分离基质和分离方法与流程

发明的技术领域

本发明涉及分离基质颗粒，更特别地涉及用于分离生物制剂(如蛋白质、核酸和病毒)的包含嵌入的纤维的基于多糖的色谱基质。

发明背景

在生物药物(如疫苗、抗体、重组蛋白、基因治疗载体等)的制造中，通常需要几个色谱分离步骤以从产物中去除各种污染物和杂质。这些分离步骤增加了显著的成本和过程时间，因此对强化分离存在显著的兴趣，例如通过增加结合能力和/或增加流速。因此，需要具有足够刚性以适应高流速的分离基质。

通常，色谱分离在填充有凝胶珠形式的分离基质的柱中进行。一个实例是尺寸排阻色谱法(sec)。分离大的生物实体(例如大的蛋白质或病毒)需要具有大孔的珠。然而，大孔可能导致较低的刚性，并且分离基质可能在高流速下坍塌。因此，通常的实践是使聚合物交联以使其更稳定并增加刚性。这样的交联发生在多糖羟基和交联剂的官能团之间。在ep203049中描述了使用包含掩蔽官能团的单官能交联剂来改进凝胶珠的刚性的方法。在另一个实例中，在wo97/38018中描述了用于交联多糖凝胶以获得大孔和高刚性的制造方法，其包括在凝胶形成之前将交联剂引入到多糖溶液中的步骤。在这些方法中，交联导致多糖链之间的桥。使用交联的琼脂糖的商品的实例是superose^tm(gehealthcare的商标)。superose的刚性甚至允许粘性洗脱剂(例如8m尿素)以可行的流速运行。因此，使用交联剂(如表氯醇、双环氧化物、烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴和二乙烯基砜)化学交联多糖凝胶珠是制备用于色谱分离的具有改进的刚性的分离基质的确定方法。

发明概述

本发明的一个方面提供分离基质，其表现出高孔隙率和/或高刚性，用于生物制剂(如蛋白质、核酸和病毒)的改进的分离。这通过包含多糖凝胶珠的分离基质实现，其中所述多糖凝胶珠包含嵌入的纤维。

本发明的第二方面提供通过将至少一种可胶凝的多糖的水性溶液与纤维混合，并形成所述水性溶液的凝胶珠来制造所述分离基质的方法。

本发明的第三方面提供所述分离基质用于纯化、分离或去除目标化合物的用途。

本发明的其它合适的实施方案在从属权利要求中描述。

附图简述

图1显示包含嵌入的纤维素纤维的琼脂糖凝胶珠的显微镜图像。纤维以琼脂糖干重的6%的浓度嵌入，并且琼脂糖浓度为2%(水重量的2%)。微原纤化纤维素分散在凝胶珠中。白色比例尺表示200µm。

图2显示加入纤维素改变分离基质的耐压缩性。较低的压缩是较高的凝胶珠刚性的指示。琼脂糖的最终浓度为4%(水重量的4%)。

图3显示对于四种分析物的kd值和峰分子量(mp)的对数。较高的kd值表示对于分析物的较大可用孔体积。较大的log(mp)指示较大的分析物。“cl琼脂糖”是交联的烯丙基化琼脂糖的简短标记。

定义

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等可具有美国专利法中归于它们的含义，并且可指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”或“基本上由……组成(consistsessentially)”同样具有美国专利法中所归属的含义，且所述术语是开放式的，允许存在多于所叙述的那些，只要所叙述的那些的基本或新颖特征不会因存在多于所叙述的那些而改变，但排除现有技术实施方案。

如本文所用，术语“纤维”可具有单纤维的含义，并且其也可指包含原纤维的聚集体的纤维。

实施方案的详细描述

在一个方面，本发明公开了包含多糖凝胶珠的分离基质，其中所述多糖凝胶珠包含嵌入的纤维。凝胶珠多糖可为任何多糖，例如琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、淀粉衍生物、葡聚糖或其衍生物、或藻酸盐。特别合适的是产生高刚性的大孔凝胶的热胶凝多糖，例如琼脂、琼脂糖和琼脂糖衍生物(例如烯丙基琼脂糖或羟乙基琼脂糖)。

在一些实施方案中，嵌入的纤维可为能够嵌入凝胶珠中的任何纤维，例如有机纤维、碳纳米纤维、矿物纤维、合成纤维(如塑料纤维)或具有金属芯的纤维。在具体实施方案中，这样的纤维的尺寸允许它们嵌入凝胶珠中，因此嵌入的纤维的平均长度或最大长度或端到端距离通常小于凝胶珠直径，例如在1-500微米范围内。

在某些实施方案中，纤维包含聚集的原纤维，表现出分叉和/或具有“刷状”结构，这样的纤维的一个实例是微原纤化纤维素(mfc)。通常，纤维是分叉的，即它们表现出与纤维骨架成锐角的一个或多个分支。更一般地说，纤维也可以描述为支化的。这些纤维容易分散在与琼脂糖溶液充分混合的溶液中。这样的微原纤化纤维素的一个实例是exilvaforte^tm(borregaard，norway)纤维素悬浮液。其它实例例如描述于us4374702、us8647468、us6214163和us20170121908，均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，纤维素纤维分散在琼脂糖凝胶珠中。

在一些实施方案中，纤维完全嵌入凝胶珠中，导致平均球形度大于0.95的凝胶珠。球形度在此以正常方式定义为具有与给定颗粒相同体积的球体的表面积与颗粒的实际表面积的比率。这可以合适地通过显微镜图片的图像分析来确定。适当地，凝胶珠具有光滑表面。这样的球形凝胶珠易于储存、处理和填充在分离柱中。此外，高球形度和光滑表面防止非特异性相互作用，因为不存在可能阻碍紧密填充并由此增加空隙体积或相互作用以引起聚集或其它不利填充效应的突出纤维。在某些实施方案中，少于10%的凝胶珠，例如少于5%或少于2%的凝胶珠具有在显微镜中可见的一个或多个突出纤维。

本发明的一个方面是制造包含嵌入的纤维的分离基质的方法。在一个实施方案中，制备分离基质的方法包括将至少一种可胶凝的多糖的水性溶液与纤维混合，并随后形成所述水性溶液的凝胶珠的步骤。在形成凝胶珠之前将纤维包含在多糖水性溶液中允许将纤维嵌入凝胶珠内。

在一些实施方案中，制造方法包括通过在油相(如甲苯或庚烷)中乳化含有多糖(例如琼脂糖)和纤维(例如纤维素)的水性溶液来形成凝胶珠的步骤。在这样的实施方案中，通过降低乳液温度以诱导胶凝来形成凝胶珠。

在一些实施方案中，分离凝胶珠基质多糖为琼脂糖，并且纤维为纤维素，并且琼脂糖含量和纤维-琼脂糖比率可以变化以实现用于分离生物制剂的期望的孔隙率和选择性。在一些实施方案中，分离基质包含琼脂糖重量(即非纤维基质干重)的至多80%的嵌入的纤维素纤维，并且琼脂糖浓度可以为总重量的至多20%。嵌入的纤维素纤维的量可以为例如琼脂糖重量的至多20%，例如琼脂糖重量的至多10%、0.1-10%或0.1-7%。溶液中的琼脂糖浓度可以为例如至多10重量%，例如至多6%或1-6%。

在一些实施方案中，在胶凝之前，将一种或多种组分进一步加入到琼脂糖溶液中。这样的组分向分离基质中加入另外的功能要素，例如磁性颗粒(例如磁铁矿颗粒)、低密度或高密度颗粒(例如微球、金属颗粒或碳化钨颗粒)或用于随后分离生物制剂的分子结合组分。

在一些实施方案中，制造方法包括将色谱配体附接至凝胶珠的另外的步骤，例如使用凝胶珠的反应性羟基。这允许分离基质用于纯化与配体结合的特定分子或特定生物实体(如病毒)。

在一些实施方案中，当用作分离基质时，通过交联增加制造的珠粒的机械稳定性以更好地承受高柱压。因此，在一个实施方案中，除了在胶凝期间自发发生的物理交联之外，琼脂糖还被化学交联。有许多常规使用的和公知的交联剂可供使用，并因此本领域技术人员可以根据所用的琼脂糖、最终产品的预期用途等容易地选择合适的交联剂。交联剂也可以含有一个或多个非活性位点，其稍后在多糖交联的过程中被活化。作为说明性实例，可以使用表氯醇、双环氧化物、烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴和二乙烯基砜等。交联进行至少一次，但可以用相同的交联剂或用其它交联剂分子或交联剂的混合物重复。

在一些实施方案中，嵌入的纤维与分离基质凝胶珠的多糖化学交联，使得纤维共价连接至凝胶的多糖分子。例如，在纤维素纤维和琼脂糖凝胶珠的情况下，这可以使用用于交联的可用羟基基团通过标准交联方法来实现。凝胶珠内部的纤维和多糖的化学交联允许结构支撑和改进的刚性。纤维和分离基质的短距离共价键将纤维整合并固定到多糖分离基质中。在这些特别有利的实施方案中，交联使得所得分离基质在机械和化学上均更稳定。作为说明性实例，可以使用表氯醇、双环氧化物、烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴和二乙烯基砜等。交联进行至少一次，但在一些实施方案中可以用相同的交联剂或用其它交联剂分子或用交联剂的混合物重复。交联化合物还可以含有一个或多个非活性位点，其随后在分离基质制备过程中被活化。

在一些实施方案中，交联还允许通过改变纤维-琼脂糖比率和交联度来定制凝胶珠的物理性质。不同的比率和交联条件导致分离基质的不同的孔隙率和选择性特征。在一个有利的实施方案中，纤维以合适的浓度(例如琼脂糖重量的0.1-10%)嵌入，并且进行珠多糖的交联，其方式使得与没有纤维的分离相比，改进凝胶珠的刚性，并且分离基质的孔隙率允许更大分子的分离改进。

在一些实施方案中，在乳液冷却后用例如乙醇或水，或乙醇和水两者洗涤凝胶珠，以从分离基质中去除有机溶剂和任何剩余的非嵌入的纤维或化学品。该实施方案是特别有利的，因为它易于将珠重悬于储存缓冲液中，而没有任何剩余的非嵌入的纤维，所述剩余的非嵌入的纤维可能影响分离基质的分离性质。

在一些实施方案中，在分离(separating)、分离(isolating)或去除目标化合物的方法中使用具有嵌入的纤维的分离基质，所述方法包括使分离基质与包含所述目标化合物的液体接触的步骤。这样的方法和用途可以例如使用填充在色谱柱中的分离基质来进行。这样的方法受益于具有嵌入的纤维的分离基质的新颖的分离性质。一个实例是改进的刚性和选择性，允许在较短时间内分离大分子和生物实体(例如病毒)。

实施例

具有嵌入的纤维素纤维的多孔琼脂糖珠的制备遵循油包水(w/o)乳化程序，其主要步骤描述于wo97/38018中，其通过引用以其整体并入本文。与制备用作分离基质的凝胶珠的已知方法的主要区别在于，在胶凝之前将纤维素纤维加入到琼脂糖溶液中，如下列步骤所概述的。

纤维素

微原纤化纤维素为天然纤维素，其中纤维已通过穿过均化器而被打开以形成原纤维和微原纤维。均化将平均纤维长度降低到微米规模，并将平均纤维直径降低到亚微米规模。这样的纤维素原纤维显示分叉和“刷状”结构，如wo2015/180844中所述，其通过引用以其整体并入本文。微原纤化纤维素可以市售产品获得，例如来自borregaard的干含量为1.7%的exilvaforte纤维素悬浮液，其用于本文所述的实例中。

琼脂糖和纤维素溶液的制备

将琼脂糖分散在水中。将琼脂糖-水分散体加热至高于其熔融温度(约85℃)，并作为热的水悬浮液加入纤维素，并通过使用电机驱动的螺旋桨式叶片搅拌器将其分散在琼脂糖中。琼脂糖和纤维素以不同的比率和不同的总浓度加入并混合，参见表2。在一些实验中，使用烯丙基化琼脂糖(参见下文)。

油相

在加入含有琼脂糖和纤维素的溶液之前，将甲苯和溶解的乳化剂(aqualon^tm乙基纤维素，n50，得自ashland)加热至60℃。

将琼脂糖溶液转移至乳化反应器

形成小水滴并通过涡轮搅拌器分散在油相中，并通过搅拌器速度调节它们在乳液中的粒度，在较高速度下形成较小颗粒。

冷却过程

当颗粒达到所需尺寸(例如100μm直径)时，将乳液冷却至室温。

凝胶洗涤和筛分

首先用乙醇并然后用水洗涤凝胶颗粒。为了使颗粒的尺寸分布变窄，将它们湿筛至50-166μm之间。

交联

根据在wo97/38018中所述的方法制备烯丙基化和非烯丙基化的样品两者。简而言之，烯丙基缩水甘油醚和氢氧化钠用于烯丙基化步骤，并使用乙酸达到中性ph来终止反应。非烯丙基化的样品在50℃下使用表氯醇交联，而对于烯丙基化的样品，使用溴进行第二交联步骤。

凝胶的压缩测量

使用质地分析仪(ct3，brookfield)测量凝胶的耐压缩性。在去除空隙体积中的水之后，在12.9mm直径、28.5mm长度的具有玻璃过滤器底部的圆柱腔中制备3.7ml凝胶圆柱体。使用12mm直径的圆柱形活塞进行分析，该活塞以0.1mm/s的速度向下抵靠凝胶表面进入腔，直到达到3000g-4000g的负载。在压入期间，活塞进入凝胶的穿透长度与从凝胶作用在活塞上的力同时测量。

光学显微术

eclipsee600(nikon)显微镜用于捕获凝胶珠的透射光图像。

孔隙率(kd)分析

使用尺寸排阻色谱法测量不同珠的孔隙率和尺寸排阻选择性。孔隙率可以表示为kav或kd值(可用于给定分子种类的扩散的固定相的分数)，其通过反向尺寸排阻色谱法测量，例如根据在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991，第6-13页中描述的方法。kav以(ve-v0)/(vt-v0)的比率测定，其中ve为探针的洗脱体积，v0为柱的空隙体积(例如高mw空隙标记物(如天然葡聚糖)的洗脱体积)，并且vt为柱的总体积。kd可以确定为(ve-v0)/vi，其中vi为能够达到除基质体积(基质聚合物分子占据的体积)以外的所有体积的盐(例如nacl)的洗脱体积。kd和kav值均总是在0-1的范围内。对于给定的分析物分子，不同的分离基质表现出不同的kd和kav值。äkta^tmexplorerfplc(快速蛋白质液相色谱)(gehealthcarebiosciences)机器用于kd测量。使用自动进样器和内径为1cm的柱(hr1030，gehealthcarebiosciences)。使用软件unicorn^tm5.31(gehealthcarebiosciences)评价色谱图。用于实验的分析物是作为空隙体积标记物的天然葡聚糖(其仅从孔的外部通过)和作为vt(总液体体积)的标记物的氯化钠。另外，使用四种不同分子量的葡聚糖，如表1所见。

表1显示用于不同凝胶珠样品的孔隙率测量的具有相应mp值(峰分子量)的分析物。

表2显示图1-3中不同样品的实例。

本文所述的实例显示，包含具有嵌入的纤维的凝胶珠的分离基质表现出新颖且高度有用的分离性质。例如，可以如所述的，制备和使用具有高刚性和大孔的凝胶珠。例如，图3显示使用具有嵌入的纤维的珠允许在可行的流速下分离大分子和生物实体。因此，具有嵌入的纤维的凝胶珠允许制备和使用具有新颖分离性质的分离基质，例如与没有纤维的凝胶珠相比增加的孔隙率和/或刚性。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制备和使用任何装置或系统以及执行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这些其它实例旨在处于权利要求的范围内。本文中提及的任何专利或专利申请通过引用以其整体并入本文，如同它们被单独并入。