机械加工件由兴宏盛达科技发展有限公司(中国北京)加工。步进电机购自haydonkerkmotionsolutions，inc.，(中国江苏常州)。芯片由深圳市森日有机硅材料股份有限公司加工。

实施例1

本实施例用于说明本发明多重免疫分析系统的结构。

本发明分析系统主要包含两部分：一种分层结构的微流控芯片和配套的自动便携式仪器。

该自动化仪器主要能够全自动的完成整个免疫检测和信号提取过程。该装置主要有两个功能：自动驱动液体完成整个检测；捕获信号以计算每种生物标志物的浓度。阀门控制器和液体驱动器可根据程序设置驱动流体。化学发光信号由光路引导并由ccd相机或者pmt记录。如图1所示，该仪器的主要组件包括电荷耦合器件(ccd)相机1，电路板2，反射器3，阀门控制器4，芯片5，负压连接器6，液体驱动器7，蠕动泵8和镜头9。

如图2所示，该芯片具有多层结构。其中最为明显的有三层：具有流体通路的流体层，具有废物回收的基底层和用于免疫测定的抗体图案条带。作为免疫反应基底的抗体图案条带是一种由微纳米纤维堆叠而成的多孔薄膜。多孔薄膜可以是使用离子刻蚀、烧结、纺丝、化学沉积的方法制备。更优选地，所述多孔薄膜的制备方法采用静电纺丝方法制备。进一步优选地，所述静电纺丝薄膜的材料选自以下一种或多种：聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物。其目的主要是提供一个多孔的三维基底，使得免疫反应能够更高效的在上面进行。选择性的包被完抗体后，把抗体条带剪成合适大小，用于芯片组装。将生物样品和试剂注入芯片后，全自动便携式设备可以完成免疫测定和信号分析所需的所有步骤，完全满足poct的要求。如图3所示，信号有九个点。每个生物标志物具有一式三份的信号点以产生可靠的结果。分析每个点的信号以计算每种生物标志物的浓度。对于不同的生物标记物，使用不同的放大方法将动态范围调整至其人血清样品的自然范围。以产生多孔三维反应底物和酶/抗体修饰的微纳米颗粒以降低其检测限(lod)。

动态调节检测区间最根本是依赖两个技术：纤维基底的免疫反应控制作用，功能化微纳米颗粒的信号放大作用。所述微纳米颗粒选自以下一种或多种：金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、四氧化三铁磁纳米颗粒、聚苯乙烯微球；更优选地，所述微纳米颗粒为金纳米颗粒。金纳米颗粒采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金溶液：向烧杯中加入1000ml三蒸水，然后加入10ml的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入20ml的1质量百分比的氯金酸溶液，加热至回流状态15min后冷却，得到所述的胶体金溶液；金纳米颗粒的修饰采用物理静电吸附法：取20ml制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μl0.1m的k2co3溶液调节溶液的ph至7.6，搅拌均匀，然后加入抗体和辣根过氧化物酶，搅拌30min，然后加入2ml3质量％的牛血清蛋白溶液，进行离心，离心时间为20min，转速为13000rpm，弃去上清液，再加入0.1质量％的牛血清蛋白溶液复溶后放置4度冰箱保存。对于不同浓度区间的生物标志物，本发明人使用微纳米纤维堆叠的薄膜和功能化修饰的微纳米颗粒，以同时控制图案化捕获抗体的浓度和化学发光信号强度，动态调节免疫测定的检测区间，从而检测多种生物标志物(从μg/ml降至pg/ml)。如图4所示，针对不同浓度范围的生物标志物，本发明人能使用不同的信号放大方法实现检测。从左到右依次降低检测限，可以根据要检测的生物标志物浓度进行动态选择。

不仅如此，本发明人还可以利用该芯片进行多种生物标志物的联合检测，即使它们的浓度范围差别很大。如图5所示，不同浓度范围的生物标志物通过不同的信号放大方式在一个芯片里实现了联合检测。

试验例1

本试验例用于说明本发明多重免疫分析系统对c反应蛋白的检测。

(1)c反应蛋白捕获抗体的包被修饰：采用蛋白划膜仪、微流控芯片、点样仪将抗人crp的抗体依次包被在反应基底表面后，裁剪制得crp捕获抗体图案条带。所述的crp捕获抗体图案条带包含三条crp捕获抗体图案。

(2)芯片组装：利用氧等粒子表面清洗机对芯片流体层和基底层进行1min的表面活化，放制crp捕获抗体图案条带后，将流体层和基底层贴合封装。

(3)信号检测：依次在注入crp蛋白检测试剂后，放入全自动的便携式设备，直到机器完成免疫检测及后续的信号处理。

检测结果如图6所示，左边数值为包被浓度：2.5、5.0、10μg/ml,浓度越高信号越强，但检测区间越窄。上面数值为测试的几个浓度：100、50、25、12.5、6.25μg/ml。

试验例2

本试验例用于说明本发明多重免疫分析系统对白介素6的检测。

(1)电纺多孔薄膜的制备：配制10质量％的聚苯乙烯溶液并加入注射器中。静电纺丝高压电源的正极与负极分别与注射器针头和接收装置相连，利用15千伏的高压电进行电纺，负压为-1千伏的电压进行接受电纺丝。电纺时间为10分钟，所得到的电纺膜厚度为10微米，直径为1微米。

(2)金纳米颗粒的制备和修饰：向烧杯中加入1000ml三蒸水，然后加入10ml的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入20ml的1质量百分比的氯金酸溶液，加热至回流状态15min后冷却，得到所述的胶体金溶液；金纳米颗粒的修饰采用物理静电吸附法：取20ml制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μl0.1m的k2co3溶液调节溶液的ph至7.6，搅拌均匀，然后加入il-6检测抗体和辣根过氧化物酶，搅拌30min，然后加入2ml3质量％的牛血清蛋白溶液，进行离心，离心时间为20min，转速为13000rpm，弃去上清液，再加入0.1质量％的牛血清蛋白溶液复溶后放置4度冰箱保存。

(3)il-6捕获抗体的包被修饰：采用蛋白划膜仪、微流控芯片、点样仪将抗人il-6的抗体依次包被在反应基底表面后，裁剪制得il-6捕获抗体图案条带。所述的il-6捕获抗体图案条带包含三条il-6捕获抗体图案。

(4)芯片组装：利用氧等粒子表面清洗机对芯片流体层和基底层进行1min的表面活化，放制il-6捕获抗体图案条带后，将流体层和基底层贴合封装。

(5)信号检测：依次在注入il-6蛋白检测试剂后，放入全自动的便携式设备，直到机器完成免疫检测及后续的信号处理。

检测结果如图7所示，检测区间为2000-62.5pg/ml。

试验例3

本试验例用于说明本发明多重免疫分析系统对c反应蛋白，降钙素原和白介素6的联合检测结果。

(1)电纺多孔薄膜的制备：配制10质量％的聚苯乙烯溶液并加入注射器中。静电纺丝高压电源的正极与负极分别与注射器针头和接收装置相连，利用15千伏的高压电进行电纺，负压为-1千伏的电压进行接受电纺丝。电纺时间为10分钟，所得到的电纺膜厚度为10微米，直径为1微米。

(2)金纳米颗粒的制备和修饰：向烧杯中加入1000ml三蒸水，然后加入10ml的1质量％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入20ml的1质量百分比的氯金酸溶液，加热至回流状态15min后冷却，得到所述的胶体金溶液；金纳米颗粒的修饰采用物理静电吸附法：取20ml制备的胶体金溶液置于烧杯中，加入150μl0.1m的k2co3溶液调节溶液的ph至7.6，搅拌均匀，然后加入il-6检测抗体和辣根过氧化物酶，搅拌30min，然后加入2ml3质量％的牛血清蛋白溶液，进行离心，离心时间为20min，转速为13000rpm，弃去上清液，再加入0.1质量％的牛血清蛋白溶液复溶后放置4度冰箱保存。

(3)crp、pct、il-6捕获抗体的包被修饰：采用蛋白划膜仪、微流控芯片、点样仪分别将抗人crp、pct、il-6的抗体依次包被在反应基底表面后，裁剪制得crp、pct、il-6捕获抗体图案条带。所述的crp、pct、il-6捕获抗体图案条带分别包含1条crp捕获抗体图案、1条pct捕获抗体图案、1条il-6捕获抗体图案。

(4)芯片组装：利用氧等粒子表面清洗机对芯片流体层和基底层进行1min的表面活化，放制crp、pct、il-6捕获抗体图案条带后，将流体层和基底层贴合封装。

(5)信号检测：依次在注入crp、pct、il-6蛋白检测试剂后，放入全自动的便携式设备，直到机器完成免疫检测及后续的信号处理。检测结果如图8所示，crp的检测区间为100-3.13μg/ml,pct的检测区间为75-0.31ng/ml,il-6的检测区间为2000-62.5pg/ml。检测的浓度范围高达十个数量级。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。