专利名称：官能化线性dna盒的生成及植物中量子点/纳米颗粒介导的投递的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用纳米颗粒以将官能化线性核酸盒分子非侵入投递入具有完整细胞壁的植物细胞中的方法。
发明背景
纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至特定动物细胞。已经发现了，在将某些经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒， 并开始表达DNA上编码的基因。也已经使用在大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如， 量子点(“QD”))作为载体来将分子投递入细胞中。DNA和蛋白质可以与附着于QD表面的某些配体连接。见例如Patolsky,等(2003) J. Am. Chem. Soc. 125:13918。可以通过使用标准的生物缀合方案将经羧酸或胺包被的QD与含有硫醇基团(见例如Dubertret等(2002) Science298:1759; Akerman,等(2002)Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 99:12617;Mitchell, 等(1999) J. Am. Chem. Soc. 121:8122)，或N-羟基琥珀酰亚氨基(“NHS”)酯基的分子交联。 见例如 Pinaud 等(2004)J. Am. Chem. Soc. 126:6115;Bruchez 等(1998)Science281:2013。 一种将分子附着于QD表面的备选方式是经由将经链霉抗生物素蛋白包被的QD与生物素化的蛋白质、寡核苷酸、或抗体缀合进行。见例如Dahan,等(2003) Science302:442;Pinaud, 等(2004)J. Am. Chem. Soc. 126:6115;Wu,等(2003)Nature Biotechnol. 21:41;Jaiswal, 等(2003)Nature Biotechnol. 21:47 ；及 Mansson,等(2004)Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529。
由于存在植物细胞壁，将外来核酸分子投递至植物是挑战性的。目前的方法依赖于侵入性投递以遗传转化植物。在植物细胞中，细胞壁是针对投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性细胞投递方法，例如生物射弹(基因枪)、微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来实现基因和小分子对有壁的植物细胞中的投递,但是蛋白质的投递仅已经通过微注射实现。在用纳米颗粒将核酸分子投递至植物细胞是期望的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前剥离细胞壁。见例如Torney,等(2007)Nature Nanotechnol. 2:295-300。
此外，常规的植物转化技术，诸如土壤杆菌介导的转化需要使用重组质粒。因此，这些常规技术不想要地导致细菌载体主链序列与附着的外源基因一起整合入宿主基因组中。见例如 Kohli 等(1999)Plant J. 17:591-601;及 Meza 等(2002)Nucleic Acids Res. 30 (20):4556-66。移植物中载体主链序列的存在在生物射弹转移规程中没有用。此外，载体主链序列具有刺激非常 规重组的趋势，其通过在二级结构的形成期间提供富含AT的序列作为重组热点来实现。Muller等(1999) J. Mol. Biol. 291:29-46。另外，载体主链序列可以生成与侧翼植物基因组DNA同源的新长度的“填充物”DNA，其可以逃脱至环境中。 Kohli 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 95:7203-8; Pawlowski 和 Somers (2000) Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 95:12106-10; Svitashev 等(2002) Plant J. 32:433-45。
使用颗粒轰击进行的用转基因盒的转化仅仅在组织培养物中及在稻(稻(Oryza sativa))和马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))中获得了有限的成功。Fu等(2000) Transgenic Res.9:11-9;Loc 等(2002)Mol.Breeding9:231-44;Romano 等(2003) Transgenic Res. 12:461-73;及Agrawal 等(2005)Mol. Breedingl6:247_60。已经提不了这些生物射弹技术生成较大比例的具有简单整合样式的转基因稻和马铃薯。缺乏载体主链序列的两组线性基因构建体(gus和bar，以及IAxl和bar)已经通过颗粒轰击独立转移入良种小麦(小麦(Triticum aestivum L.))品种EM12，并且具有低拷贝数转基因整合的遗传稳定的转基因植物得到回收。Yao等(2006)J. Exp. Botany57 (14) :3737-46。观察到通过生物射弹轰击的转化频率在O. 2和O. 6之间。同上文。已经提示了三种可能的要素(即，在转基因整合前降低连环化的量；限制转基因重排的发生；及防止整合事件期间不同转基因间的同源相互作用)一起起作用以生成由简单杂交样式呈现的简单的完整转基因基因座。 Agrawal 等(2005),见上文。
与经限制酶消化的DNA片 段一起的颗粒轰击和WhiSkerSTM(见美国专利 No. 5，464，765和5，302，523)是当时将线性DNA盒投递至具有完整细胞壁的植物细胞的唯一路径。
发明概述
本文中描述了使用纳米颗粒和线性化的核酸分子以将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法和组合物。可以使用公开内容的方法的一些实施方案来生成经稳定转化的经遗传修饰的能育植物。在一些实施方案中，官能化线性核酸盒分子的独特特性容许投递没有不想要的核酸序列，例如但不限于载体主链序列的感兴趣的特定基因序列。
在实施方案中，可以使用几种不同类的纳米颗粒来转化具有细胞壁的植物细胞。 在一些实施方案中，纳米颗粒可以用官能化线性核酸盒分子进行PEG化。在特定的实施方案中，纳米颗粒可以是半导体纳米颗粒，诸如量子点(“QD”)；或金纳米颗粒。在其它实施方案中，官能化线性核酸盒分子可以是线性化的质粒DNA。在备选的实施方案中，官能化线性核酸盒分子可以包含编码膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)和/或黄色荧光蛋白(YFP) 的序列。
还公开了用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法可以包括提供具有细胞壁的植物细胞；用至少一种感兴趣的官能化线性核酸盒分子包被纳米颗粒的表面；将所述具有细胞壁的植物细胞和用感兴趣的官能化线性核酸盒分子包被的纳米颗粒置于彼此接触中；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子摄取入包含细胞壁的植物细胞中。在特定的实施方案中，感兴趣的官能化线性核酸盒分子可以是包含感兴趣的基因的生物素化的线性化双链DNA分子。在其它实施方案中，感兴趣的官能化线性核酸盒分子可以是包含感兴趣的基因的未化学修饰的双链DNA分子。在特定的实施方案中，纳米颗粒可以是QD链霉抗生物素蛋白纳米颗粒。可以采用不同官能团使用多种试剂来将官能化线性核酸盒分子与纳米颗粒缀合。在一些实施方案中，可以用蛋白质和/或其它分子；例如，拥有相容的官能团的杀虫剂对纳米颗粒进行表面官能化。在一些实施方案中，可以将超过一类分子与纳米颗粒的表面缀合。如此，在特定的实施方案中，可以将细胞穿透杀虫剂和线性化核酸盒分子共官能化至纳米颗粒的表面上，例如以促进生物分子的靶向投递。
进一步公开了用于将性状基因渗入(introgress)植物中的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括提供植物细胞；用供在所述植物中表达所述性状用的手段包被纳米颗粒的表面；将植物细胞和用供在植物中表达性状用的手段包被的纳米颗粒置于彼此接触中；容许所述纳米颗粒和供在植物中表达性状用的手段摄取入所述植物细胞中以生成经转化的植物细胞；自经转化的植物细胞再生全植物；并繁殖所述植物。在一些实施方案中， 可以依照本发明的方法基因渗入的性状包括性状，其选自但不限于如下的雄性不育；除草剂抗性；昆虫抗性；和对细菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。
还公开了本发明的方法,其可以用于在植物原位(in planta)转化植物。在一些实施方案中，植物可以选自拟南芥属(Arabidopsis)的植物,例如拟南芥(A. thaliana)。在特定的实施方案中，通过植物原位转化来转化的植物可以选自哥伦比亚(Columbia)生态型的拟南芥植物。
另外，公开了 经遗传修饰的(GM)植物细胞及其生成方法，其中所述植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在一些实施方案中，可以经由依照本发明的纳米颗粒将质粒导入具有细胞壁的植物细胞中，所述质粒包含至少一种感兴趣的基因和选择标志。在其它实施方案中，可以选择稳定的转化体，其已经稳定整合至少一种感兴趣的基因和/或选择标志。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含至少一种感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。
进一步公开了创建在组织培养中使用的包含感兴趣的分子的可再生植物细胞的方法。组织培养物可以能够再生与可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以例如是胚；原生质体；分生细胞；愈伤组织；花粉；叶；花药; 根；根尖；花；种子；荚果；或茎。更进一步，一些实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。
进一步公开了用于生成包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的稳定化植物系的方法，其中首先可以通过纳米颗粒摄取穿过植物细胞壁来导入所述期望的性状或感兴趣的核酸分子。生成稳定化的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下的技术，诸如但不限于自交；回交；杂种生成；与群体杂交；等等。如此，还公开了包含首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物和植物细胞。可以在与另一不同植物细胞的杂交中使用包含期望的性状或感兴趣的核酸分子的植物细胞以生成具有期望特征的第一代(F1)杂种细胞；种子；和/或植物，所述期望的性状或感兴趣的核酸分子首先通过纳米颗粒摄取穿过细胞壁导入植物或细胞(或其祖先)中。
在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案考虑到以下描述会变得显而易见。
附图简述
图1包括未线性化的质粒pDAB3831的图。
图2包括质粒pDAB3831的DNA序列。使用PCR来扩增来自bp7666_3870的DNA片段，并用于拟南芥转化，这生成稳定整合的T2植物。
图3包括来自经树枝状聚合物(Dendrimer)转化的拟南芥基因组的膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)DNA序列和来自NCBI数据库的PAT序列间的序列比对。
图4包括经黄色荧光蛋白(YFP) DNA序列转化的拟南芥基因组和来自NCBI数据库的YFP序列间的序列比对。
序列表
SEQ ID NO:1显示用于自质粒pDAB3831扩增4. 6kbp完整表达盒的正向引物序歹丨
/5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA。
SEQ ID NO: 2显示用于自质粒pDAB3831扩增4. 6kbp完整表达盒的反向引物序歹
/5Biosq/ CCGCAACTATTTCAACAC。
SEQ ID NO:3显示用于扩增YFP基因的正向引物序 TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG。
SEQ ID NO:4显示用于扩增YFP基因的反向引物序 TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA。
SEQ ID NO:5显示用于扩增PAT基因的正向引物序 GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG。
SEQ ID N0:6显示用于扩增PAT基因的反向引物序 AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG。
发明详述
1.几个实施方案的概述
容许非侵入性基因转移·的本发明的方法对于生成具有期望性状的经遗传修饰的植物可以是非常有用的。非侵入性基因转移可以促进各区域的细胞内分子位点的特异性靶向和编辑，诸如在作物植物中掺入期望的输入、输出、和农艺学性状。描述的方法也可以作为非GMO选项用于瞬时转化植物，将用于性状基因渗入和疾病抗性的技术扩展至树或蔬菜作物，其中该技术目前是受限的。
目前的专利申请(U. S. S. N. 60/978，059)证明了基于纳米颗粒的DNA投递的非侵入性手段，其使用多种纳米颗粒有效载荷投递环形质粒DNA来进行，等等，而且明确证明了拟南芥植物的T1种子中稳定整合转基因。含有其中生成的环形质粒DNA的转基因植物展现出期望的除草剂耐受性表型，而且在同时用至少4倍的田间草铵膦水平喷雾时显示高水平的耐受性。U. S. S. N. 60/978，059证明了使用环形质粒DNA通过带正电荷的金纳米颗粒在拟南芥中的遗传转化，等等。本研究描述了使用官能化线性核酸盒分子稳定遗传转化植物，坐坐寸寸ο
U. S. S. N. 60/978, 059描述了带正电荷的纳米颗粒介导的质粒DNA投递，等等。然而。至今尚未报告证明使用基于线性质粒的投递实现的转基因的稳定基因组整合。此公开内容描述了使用纳米颗粒介导的官能化线性核酸盒分子以在植物中进行稳定遗传转化。分子分析指示通过本发明的方法用Pat基因和yfp基因转化的转基因T1拟南芥植物中的PAT 以及YFP表达。T1转基因植物是能育的，并生成种子。可以将这些种子繁殖，并可以与分子和蛋白质分析一起实施分离分析。
公开了容许在植物中产生简单DNA整合事件，并且由此使随后的基因渗入努力合理化的方法。与例如质粒相比，使用官能化线性核酸盒分子在遗传转化中提供优点。例如， 官能化线性核酸盒分子可以不包含载体主链序列或选择标志基因。
I1.术语
在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义
回交如本文中使用的，术语“回交”可以是育种人员将杂种后代往回与亲本之一， 例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。
胚如本文中使用的，术语“胚”可以指成熟种子内含有的小植物。
纳米颗粒如本文中使用的，术语“纳米颗粒”可以指一种具有至少I纳米级尺寸， 例如小于IOOnm的微观颗粒。适合于用于本发明的纳米微粒可以具有lnm-0. 84um的大小。 一类纳米颗粒是“量子点”(QD)。量子点可以具有Inm-1Onm,例如2-4nm的中值直径。纳米颗粒的其它种类包括但不限于金纳米微粒；金包被的纳米微粒；多孔性纳米颗粒；中孔性纳米颗粒；娃土纳米颗粒；聚合物纳米颗粒，诸如树枝状聚合物(dendrimer);鹤纳米颗粒； 明胶纳米颗粒；纳米壳(nanoshell);纳米核心(nanocore);纳米球(nanosphere);纳米棒 (nanorod);磁性纳米颗粒；及其组合。
在可用的纳米颗粒中，发光半导体纳米晶体(QD)在生物学成像和感测中提供许多得到证明的应用。其效用源自与较大的蛋白质相当的独特光-物理特征和大小的组合。亲水性CdSe-ZnS QD的流体动力学半径从5nm(对于用分子配体交换的纳米晶体帽) 变化至20nm(对于嵌段共聚物内包囊的纳米晶体)。可以将单一 QD与几种生物分子(例如，抗体；肽；和核酸分子)缀合以提供具有增强的亲合力的多官能性QD生物缀合物。另外，其对化学和光降解的强抗性可以潜在地容许特定生物学过程的长期荧光监测。Nie和 Emory (1997) Science275:1102-6。可以在不需要进一步纯化的情况中，在同一复合物内同时应用基于金属亲和力自身装配和生物素-亲合素结合的多种非共价缀合方案，以生成即使在胞内环境中仍稳定的多官能性QD生物缀合物。Yezhelyev等(2008) J. Am. Chem. Soc. 130(28) :9006-12。通过对每个QD利用平均10个YFP及名义上50个细胞穿透肽 (cell-penetrating peptide, CPP)，可以实现具有至少300kDa的分子量和150埃的空间延伸的蛋白质货物的胞内投递。同上文。QD-b-PE缀合物的投递货物具有范围大得多的大小和分子量；例如，在每个缀合物为平均2. 5个链霉抗生物素蛋白-b-PE的情况中，投递的装配体具有潜在超过103kDa的分子量，和接近500埃的总体尺寸。若使用具有更高b-PE价的缀合物，则分子量和大小可以实质性增加。
核酸分子核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、人工染色体(ACE)、和前述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸指 核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中所使用的，“核酸分子”与“核酸” 和“多核苷酸”是同义的。除非另有规定，核酸分子的长度通常是至少10个碱基。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。
可操作连接的当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列可以是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。
PEG化的如本文中所使用的，术语“PEG化的”可以指纳米颗粒(例如，金纳米颗粒；和量子点)，其中已经用聚乙二醇(PEG)修饰纳米颗粒的表面以得到改善的生物相容性。可以用各种祀向配体，例如肽和抗体进一步包被PEG化的纳米颗粒，以对特定的细胞和组织实现增强的投递效率。已经将PEG与具有各种药物的纳米颗粒；脂质体；和聚合胶束缀合，例如以延长经包被的纳米颗粒的血液循环时间，其通过经由空间稳定化效应降低蛋白质的非特异性吸附来实现。
量子点如本文中所使用的，术语“量子点”(QD)(有时又称为纳米晶体)可以指限制导带电子、价带空穴、或激子(导带电子和价带空穴的束缚对(bound pair))在所有三个空间方向的运动的半导体纳米结构。例如，该限制可以由静电势(由外部电极、掺杂、应变、 杂质等产生)；不同半导体材料间界面的存在(例如在核心-壳纳米晶体系统中)；半导体表面的存在(例如半导体纳米晶体)；或其组合所致。量子点可以具有离散的量子化能谱。 相应的波函数可以在空间上位于量子点内，但是延续晶格的多个周期。量子点含有有限的少量(约1-100)的导带电子；价带空穴；或激子(即，有限数目的基元电荷)。
量子点是一类特殊的半导材料，其可以是由I1-V1、II1-V、或IV-VI周期类材料构成的晶体。例如，其大小范围可以为直径2-10纳米(10-50个原子)。在一些实施方案中， 量子点可以由硒化镉硫化锌核心壳(CdSe/ZnS)构成，并且具有一批有用的电和光学特性， 其与散装材料(bulk material)的电和光学特性在性质上趋异。量子点纳米颗粒由于其高的量子产率；高的摩尔消光系数；和对光漂白的高抗性而已经在体内和在体外作为成像 剂进行调查。
对草甘膦的抗性对一定剂量的草甘膦的抗性指植物幸免于(即植物可以不被杀死)所述剂量的草甘膦的能力。在一些情况中，耐受性植物可以暂时变黄或者在其它方面展现出一些草甘膦诱导的损伤(例如，过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。
稳定化的如本文中所使用的，术语“稳定化的”可以指从同一品种的近交植物的一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物特征。
转基因如本文中所使用的，术语“转基因”可以指外源核酸序列。在一个例子中， 转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)；编码工业或药学有用的化合物的基因；或编码期望的农业性状的基因。在又一个例子中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子)。在一些实施方案中，要通过纳米颗粒介导的转化导入的感兴趣的官能化线性核酸盒分子包含转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的官能化线性核酸盒分子包含内源核酸序列，其中内源核酸序列的额外基因组拷贝是期望的；或相对于宿主生物体中的靶核酸分子在反义取向中的核酸序列。
摄取。如本文中所使用的，术语“摄取”可以指颗粒，诸如纳米颗粒(例如量子点， 或金纳米颗粒)穿过细胞壁或细胞膜的移位，其中所述移位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的移位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。
II1.使用纳米颗粒以稳定转化植物细胞的核酸分子投递
A.概述
例如，本发明描述了用于植物转化的新方法，其使用纳米颗粒介导的官能化线性核酸盒分子投递以遗传转化并形成稳定的转基因植物进行。依照某些实施方案的方法不仅可以提供转基因生物体的快速生成，而且在与其它转化方法相比时为期望的基因组修饰提供几种可能性。本发明的实施方案已经导致经由纳米颗粒介导的线性化质粒DNA投递生成的第一次报告的稳定转化的植物。遗传修饰的公开方法偏离植物遗传转化的传统方法，不依赖于生物射弹投递，并且对于生成转基因作物植物可以是非常有用的。
转基因植物通常通过土壤杆菌介导的转化或颗粒轰击转化生成。在感兴趣的基因外，转基因植物经常必需含有载体主链序列和选择标志基因，例如其赋予对抗生素或除草剂的抗性。因为选择标志基因和载体主链序列在DNA转移规程中即使多余的又是不想要的，所以没有载体的转基因植物的生成是有利的。通过一些实施方案的方法容许的消除载体主链序列可以限制同源重组的量和重组发生元件对整合过程的影响。
在本发明的实施方案中，通过线性核酸盒的非侵入性纳米颗粒介导的投递来直接创建转基因植物现在可以经由例如浸花法实现。此类方法可以提供比本领域中其它方面可用的方式更简单的实施期望的植物转化的方式。在一些实施方案中，可以使用方法来创建既没有载体也没有标志物的转基因植物。在一些实施方案中，转化方法不依赖于植物组织， 因此，对于有性繁殖植物而言可以是更方便且实际的。
在一些实施方案中，本发明的方法可以提供非侵入性转化非土壤杆菌相容性植物，和/或其组织培养悬浮细胞的能力。此类方法可以提供极大的机会。期望的输入和农艺学性状可能需要同一转化规程中的多基因投递。在一些实施方案中，本发明的方法容许在消除需要构建含有感兴趣的所有基因的大质粒(若可能的话，其可能是繁重的)的情况下投递多种核酸分子。
B.核酸分子
随着容许分离和表征编码特定蛋白质或RNA产物(例如干扰RNA ("RNAi ”))的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造细胞的基因组以含有和表达外来基因，或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)，以便例如以特定的方式改变细胞的性状。此类外来的另外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。例如，转基因可以编码感兴趣的蛋白质， 或者转录成RNAi。在过去15至20年里，已经开发了数种用于产生转基因细胞的方法，并且在特定的实施方案中，本发明涉及转化形式的细胞及其生成方法，其通过经由穿过细胞壁摄取纳米颗粒将一种或多种官能化线性核酸盒分子导入具有细胞壁的植物细胞中来进行。 在一些实施方案中，转基因可以包含在合成的线性DNA盒中。
细胞转化可以牵涉如下的核酸分子，该核酸分子包含在调节元件(例如启动子、 增强子、终止序列、或其组合)控制下的或者与调节元件(例如 启动子、增强子、终止序列、 或其组合)可操作连接的基因。如此，核酸分子可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。
在实施方案中，感兴趣的核酸分子可以是官能化线性核酸盒分子。例如，可以通过用至少一种限制性内切核酸酶消化环形质粒，诸如以切出其中含有的表达盒来生成线性核酸盒分子。限制性内切核酸酶会在质粒核苷酸序列内的一个或多个识别位点处切割质粒。 如此，质粒可以设计为容许通过用至少一种特定的限制性内切核酸酶消化生成一种或多种特定的线性核酸盒分子。或者，可以对给定的质粒核苷酸序列搜索一种或多种特定的限制性内切核酸酶的识别位点，所述限制性内切核酸酶容许生成一种或多种特定的线性核酸盒分子。通过选择在环形质粒或线性核酸分子内的特定位置处切割的限制性位点，可以生成所得的线性核酸盒分子，其缺乏来自前体核酸分子的一种或多种序列。例如，可以生成如下的线性核酸盒分子，其缺乏外来核酸序列(例如，载体主链；选择标志，诸如细菌选择标志； 和与靶细胞的基因组DNA同源的不必要的核酸序列)。或者，可以合成缺乏外来核酸序列的线性核酸盒分子。
可以使用连续热循环系统合成线性核酸盒分子。见国际PCT公开文本 W02008/045288。不同于使用小管，连续热循环仪重复使用恒定的或连续的流体流通过不同温度区以扩增DNA。将PCR反应混合物注射入与PCR反应混合物不能混合的载体流体中，然后，将载体流体通过多个温度区以促进PCR反应混合物内的DNA扩增。存在于样品中的特定DNA序列在其循环通过温度去时得到扩增。可以将PCR产物在凝胶过滤柱上纯化，接着纯化。
可以使用具有不同官能团的多种试剂来将核酸分子与纳米颗粒缀合。表I中列出了用于核酸分子与纳米颗粒的缀合的多种化学反应。
表1:
权利要求
1.一种将感兴趣的官能化线性核酸盒分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞；用感兴趣的官能化线性核酸盒分子包被纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子摄取入所述包含细胞壁的植物细胞。
2.依照权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒包含与所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子相互作用的官能团。
3.依照权利要求2的方法，其中所述纳米颗粒是链霉抗生物素蛋白-QD缀合的纳米颗粒。
4.依照权利要求1的方法，进一步包括容许所述纳米颗粒摄取入所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。
5.依照权利要求4的方法，进一步包括用亚细胞区室靶向蛋白包被所述纳米颗粒。
6.依照权利要求5的方法，其中所述区室选自下组胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。
7.依照权利要求1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是来自商业作物物种的植物细胞。
8.依照权利要求7的方法，其中所述植物细胞选自下组烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp·)、蓖麻属物种(Ricinus sp·)、和甘鹿细胞。
9.依照权利要求7的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
10.依照权利要求1的方法，其中所述具有细胞壁的植物细胞是培养的细胞。
11.依照权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒选自下组半导体纳米颗粒、量子点、带正电荷的纳米颗粒、金纳米微粒、金包被的纳米微粒、多孔性纳米颗粒、中孔性纳米颗粒、硅土纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、鹤纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳、纳米核心、纳米球、纳米棒、和磁性纳米颗粒。
12.依照权利要求11的方法，其中所述纳米颗粒是半导体纳米颗粒。
13.依照权利要求12的方法，其中所述半导体纳米颗粒是量子点。
14.依照权利要求11的方法，其中所述纳米颗粒是金纳米颗粒。
15.依照权利要求1的方法，进一步包括衍生化所述纳米颗粒的表面。
16.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子包含选自下组的核酸序列DNA、RNA、RNAi分子、和基因。
17.依照权利要求16的方法，其中所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子包含基因。
18.依照权利要求17的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农艺学基因、或标志物基因。
19.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子自核酸序列的PCR扩增获得。
20.依照权利要求19的方法，其中核酸序列自选自下组的核酸分子获得质粒、粘粒、人工染色体、酵母人工染色体、和细菌人工染色体。
21.依照权利要求16的方法，进一步包括选择已经稳定整合所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子的细胞。
22.依照权利要求21的方法，其中选定的细胞是可再生细胞。
23.依照权利要求22的方法，进一步包括自所述可再生细胞再生植物。
24.一种将感兴趣的官能化线性核酸盒分子导入植物材料中的方法，该方法包括提供植物材料，其中所述植物材料选自由植物细胞、植物组织、和植物组成的组；提供纳米颗粒；用感兴趣的官能化线性核酸分子盒包被所述纳米颗粒；将具有细胞壁的细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的官能化线性核酸盒分子摄取入所述植物材料中。
25.权利要求24的方法，其中所述植物材料是选自下组的植物组织胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
26.一种用于将性状基因渗入植物中的方法，所述方法包括提供植物细胞；提供能够与官能化线性核酸盒分子相互作用的纳米颗粒；用供在所述植物中表达所述性状用的手段包被所述纳米颗粒；将所述植物细胞和所述经包被的纳米颗粒置于彼此接触；容许所述纳米颗粒和所述供在植物中表达性状用的手段摄取入所述植物细胞中；自经转化的植物细胞再生全植物；并繁殖所述植物。
27.权利要求26的方法，其中所述性状选自下组表达感兴趣的蛋白质、雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、对细菌性疾病的抗性、对真菌性疾病的抗性、和对病毒性疾病的抗性。
全文摘要
用于将感兴趣的官能化线性核酸盒分子导入包含细胞壁的植物细胞中的方法包括使用纳米颗粒。在一些实施方案中，包含细胞壁的细胞是培养的植物细胞。方法包括遗传或以其它方式修饰植物细胞，并用于治疗或预防任何植物，尤其是作物植物中的疾病。转基因植物包含通过自用官能化线性核酸盒分子转化的植物细胞再生全植物生成的感兴趣的核酸分子。
文档编号B82Y5/00GK103052713SQ201180038795
公开日2013年4月17日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者K.Y.尧, J.P.塞缪尔, F.G.伯勒斯, N.C.桑伯朱, S.R.韦布 申请人:陶氏益农公司