淀粉样蛋白的检测方法

专利名称：淀粉样蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及用于评估淀粉样多肽的凝聚形式的方法。本发明还涉及用于在体外或体内检测淀粉样变性的潜在抑制剂的方法，以便开发诸如老年性痴呆的与淀粉样变性相关的疾病或失调。
背景技术：
老年性痴呆的特征是存在沉积在神经细胞周围的大脑淀粉样斑，这些斑会最终侵蚀并破坏正常的大脑过程。这种斑的主要蛋白成分是凝聚形式的具有39-43个残基的β-淀粉样蛋白的同工型(Aβ)。老年性痴呆的主要致病原因是在大脑实质和脉管系统中形成所述纤维状淀粉样斑。业已证实所述淀粉样多肽的纤维状凝聚物的沉积，是由于这种多肽自我组装形成了由交叉β片层构象组成的大分子结构，这种物质对培养的神经元细胞有毒性，治疗老年性痴呆的一个目标是预防凝聚物形成和或在业已诊断出这种病之后治疗性给药凝聚物形成抑制剂，以便解除这种蛋白的毒性作用。因此，能抑制大分子凝聚物形成的制剂有可能起着抑制细胞毒性的作用，并因为有可能用作抗老年性痴呆的药物而具有药用价值。在业已报导的作为凝聚抑制剂的若干种小分子中，刚果红(一种联苯重氮磺化染料)被认为是神经保护化合物(Pollack etal.，Neurosci.lett.，1995，197211-214；Lorenz et al.，美国科学院院报，1994，9112243-12247；和Burgevin等，NeuroReport，1994，52429-2432)。PCT申请PCT/US93/06637(“637申请”)披露了将刚果红及其可以药用的盐或其衍生物用于治疗包括老年性痴呆在内的淀粉样变性疾病的用途。据报导，刚果红能干扰淀粉样变性或将业已形成的淀粉样结构去稳定化。上述特征构成了637申请提倡服用刚果红来治疗与淀粉样蛋白的斑状沉积相关的症状的基础。作为治疗剂，刚果红能以足于干扰淀粉样蛋白形成或将业已形成的淀粉样物质去稳定化的量体内服用。因此，据报导刚果红不仅能结合淀粉样斑，而且还能抑制淀粉样蛋白的积累。
刚果红作为老年性痴呆的可能的治疗剂的价值和效果须要进一步检验，因为刚果红不能通过血脑屏障。刚果红的衍生物、类似物、盐等可能具有与刚果红相同的作用于β-淀粉样肽的模式，即，这些衍生物可能也是神经保护剂。
目前，使用硫黄素T(Thioflavin T)的基于抗体的方法和荧光方法被用于检测凝聚的肽，以便筛选抗老年性痴呆制剂。业已将荧光相关光谱方法用于测定淀粉样蛋白的聚合(Tjernberg等，化学和生物学，1999，653-62)。不过，所述技术不能区分凝聚多肽的各种构象形式。
现有技术中没有披露用于检测不同构象形式的凝聚的淀粉样多肽的检测方法。所述检测方法最好可用于快速评估所述多肽的凝聚状态，特别是在有原纤维生成抑制剂的条件下评估。
因此，本领域需要检测淀粉样变性和淀粉样斑的方法，进而又突出了研究淀粉样蛋白导致老年性痴呆的过程的必要性。尤其是有必要开发涉及生物物理和分析方法的检测方法，以便鉴定淀粉样多肽凝聚物的构象和凝聚状态，并区分潜在的淀粉样变性抑制剂的作用，特别是用于老年性痴呆。由于对老年性痴呆的毒性凝聚物的性质和大脑中形成这些凝聚物的机理的了解甚少，需要组合测定方法来确定潜在的抑制剂是否能在体外测试系统中产生希望的作用。还需要确定测试化合物对诸如血浆或脑脊液的体液中的淀粉样多肽的构象的影响的测定方法。
发明概述本发明提供了检测各种凝聚形式的淀粉样多肽的方法，例如，使用淀粉样蛋白专一性染料，如刚果红及其它相关类似物，或荧光团标记过的淀粉样肽。所述方法可用于确定所述多肽的凝聚状态，并用于在体外模型中测试凝聚作用的调节剂。该方法可用于确定介入凝聚作用减弱毒性的时期，例如，Aβ肽对神经元细胞的毒性。该方法还可用于确定抑制剂或抗老年性痴呆制剂治疗或预防性治疗淀粉样变性或其它相关疾病的效果。
因此，一方面，本发明提供了一种用于确定淀粉样多肽的凝聚构象形成的方法。该方法包括使一种淀粉样蛋白专一性光谱学探针复合体，如在多肽能发生凝聚作用的条件下让磺化重氮染料或荧光团标记过的淀粉样肽接触淀粉样多肽形成的复合体的光谱特征，与淀粉样蛋白专一性探针和具有已知构象的凝聚的淀粉样多肽的复合体的预定光谱特征相关联。
另一方面，本发明提供了一种用于检测测试化合物抑制、破坏、或解聚淀粉样蛋白形成的效果的方法。该方法包括使(a)一种淀粉样蛋白专一性光谱学探针如磺化重氮染料或荧光团标记过的淀粉样肽在多肽能发生凝聚作用的条件下接触淀粉样多肽和测试化合物形成的复合体的光谱特征，与(b)淀粉样蛋白专一性探针和淀粉样多肽在能发生凝聚作用的条件下接触形成的复合体(对照)的光谱特征相关联。所述荧光探针可以在凝聚之前与样品接触，或者如果探针是淀粉样蛋白专一性染料的话，在凝聚之后接触。如果所述光谱学探针是荧光团标记过的肽，应当让它与淀粉样多肽凝聚。测试化合物可以在凝聚之前或之后添加。光谱特征的差别表明测试化合物对淀粉样蛋白形成有作用。
结合附图、详细说明和实施例可以更好地理解本发明的上述及其它方面。
附图简述

图1(彩色)刚果红对Aβ(1-40)构象的影响。比较刚果红与陈化和新鲜肽的复合体的远紫外CD光谱和共凝聚物的远紫外CD光谱，以便确定肽凝聚物的构象差别。绿色/菱形14.3μM刚果红的共凝聚；紫色/空心方框21μM刚果红的共凝聚；红色/三角形47μM刚果红的共凝聚；兰色/倒三角形陈化淀粉样肽；橙色/方框新鲜肽与21μM刚果红；浅橙色/圆形陈化肽与21μM刚果红。
图2预先形成的淀粉样肽凝聚物(空心方框)和共凝聚物(空心圆形)与刚果红复合体的近紫外CD光谱。
图3刚果红与预先形成的凝聚物(空心圆形)和共凝聚物(空心方框)的复合体的紫外吸收光谱。吸收光谱是针对陈化肽测定的。
图4刚果红与βAP1-40的预先形成的凝聚物(空心圆形)和共凝聚物(空心方框)的复合体的差别光谱。吸收光谱是针对刚果红测定的。
发明详述本发明披露了可用于检测各种凝聚形式的淀粉样多肽的构象差别的测定方法。本发明部分基于刚果红(一种荧光淀粉样蛋白专一性光谱学探针)对凝聚作用的影响的发现。所述影响是这样确定的在一个实验中，在凝聚开始时将刚果红添加到淀粉样多肽(Aβ肽)溶液中，在另一个实验中实施凝聚。发现刚果红在体外能与β淀粉样蛋白形成至少两种不同的复合体。刚果红在Aβ肽凝聚成β-片层之前与它结合所具有的光谱特征，与刚果红在Aβ肽已经凝聚成β-片层之后(所谓的纤维肽)再与它结合所具有的光谱特征不同。刚果红能抑制Aβ肽形成纤维状凝聚物，还能减弱已经凝聚的肽的毒性。尽管在这两种情况下，通过光谱分析发现所得到的共凝聚物和刚果红复合体与纤维状形式的复合体不同，但通过添加刚果红都能减弱所述肽的毒性作用。
实验结果表明，在这两种情况下导致毒性减弱的分子机理明显不同。上述结果的应用，有利于确定介入凝聚过程以便减弱毒性，如对神经细胞的毒性的最佳时期。所述方法还可用于鉴定由不同的多肽与原型小的抑制剂分子结合所产生的各种蛋白复合体。披露了可用于在有原纤维生成的潜在抑制剂的条件下快速评估淀粉样多肽的凝聚状态的测定方法。
已知Aβ肽能产生毒性，并认为它与老年性痴呆的神经元细胞死亡相关。目前，对鉴定能介导Aβ肽的神经毒性的蛋白怀有极大兴趣。本文所披露的方法可用于鉴定凝聚形式的Aβ肽与这种蛋白的相互作用，还可用于确定潜在的测试化合物是否能阻断这种相互作用。所述方法的应用还提供了了解老年性痴呆的分子机理的进一步线索，这些线索目前是发现神经变性药物的基础。所述发现还可用于评估其它淀粉样多肽。
三种不同的技术被用作在有或没有刚果红的条件下确定所述多肽的凝聚程度的工具。还检验了抑制剂对淀粉样多肽自我组装的作用，以及对细胞毒性的同步作用。
1.实施圆二色性(CD)光谱分析，以便鉴定并且区分在有或没有刚果红的条件下陈化的淀粉样多肽的构象。该方法基于淀粉样多肽在远紫外区和刚果红在近紫外区内CD吸收值的变化。对凝聚复合体的远紫外和近紫外光谱进行扫描。远紫外CD光谱可用于确定淀粉样多肽的二级结构。近紫外CD光可用于区分刚果红复合体。在缓冲液中仅有淀粉样多肽，以及游离的刚果红都不能在近紫外部分产生明显的CD吸收。由于刚果红在游离状态下不具备内在的CD光谱，在与淀粉样蛋白结合时所诱发的光谱改变可用于鉴定各种形式的淀粉样蛋白。对于刚果红与淀粉样多肽的共凝聚物和刚果红与预先形成的多肽凝聚物或纤维状多肽的复合体来说，所诱发的CD吸收效果明显不同。尽管不希望受任何理论的约束，但刚果红近紫外CD光谱的改变，被认为是由于在与有序的纤维状蛋白结合之后诱导了一种手性环境所致。
发现共凝聚物(淀粉样多肽和刚果红的共凝聚物)的近紫外CD光谱，与和刚果红接触的预先形成的纤维状多肽的光谱明显不同。所观察到的复合体光谱的差异，是由于不同复合形式的刚果红的产生。与预先形成的原纤维的CD光谱关联的激子是刚果红与有序的β-片层构象肽的复合的标记(即，形成了缠绕的β-片层结构；Woody，R.W.，生物聚合物的圆二色性，Proc.F.E.C.S.Int.Conf.Circ.Dichroim，1987(会议日期1985)，pp.270-275)，而共凝聚物的光谱与刚果红和中间凝聚结构复合相吻合。
在不同时间点对凝聚的淀粉样多肽的CD光谱进行扫描，使结合硫黄素的大分子组件(凝聚物)的形成与β-片层构象的出现相关联。使用利用了硫黄素(ThT)结合的荧光光谱法，证实所述多肽中β-片层的形成。由于硫黄素诱发的荧光对淀粉样β-片层原纤维专一，而对其它β-片层结构或可溶的寡聚体形式的多肽不专一。
2.用紫外光谱学区分预先形成的原纤维和共凝聚物的两种复合体的刚果红吸收光谱。在有或没有淀粉样多肽的条件下测定刚果红吸收光谱的变化，以及在刚果红与纤维状、非纤维状剂、以及其它形式的复合体结合的环境下刚果红吸收光谱的变化。
3.用荧光光谱学区分刚果红复合体。刚果红能与预先形成的原纤维以及中间凝聚形式的淀粉样多肽结合。当刚果红与所述凝聚形式结合时，刚果红的内在荧光明显增强。在凝聚物结合状态下，刚果红的荧光激发光谱也相对游离形式的多肽发生红色偏移。刚果红荧光特征的改变，取决于刚果红的凝聚状态。所观察到的纤维状多肽与刚果红的共凝聚物和复合体的光谱特征的差异，是由于结合位点的相对疏水性以及在与预先形成的原纤维和共凝聚物的复合体中结合的刚果红分子数量不同。
在本发明中，业已证实刚果红在与淀粉样多肽共凝聚时能促进形成β-片层构象的稳定中间体。尽管刚果红既能结合预先形成的原纤维，又能结合中间凝聚形式的淀粉样多肽，但还没有与随机卷曲状态的多肽相互作用的证据。结果表明，刚果红在与淀粉样多肽共凝聚时的荧光光谱比游离形式的光谱增强了8倍。还证实了预先形成的原纤维能与刚果红结合，但预先形成的原纤维与刚果红的复合体的荧光，与游离形式的刚果红相比仅增强了2倍。因此，本研究用荧光技术证实，刚果红与β-淀粉样蛋白1-40具有双重相互作用模式。由于Aβ39-43同工型也能由随机卷曲形式转变成β-片层形式，对于Aβ肽的所有同工型来说，刚果红的相互作用是类似的。
本发明的光谱学结果业已证实，诸如刚果红的抑制剂能与淀粉样多肽形成至少2种不同的复合体。业已证实，预先形成的原纤维和共凝聚物在与刚果红结合时，都能产生大分子量物质(大约50kD或更高)。尽管刚果红能结合Aβ肽的中间凝聚物，并因此减弱这种纤维状肽的毒性，但在共凝聚物中仍会发生“不溶性”复合体的形成，这表明测试化合物对凝聚作用的这种影响有待于就其在治疗或预防老年性痴呆方面的可持续性作进一步研究。
基于上述具体发现(这些发现在下面的实施例中作更详细地说明)，业已发现了荧光探针，即，磺化重氮染料或荧光团标记过的淀粉样肽检测凝聚的淀粉样多肽的凝聚形式的一般能力。这种分析工具提供了用于分析测试化合物抑制或消除淀粉样变性的能力的筛选技术的基础。
本文讨论了本发明的各个实施方案和方面。采用了特殊的标题(加粗，下划线)和小标题(加粗，斜体，下划线)，以便于理解本发明，但不是要限制本发明。
一般定义术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样斑”、和“淀粉样原纤维”总体上是指不溶性蛋白类物质，它具有独立于蛋白的组成或该物质中其它分子的特定物理特征。淀粉样蛋白可根据其非晶态结构、嗜伊红性粒细胞染色、硫黄素荧光的改变、均匀的外观来鉴定。淀粉样蛋白的蛋白或肽成分在本文中被称为“淀粉样多肽”，并且包括，但又不限于β-淀粉样肽(Aβ肽)，包括相当于Aβ的头28、40、或42个氨基酸的合成βAPs，即，分别为Aβ(1-28)、Aβ(1-40)、Aβ(1-42)，以及相当于Aβ的25-35号氨基酸的合成βAP，即，Aβ25-35；羊瘙痒症蛋白前体或朊病毒蛋白；免疫球蛋白，包括由骨髓瘤产生的κ或λ轻链或重链，或其片段；血清淀粉样蛋白A；β2-微球蛋白；apo-Al；凝溶胶蛋白；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；(原)降钙素；心钠素；和胰岛淀粉样多肽(又被称为糊精)等(参见Westermark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，843881-85；Westermark等，美国生理学杂志，1987，127414-417；Cooper等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，848628-32；Cooper等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，857763-66；Amiel，Lancet，1993，3411249-50)。对于本发明来说，通过诱导，例如，用晶种在能凝聚的条件下诱导，淀粉样多肽能自发地凝聚。应当指出的是，尽管人体糊精在体外能自动凝聚，但是与人体糊精有6个氨基酸残基不同的大鼠糊精是非淀粉样的，而且不能形成原纤维(参见Lorenzo等，自然，1994，368756-760)。在特定方面，本文所使用的术语“淀粉样蛋白”是指含有Aβ的物质。“淀粉样变性”蛋白在体内沉积或凝聚，从而形成淀粉样斑或原纤维。
术语“淀粉样蛋白专一性光谱学探针”是指结合淀粉样蛋白的染料化合物或能与凝聚形式的淀粉样蛋白相互作用的肽荧光团缀合物，，并根据凝聚物的构象表现出不同的光谱特征。当然，本领域技术人员很容易理解的是，荧光团必须起着生色团的作用，即，它将具有特定的吸收光谱。而且，当束缚在淀粉样蛋白中时，它还可能具有诱导的CD光谱。所述探针可以，并且优选能影响淀粉样变性。磺化重氮染料和荧光团标记过的淀粉样肽都是淀粉样蛋白专一性光谱学探针的例子。
“荧光团标记过的淀粉样肽”是与荧光团(荧光分子)缀合的淀粉样多肽衍生的肽，如Aβ。淀粉样肽是淀粉样多肽或其能与淀粉样多肽共凝聚的部分。然而，荧光团标记过的淀粉样肽本身不一定能凝聚。用于标记淀粉样肽的荧光团的例子包括，但不限于荧光素、德克萨斯红、钌β-吡啶基复合体和罗丹明。荧光团在紫外区中还具有有用的吸收光谱，并且还可能具有有用的IR光谱特征。荧光团标记过的淀粉样肽优选占样品中总肽的大约10％或更低，更优选大约1％或更低，最优选大约0.1％或更低。
“结合淀粉样蛋白的染料”的最广义地含义是具有与淀粉样蛋白结合倾向的生色团。所述染料优选还是一种荧光团，即在特定条件下能发出荧光。对于本发明来说，以及在淀粉样变性研究中，所述paradigmatic染料是磺化重氮染料，特别是刚果红(例如，参见US5276059和PCT/US93/06637)。不过，刚果红的相关化合物或等同物，如刚果红的羧酸化类似物柯胺G就被视为属于本发明的范围。刚果红和柯胺G的结构如下 刚果红 柯胺G允许凝聚的条件包括pH、离子强度、温度和低、优选无或至少为不可检测浓度的离液剂或亲胶剂，以便淀粉样多肽能够凝聚。淀粉样多肽“晶种”的存在能增加多肽凝聚的可能性。
“凝聚复合体”是指诸如刚果红的淀粉样蛋白专一性光谱学探针与凝聚的淀粉样多肽相互作用所产生的复合体。这种复合体可以是共凝聚所产生的，即，在诱导凝聚之前同时存在淀粉样蛋白专一性光谱学探针和淀粉样多肽。或者，该复合体可以是由预先形成的淀粉样多肽凝聚物与染料相互作用形成的。
本文所使用的术语“凝聚形式”是指淀粉样多肽在凝聚状态下所具有的结构或构象。例如，凝聚的Aβ能形成β-片层或缠绕的β-片层。实际上，二级和四级(肽-肽)构象表现为光谱特征的差别。换句话说，在没有确切了解凝聚的淀粉样多肽的结构的情况下，通过检测多肽或淀粉样蛋白专一性光谱学探针的光谱特征的差异，就可以检测结构差异。反过来又可以在体外或体内评估这些差异对细胞毒性或淀粉样变性相关的致病性的作用。
术语“多肽凝聚物”或“凝聚物”是指形成纤维形式或非纤维形式的自身结合的多肽，并且指那些对神经元培养物有毒或无毒的多肽。
在本文中，术语“光谱特征”是指被凝聚复合体吸收的辐射量或通过吸收辐射激发凝聚复合体而发射出的能量。在一个具体实施方案中，在远紫外和近紫外范围内获得了圆二色性紫外光谱。在另一个实施方案中，获得了紫外吸收光谱。在另一个实施方案中，获得了红外线光谱。一般，光谱是通过在特定波长下，在含有凝聚复合体的样品与参考样品中测定透射的或吸收的光线量的差异而获得的。通过在特定激发波长下检测发射强度获得荧光光谱。荧光激发光谱可以通过评估荧光强度受吸收波长的影响而获得。这些概念在本领域中是众所周知的(例如，参见Cantor和Schimmel，生物物理化学，W.H.Freeman andcompany旧金山，1980；Silverstein等，有机化合物的光谱鉴定，JohnWiley&Sons纽约，1981)。
当淀粉样蛋白沉积物或淀粉样斑出现在受一种疾病感染的组织中或靠近该组织时，或者当一种疾病的特征是超量产生是或可能是不溶性的蛋白时这种疾病就与淀粉样变性相关。所述淀粉样斑能通过已知或未知的机制，直接或间接引起病理学效应。淀粉样疾病的例子包括，但不限于系统性疾病，如慢性炎性疾病，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症，家族性淀粉样多神经病(葡萄牙人)和心肌病(丹麦人)，系统性老年淀粉样变性，家族性淀粉样多发性肾病(衣阿华人)，家族性淀粉样变性(芬兰人)，Gerstermann-Straussler-Scheiker综合症，伴随寻麻疹和耳聋的家族性淀粉样肾病(Muckle-Wells综合症)，甲状腺髓样癌，孤立性前房淀粉样病，和与血液透析相关的淀粉样变性(HAA)；以及神经变性疾病。
II型糖尿病与胰腺，特别是产生胰岛素的前列腺细胞的淀粉样原纤维或沉积物相关。与老年性痴呆的淀粉样斑一样，II型糖尿病的淀粉样斑或原纤维能引起病理学效应。具体地讲，形成原纤维的人糊精的浓度，对人和大鼠的产生胰岛素的β-细胞有毒(Lorenzo等，自然，1994，368756-760)。因此，在一种实施方案中，本发明涉及II型糖尿病性淀粉样变性。
慢性炎性疾病，如特发家族性地中海热，Muckle-Wells综合症，和慢性疟疾感染等可导致一种急性期蛋白血清淀粉样蛋白A表达，这种蛋白能作进一步加工并形成淀粉样沉积物和斑。例如，在第三世界，慢性疟疾能导致人体脾脏和或肝脏的淀粉样变性。所产生的器官损伤最终会导致死亡。多发性骨髓瘤与免疫球蛋白的过量表达相关，这种免疫球蛋白或其片段能在与呼吸系统接触的器官中形成淀粉样沉积物和斑。运甲状腺素蛋白的沉积会导致家族性淀粉样多神经病(葡萄牙人)和心肌病(丹麦人)，或系统性老年淀粉样变性。与血液透析相关的淀粉样变性是长期血液透析患者的并发症，其中，β2微球蛋白是淀粉样原纤维的主要蛋白成分(Drueke，1991，矿物电解质代谢，17261-272；Geyjo等，1985，生物化学生物物理学研究通讯，129701-706；Gorevic等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837908-12；Shirahama等，1985，实验室研究，53705-709)。
如上文所述，除了系统性淀粉样变性之外，本发明特别涉及与淀粉样变性相关的神经变性疾病。术语“神经变性疾病”是指特别与大脑相关的神经系统的疾病或失调，这种疾病的症状特征是大脑或神经失调，例如，短期或长期记忆力下降或缺陷，痴呆，认识缺陷，平衡和协调问题，以及情绪和行为缺陷。当来自表现出上述症状的患者大脑组织的组织病理学(活检)样品表现出淀粉样斑形成时，这种疾病就是“与淀粉样变性相关的”。由于要从活体内获得大脑，特别是人类大脑的活检样品是极其困难的，或者是根本不可能得到的，通常，神经变性疾病的症状与淀粉样变性的关系所依据的指标并非是活检样品中诸如斑活原纤维的淀粉样沉积物的存在。
在本发明的一种具体实施方案中，与淀粉样变性相关的神经变性疾病是老年性痴呆(AD)。在其它实施方案中，所述疾病是罕见瑞典病，其特征是在淀粉样前体蛋白(APP)上，在靠近APP的βAP部分的氨基末端发生了KM→NL双突变(Levy等，1990，科学，2481124-26)。另一种这样的疾病是伴随荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHA或HCHWA)(Rozemuller等，1993，美国病理学杂志，1421449-57；Roos等，1991，Ann.N.Y.Acad.Sci.640155-60；Timmers等，1990，神经科学通讯，118223-6Haan等，1990，Arch.Neurol.47965-7)。本领域已知的本发明范围内的其它上述疾病包括，但不限于偶发性大脑淀粉样血管病，遗传性大脑淀粉样血管病，Down’s综合症，Guam的帕金森痴呆，与年龄相关的无症状淀粉样血管病(例如，参见Haan和Roos，1990，Clin.Neuro.Neurosurg.92305-310；Glenner和Murphy，1989，N.Neuro.Sci.，941-28；Frangione，1989，Ann.Med.2169-72；Haan等，1992，Clin.Neuro.Neurosurg.94317-8；Fraser等，1992，生物化学，3110716-23；Coria等，1988，实验室研究，58454-8)。正如本领域所公知的，与上述每一种疾病相关的βAP的确切氨基酸组成和大小可以不同(参见上文以及Wisniewski等，1991，生物化学生物物理学研究通讯，1791247-54和1991，生物化学生物物理学研究通讯，1801528[印刷错误]；Preli等，1990，生物化学生物物理学研究通讯，170301-307；Levy等，1990，科学，2481124-26)。
另一方面，神经变性疾病是亚急性海绵状脑病，例如(但不限于)绵羊疯痒病，克雅氏病，Gerstermann-Straussler病，库鲁病，杂交鹿和驼鹿的慢性消耗性疾病，家畜的牛海绵状脑病，和水貂传染性脑病。
本发明涉及评估源于任何动物的淀粉样多肽的凝聚形式，所述动物更优选为包括人在内的哺乳动物，以及诸如犬、猫、马、牛、猪、豚鼠、小鼠和大鼠的哺乳动物。
在本文中，术语“大约”或“大致”表示在特定值的50％以内，优选20％以内，更优选10％以内，更优选5％以内，最优选1％以内。另外，术语“大约”或“大致”表示一个值可以在这种类型值的学术上可以接受的误差范围内，该误差范围取决于现有工具能提供何种定性测量。“大约”或“大致”可以定义为平均值左右的分布，而不是单一的值。
淀粉样蛋白形成的诱导一般，淀粉样多肽的凝聚是取决于浓度和时间的事情。将淀粉样多肽溶解在合适的缓冲液中，优选溶解在具有与生理条件相当的离子强度的缓冲液中，如磷酸缓冲的盐溶液(PBS)，TRISTM缓冲液，HEPESTM缓冲液，或NEUROBASALTM介质。用常规方法，如下文所述的方法检测凝聚的淀粉样多肽。
可以在凝聚之前或之后通过让结合淀粉样蛋白的染料与淀粉样多肽接触来评估凝聚形式。可以与淀粉样多肽大致相同的浓度(摩尔浓度)提供淀粉样蛋白专一性光谱学探针，或者以略高或略低的浓度提供，前提是(a)可以在现有的分光计上检测由所述染料发出的光谱信号和(b)由与所述多肽凝聚物复合的染料发出的信号可检测地高于由未复合的染料发出的信号。这些因素通过实验可以方便的确定。
Aβ的凝聚。在体外培养期间，在经过一个取决于浓度的滞后期以后，合成Aβ的可溶性制剂就缓慢形成纤维状凝聚物，该凝聚物类似于天然淀粉样蛋白，并且可以通过沉积或基于硫黄素T的荧光测定。在所述体外试验中，通过添加少量预先凝聚的β-淀粉样蛋白“晶种”材料可以加快可溶性Aβ的凝聚速度。
在一个具体实施方案中，在氮气流中干燥以200-400μM的浓度溶解在100％六氟异丙醇中的Aβ(1-40)。六氟异丙醇首先将所述肽的构象转化成随机缠绕状态。将所述肽膜以50μM的最终浓度溶解在pH7.4的PBS缓冲液中，进行大约5-40秒的短暂超声波处理，并进行大约5秒或更段时间的涡旋搅拌。然后让该溶液老化，以便凝聚。
另外，可以从Bachem(Torrance，CA)获得相当于42个氨基酸的Aβ的前28个氨基酸(Aβ1-28)和前40个氨基酸(Aβ1-40)的、合成的、HPLC-纯化的肽。可溶性(Aβ1-28)或(Aβ1-40)在不同浓度下的凝聚可以通过添加pH为4.7-7.5的0.1M乙酸钠启动。亚毫摩尔Aβ浓度的定量凝聚物形成可以用LeVine的方法检测(蛋白质科学，1992，404-410)。简而言之，用Perkin Elmer LS-50B荧光光度计在450±5nm激发波长下测定添加到PH6.0的10μM硫黄素-T(Aldrich)/50mM磷酸钾缓冲液中的凝聚物的荧光，并且在482±10nm波长下检测发射光。
Aβ在较低(生理学)浓度下的凝聚可以用Burdick等的方法定量(生物学化学杂志，1992，267546-554)。合成的Aβ制剂可以稀释到5nM的最终浓度，优选存在“晶种”。在37℃下培养不同的时间之后，可以评估凝聚反应。
糊精的凝聚。在体外培养期间，在经过一个取决于浓度的滞后期以后，合成糊精的可溶性制剂就缓慢形成纤维状凝聚物，该凝聚物类似于天然淀粉样蛋白(Lorenzo等，自然，1994，368756-760)，并可以用电子显微镜检测或在偏振光下通过刚果红双折射测定(Fraser等，生物物理学杂志，1991，901194-1201)。在所述体外试验中，通过添加少量预先凝聚的糊精“晶种”材料，可以加快可溶性糊精的凝聚速度。
在一个具体实施方案中，可以用标准肽合成方法获得或者从诸如Bachem(Torrance，CA)或Peninsula实验室的商业来源获得相当于37个氨基酸的人或大鼠胰岛淀粉样多肽或糊精的、合成的、HPLC-纯化的肽。亚毫摩尔糊精浓度的定量凝聚物形成可以用LeVine的方法检测(蛋白质科学，1992，404-410)。简而言之，用Perkin Elmer LS-50B荧光光度计在450±5nm激发波长下测定添加到PH6.0的10μM硫黄素-T(Aldrich)/50mM磷酸钾缓冲液中的凝聚物的荧光，并且在482±10nm波长下检测发射光。另外，在偏振光下通过刚果红双折射测定凝聚(Fraser等，同上)。可以向可溶性糊精中添加少量预先形成的凝聚物或“成核晶种”材料，并启动凝聚，例如，用0.1M乙酸钠。可以在37℃下培养可溶性糊精(250μM)和PH7.5的0.2M磷酸钠缓冲液，以便形成被称为“糊精晶种”的预先形成的凝聚物。培养之后，测定晶种制剂的蛋白浓度，并用缓冲液调节到150μM的最终浓度。
糊精在较低(生理学)浓度下的凝聚可以用Burdick等的方法定量(生物学化学杂志，1992，267546-554)。合成的糊精制剂可以稀释到5nM的最终浓度，优选存在不同的“晶种”。在37℃下培养不同的时间之后，可以评估凝聚反应。
凝聚形式的评估一旦形成了所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针与淀粉样蛋白的复合体，就可以通过光谱学方法进行评估。可以分析所述多肽或染料的光谱学特征，不过，对于多肽来说，最有用的信息是通过远紫外CD光谱学方法发现的。
远紫外CD光谱学游离多肽和淀粉样蛋白专一性光谱学探针与凝聚多肽的复合体的远紫外CD光谱，例如，大约200-260nm的光谱，提供了有关该多肽构象的信息。实际上，该光谱表示所述多肽的二色吸收。不过，尽管以前的实验数据已经证实了Aβ在凝聚时具有β-片层二级构象，但第一次观察到了不同凝聚形式的凝聚结构之间的差别并进行了评估。
下面的表提供了来自远紫外CD光谱的、有关与一种典型的磺化重氮染料刚果红复合的凝聚Aβ的构象信息表1-Aβ的远紫外CD光谱构象信息
近紫外CD光谱学近紫外CD光谱，例如，大约300-700nm的光谱，表示染料的吸收值，因此可用于评估染料和淀粉样蛋白的复合体的不同结构。多肽本身以及刚果红在近紫外部分不能产生明显的CD信号。在最大信号的强度和波长方面，染料和多肽凝聚物的复合体的CD光谱存在明显差异。
下面的表以及图2表示来自近紫外CD光谱的、有关与一种典型的磺化重氮染料刚果红复合的凝聚Aβ的某些构象差别表2-Aβ的近紫外CD光谱构象信息
紫外光谱学紫外光谱分析可以区分染料与不同凝聚形式的复合体的吸收光谱。例如，刚果红具有不同的紫外吸收和差别光谱特征，这取决于它是与预先凝聚的多肽复合或者是与共凝聚的多肽复合。优选从复合光谱中扣除凝聚的淀粉样多肽光谱，以便专门检测染料的吸收特征。
另外，通过从与凝聚的淀粉样多肽复合的染料的吸收值中扣除该染料的正常吸收值，可以获得不同的染料紫外吸收光谱。
可以获得大约200-700nm，优选大约250-700nm的紫外吸收光谱。所获得的刚果红与淀粉样肽的复合体的以及游离刚果红的光谱的差异(参见图4)表明，复合体是增色的，与游离形式的吸收值相比，550nm左右的吸收增强。刚果红与预先形成的凝聚物和共凝聚物结合的两种复合体的吸收光谱，在差别光谱中480nm左右出现负吸收。这种光谱差别的根源是由于游离的刚果红转化成了结合形式，因此在其吸收光谱中产生了红移。检查图3和4的光谱还发现了刚果红与预先形成的凝聚物的复合体在500-550nm之间的吸收增强比共凝聚物的增强明显。刚果红与淀粉样肽的复合，会导致在480nm左右光吸收的减弱，这是由于游离形式的化合物；同时，500-550nm波长范围内的光吸收加强，这是由于复合作用。
荧光光谱学诸如刚果红的染料的荧光发射或激发光谱，可用于检测淀粉样蛋白的凝聚形式。与游离形式的刚果红的发射光谱相比，刚果红与淀粉样多肽的复合体的荧光光谱略微偏向较长的波长(红移)。用500nm的激发波长记录刚果红的发射光谱。刚果红复合体的最大发射波长以大约605nm为中心。游离刚果红和存在新鲜多肽(单聚体肽)条件下的刚果红的发射光谱以大约620nm为中心。游离形式和结合形式的刚果红的激发光谱也明显不同。存在于共凝聚物和预先形成的凝聚物中的结合形式的刚果红的最大激发波长以525nm为中心。因此，与游离形式的刚果红相比，上述光谱明显红移了。荧光光谱的差异是因为刚果红在与淀粉样多肽结合时微环境改变所导致的。
除了基于强度的测定之外，其它荧光技术也可用于区分淀粉样蛋白结构，如(i)荧光各向异性方法，和(ii)时间分辨的荧光发射测定，用于在有共凝聚物和预先形成的凝聚物的条件下鉴定并分辨刚果红的衰变时间。
荧光各向异性方法荧光团的偏振化或各向异性，是由于荧光团在光线的吸收和发射之间发生角位移而出现的。角位移取决于在荧光团激发状态期间旋转扩散的速度和程度(Lakowicz，J.R.，荧光光谱法原理，Plenum出版社，纽约，1983)。所述扩散运动取决于若干因素，对于本申请来说，最重要的因素是淀粉样蛋白的分子大小和形状的变化。荧光各向异性方法可用于测定在没有和有测试化合物的条件下，在凝聚时由于蛋白-蛋白相互作用而导致的淀粉样蛋白分子大小的增加。更具体地讲，偏振化测定是基于这样的原理，即小分子是“各向同性的”；就是说，它们在溶液中能自由旋转。当它们结合或连接在大分子上时，旋转和振动较慢，从而使得发射变成各向异性。当用自发荧光小分子作探针时，在与大分子结合之后，该分子的发射被偏振化(Lee，Y.C.，生物化学杂志，1997，121(5)818-825)。荧光特征的变化能以两种方式加以利用。首先，诸如刚果红的小分子的荧光各向异性的改变，可用于确定蛋白复合体的分子大小是否不同。在第二种方法中，可以用荧光团直接标记淀粉样多肽，以便测定在两种不同条件下所述蛋白的分子大小。
在第一种情况下，在没有淀粉样蛋白的条件下通过典型的实验测定游离刚果红的荧光偏振化。与其游离形式相比，在测试化合物的共凝聚物的复合体中的结合形式的刚果红的各向异性值提高可用于评估淀粉样蛋白的大小和形状的差别，作为确定测试化合物对多肽凝聚的手段。
在第二种情况下，可以用荧光团标记过的淀粉样肽区分在有刚果红或测试化合物的条件下产生的凝聚物。在各向异性测定中，诸如钌二吡啶基复合体、荧光素、和罗丹明的荧光团是有用的探针。钌配体复合体特别适用于区分大分子量蛋白的分子大小。与诸如荧光素或罗丹明的基团相比，钌二吡啶基复合体具有400ns数量级的长衰变时间，而前者的荧光寿命正常情况下在10纳秒的数量级上。钌复合体比较长的衰变时间适用于检测在溶液中以更缓慢的时间振动的较大蛋白分子的分子量。另一方面，诸如荧光素的荧光团可用于区分分子量和大小相当于50000道尔顿的Aβ肽的较小的寡聚体。
在一个典型实验中，在有淀粉样蛋白的条件下让测试化合物或刚果红凝聚。可以用琥珀酰亚胺酯和异氰酸基团的标准连接化合法将Aβ肽与诸如荧光素、罗丹明或钌的荧光团缀合，以便获得标记肽(Szmacinski等，生物物理学化学，1996，62109-120)。在开始的实验中，测定游离荧光团的稳态各向异性。标记肽的各向异性值因为该分子的快速振动运动而较小。在有淀粉样蛋白的条件下，荧光肽的陈化能提高荧光团的各向异性值，因为淀粉样蛋白的分子量增加，并且形状改变。由于标记过的肽主要被用作荧光探针，其浓度通常比淀粉样蛋白的浓度低大约10-1000倍。
在第二个实验中，测定在陈化期间与淀粉样蛋白接触的标记过的肽的荧光各向异性值。各向异性的提高是由于该蛋白分子大小的增加。另外，各向异性值的提高可用于测定形成较大分子量的凝聚物的速度，以便鉴定测试化合物的作用。
时间分辨荧光诸如刚果红或荧光标记过的肽的荧光团的荧光衰变动力学(在荧光各向异性方法中披露)，可用于鉴定并区分测试化合物与淀粉样蛋白的复合体。该方法所根据的前提是，在与蛋白结合之后，由于结合和游离形式的抑制剂的辐射和非辐射衰变速度改变而导致了荧光寿命的改变。刚果红的荧光寿命可以用频率域或时间域装置测定。例如，可以估算刚果红或荧光标记过的肽的一种参数——平均寿命。平均寿命是结合和游离形式的荧光团的寿命和浓度的函数。另外，所述基于寿命的方法还可用于活的神经元培养物。可以用细胞的荧光图象评估游离和复合形式的刚果红的寿命分布。这种二维成像方法(FLIM或荧光寿命成像)提供了刚果红在细胞-细胞基础上的分布，这种分布是用相位流式细胞计在其通过激光束时获得的。分泌的和细胞外形式的淀粉样蛋白可以用FLIM方法鉴定。FLIM方法非常适用于在细胞培养物或组织样品中检测分泌到培养基中的淀粉样蛋白。
红外线和NMR光谱学淀粉样蛋白的红外线吸收光谱是确定与测试化合物或刚果红复合的凝聚物中的淀粉样蛋白结构的有用工具。表示肽键的羰基拉伸振动的酰胺I带的频率对肽主链达到构象敏感，并因此对多肽的二级结构敏感。β-片层结构的酰胺I带在1620-1640cm-1处吸收，并且在1680-1695cm-1的较高频率处的吸收较弱。当多肽在没有和有测试化合物或磺化染料的条件下凝聚时，淀粉样多肽构象的改变可以根据酰胺I吸收带的差异解释。
NMR同样可用于获得在有和没有测试化合物或刚果红的条件下凝聚的蛋白的结构信息。淀粉样多肽的结构可以用化学位移，优选用质子或诸如13C或15N的核位移解释。质子的化学位移更常见的是用于结构比对。有大量文献报道β-片层区对αH共振表现出低磁场位移。另一方面，螺旋部分表现出高磁场位移。根据包括5000个酰胺质子和αH位移的数据集，在螺旋和片层中的平均αH位置相差近0.8ppm，在这两种分布之间有很少的重叠(酶学方法，239卷，Part C，363-392页，1994)。酰胺质子也具有这种总体趋势，因此可以鉴定β-片层形式。与位于C-末端的酰胺质子相比，位于螺旋的N-末端的酰胺质子倾向于向低磁场位移。因此，在质子共振中的上述化学位移可用于确定在有和没有测试化合物的条件下单聚体多肽和凝聚状态的多肽的结构差异。
分析超速离心分析超速离心可以与光谱学方法组合用于测定溶液分子量，并用于评估淀粉样多肽的分子均匀度。沉降方法可用于快速确定溶液中是否存在淀粉样多肽凝聚物，以及该凝聚物的性质是可逆转的或不可逆转的。基本上有两种沉降方法沉降速度和沉降平衡。第一种方法提供了快速估算凝聚多肽的大小、形状和分子量的手段。第二种方法可用于测定多肽的漂浮分子量。可以用沉降速度和平衡方法确定在有和没有测试化合物的条件下凝聚的多肽平均分子量的差别。上述方法的应用有助于区分诸如在有刚果红或其它测试化合物的条件下形成的凝聚物的大小和性质，还可用于评估测试化合物在成核步骤或在延伸步骤中抑制多肽凝聚的效力。该信息可以补充通过光谱学方法获得的结构信息。
测定方法可以将上述一种或几种光谱学技术选择性地与诸如超速离心的非光谱学技术组合用于测定测试化合物的作用，评估其在体外抑制或解除淀粉样变性的能力。实际上，通过综合一个以上，优选本申请所披露的所有光谱学技术的结果，有可能以某种详细和肯定的程度确定测试化合物是如何影响淀粉样蛋白形成的。这些资料对于筛选和测试用于治疗与淀粉样变性相关的疾病或失调，特别是老年性痴呆的化合物具有非常重要的价值。
在本文中，术语“化合物”表示能影响淀粉样变性的任何分子或一个以上分子的复合体。本发明涉及筛选合成的小分子制剂、化合物、化学复合体、及其盐，以及筛选天然制品，如植物提取物或从发酵液中获得的材料。可以用本发明筛选方法鉴定的其它分子包括蛋白和肽片段、肽、核酸和寡核苷酸、碳水化合物、磷脂和其它脂衍生物、甾醇和甾醇衍生物、前列腺素及相关的花生四烯酸衍生物等。
在一种实施方案中，在能导致凝聚即淀粉样蛋白形成或淀粉样变性的条件下，与可溶性淀粉样多肽一起培养测试化合物。然后，让所得到的有可能是也可能不是凝聚物的材料与淀粉样蛋白专一性光谱学探针接触，并获得一种或几种光谱。在另一个实施方案中，在添加染料之前将测试化合物从多肽中除去。
在另一种实施方案中，在诱导凝聚之前，染料与测试化合物和可溶形式的淀粉样多肽一起存在。
在另一种实施方案中，用一种测试化合物处理预先形成的淀粉样多肽凝聚物，以便确定测试化合物对该凝聚物有什么样的作用(如果有作用的话)。该作用可以通过在所述凝聚物与测试化合物一起培养之后，再让它与染料接触来评估。
在另一种实施方案中，测试化合物本身可以是淀粉样蛋白专一性光谱学探针或具有生色特征，优选生荧光特征的相关分子。因此，所述测试化合物可用于检测凝聚形式，并用于破坏或抑制该凝聚形式。
所述紫外和荧光光谱学技术可方便地用于大流量筛选，因为这些技术可以改进为根据一次读出获得即时结构信息。不过，通过将上述所有技术用于所有相关光谱，有可能鉴定所述凝聚形式上更微小的差异，这将有助于从大批候选化合物中鉴定有希望的化合物。
尽管所述测定方法是在可以进行光谱学分析的体外实施的，但可以使用来自任何来源的淀粉样多肽，即天然或合成多肽。例如，可以检测可能含有Aβ的脑脊液。在另一种实施方案中，可以检测可能含有不同淀粉样多肽之一的血液、血清、或血浆。在另一种实施方案中，来自上述一种或几种来源的淀粉样多肽可以是分离的，并且在标准缓冲液中检测，因为诸如CSF和血液或血液制品的体液会影响获得清晰的光谱。
实施例通过阅读下面的实施例可以更好地理解本发明，提供这些实施例是出于说明目的而不是限定目的。
实施例1淀粉样肽原纤维生成的鉴定一直存在着确定小分子抑制剂对淀粉样肽自我组装的作用以及对细胞毒性的同步作用的兴趣。为了达到这一目的，实施定量荧光和CD方法，以便确定在有和没有刚果红的条件下肽纤维化的程度。该研究证实了(i)利用硫黄素T和CD光谱学荧光的改变同时评估β-片层构象形成；(ii)介质对肽凝聚速度影响；(iii)凝聚的肽对海马细胞的毒性，用LDH的释放作指标；和(iv)在有硫黄素的条件下，刚果红与肽的相互作用。
方法荧光光谱学。硫黄素结合淀粉样原纤维能在光谱中诱导特有的增色荧光偏移(LeVine，实验临床研究杂志，21-6，1995)。由硫黄素所诱导的荧光是淀粉样β-片层原纤维所特有的，而其它β-片层结构或可溶性寡聚体形式的肽则没有。游离的硫黄素是一种弱的荧光团，在330nm处具有最大激发光。与游离形式相比，在与淀粉样原纤维结合之后，硫黄素的荧光增强，在激发光谱中红移100nm。我们业已利用分别在440和485nm激发和发射波长下荧光强度的加强来鉴定凝聚事件。
据测定，在有刚果红的条件下，由硫黄素诱导的荧光明显淬灭。在这些实验中，在与用量逐渐增加的刚果红滴定之前，硫黄素与凝聚的肽复合。所产生的荧光强度的减弱，是由于荧光发射发生了硫黄素向刚果红的能量转移。因此，在初步测定中，仅仅依靠硫黄素的测定有可能产生假阳性结果，而本文所披露的光谱学测定能鉴定更有希望的淀粉样变性抑制剂。
圆二色性光谱学。通过所述肽在200、218、或225nm处摩尔椭圆度的改变监测该肽从随机卷曲到β-片层形式的构象改变。该测定还可用于确定CD光谱的改变与硫黄素荧光光谱的改变是否同时发生。在不同时间点扫描所述肽的CD光谱，以便使结合硫黄素的大分子组件形成与β-片层构象的出现相联系。
光谱学测定。为了测定凝聚程度，以不同的时间间隔(最多可达9小时)取所述肽的等分样品，并稀释到含有10μM硫黄素的PBS缓冲液中。在荧光测定中，肽和硫黄素的最终浓度为10μM。在该反应已经平衡5分钟之后，分别在435和485nm的激发和发射波长下测定肽-硫黄素复合体的荧光强度。利用SPEXTMfluorolog-2分光荧光计(Instruments S.A.，Jobin Yvon-Spex，Edison，New Jersey)，用435nm的激发波长和485nm的发射波长进行荧光光谱扫描。对于刚果红实验来说，用0.1-3.5微摩尔浓度的、浓度逐渐提高的刚果红滴定肽-硫黄素复合体。在上述光谱波长下测定荧光强度变化。当在平板读数计上测定荧光强度时，将肽稀释到含有10μM硫黄素的PBS缓冲液中，使最终体积为100μL。
用JASCOTMJ715型旋光分光计(Jasco，Easton，Maryland)，在室温下，在0.1cm路径长度的样品池中记录CD光谱。通常，以不同的时间间隔采集肽样品测定荧光，并用其余的溶液扫描CD光谱。在190-260nm的远紫外中记录所述肽的CD光谱。光谱结果用deg.cm3.dmol-1表示。
神经毒性测定。按照在CD和荧光测定中确定的终点使肽凝聚，并用于初级神经元细胞培养物，以便评估所述肽的细胞毒性。利用LDH的释放监测在有Aβ和刚果红的条件下细胞的生活力。
用8日龄体外(DIV)大鼠胎儿(E18)海马培养物评估Aβ(1-40)细胞毒性。用48孔培养皿培养细胞(100微升/孔)，该培养皿预先用0.1毫克/毫升聚赖氨酸以500微升/孔的用量包被，然后再用5微克/毫升的小鼠层粘连蛋白以100微升/孔的用量包被。所述细胞以92300细胞/孔的密度接种在总体积为500微升的NEUROBASALTM培养基中，该培养基含有1XB27添加剂，5％热失活的并且合格的胎牛血清，0.5mM谷胺酰胺，50μ/毫升青霉素，和0.05毫克/毫升链霉素，并且，首先放置在含有5％二氧化碳的潮湿空气中。24小时之后，用不含青霉素、链霉素和胎牛血清的新鲜培养基取代上述培养基，然后将培养物保持在含有5％二氧化碳和9％氧气的空气中。在第5天，将每一个孔里都换上新鲜培养基。在体外培养的第7天，用补充了B27的不含抗氧化剂的培养基取代上述培养基，该培养基不含青霉素、链霉素和胎牛血清。在体外培养的第8天开始毒性测试，将每一个孔换上500微升在第7天使用的培养基(作为对照处理)或换上用最后的(对照)培养基制备的实验溶液。每一种实验溶液用5个孔里的培养物测试。在体外培养的第11天，通过乳酸脱氢酶(LDH；Sigma 340-UV)测定评估毒性。将凝聚肽稀释五倍达到10μM的最终浓度，用于毒性测定。在细胞测定中，测定刚果红与预先形成的凝聚物和在共凝聚中形成的凝聚物的复合体，同时测定媒介物对照中的凝聚肽。
淀粉样肽的制备。从Anaspec(San Jose，California)购买Aβ(1-40)，并通过反相HPLC，ESI-MS和蛋白测序方法证实其化学纯度。将冷冻干燥的肽溶解在六氟异丙醇(HFIP)溶剂中，以便使肽解聚。溶解在HFIP中的肽在-80℃保存。使用之前，将肽溶液解冻，并在氮气流中蒸发溶剂。将所述肽溶解在缓冲液中，获得50μM的浓度，超声波处理大约20-40秒，然后进行大约5秒或更短时间的短暂涡旋搅拌，以便帮助溶解肽。为了确定培养基对凝聚速度的影响，将肽溶解在下面的培养基之一中PBS，50mM HEPESTM或NEUROBASALTM培养基。将肽溶液以45μM的最终浓度用100微升的体积分配到微量滴定板上。通过在旋转摇床上连续摇晃启动凝聚。
结果硫黄素结合结构的出现与所述肽的β-片层构象的形成是同时发生的。比较高的PH和离子强度能促进肽的凝聚(表3)。
表3-缓冲液和培养基对Aβ(1-40)凝聚速度的影响
每一个值都是三次测定的平均值。++表示产生了凝聚物，但是由于没有达到终点而没有定量。凝聚百分比是相对0和4小时时硫黄素/Aβ的荧光计算的。在该实验中，在旋转摇床上以500rpm的速度搅拌所述肽。*凝聚的相对速度对搅拌速度非常敏感。在PBS中陈化9小时之后，淀粉样肽从随机卷曲形式变成改变的β-片层构象。所述改变的构象的CD吸收带在225nm处有一个宽的负极端值。所述红移CD光谱可能是因为形成了缠绕的β-片层结构。
纳摩尔浓度的刚果红就能使硫黄素的荧光发射明显淬灭。纳摩尔浓度刚果红具有较高的淬灭程度，因此表明所述肽上的起始位点是饱和的。刚果红能使肽结合硫黄素的荧光淬灭超过一个数量级，而对于游离硫黄素来说，淬灭作用仅仅为50％。刚果红使荧光强度淬灭的发现与刚果红与硫黄素同时定位在凝聚的肽上吻合。
刚果红对于接触Aβ的细胞培养物具有神经保护作用。刚果红与预先形成的凝聚物和共凝聚物的复合体能减弱Aβ的毒性。在72小时的毒性测定中，凝聚的肽(陈化4小时的样品)对神经元培养物有毒性，而新鲜肽是无毒的。
讨论该实施例业已证实，随机卷曲向β-片层构象的转化是与所述肽的硫黄素结合寡聚体结构的形成同时发生的。刚果红和硫黄素与凝聚的肽的结合没有竞争。
实施例2刚果红-淀粉样蛋白复合体的光谱学评估按以下方法在有和没有刚果红的条件下陈化淀粉样肽(Aβ)将Aβ(1-40)溶解在100％六氟异丙醇中，产生200或400μM的最终浓度。为了协助肽的溶解，对该溶液进行大约5秒的简单超声波处理。将适当体积的肽溶液转移到安培瓶中，并在氮气流中蒸发溶剂。将肽膜溶解在PH7.4的PBS中，使最终浓度为50μM。对所述肽进行20秒的超声波处理，然后搅拌大约5秒。为了制备肽与刚果红的共凝聚物，以10、20或30微克/毫升的最终浓度向肽里面添加所述染料。所述肽母液(存在于媒介对照中的肽和肽+刚果红)以每孔100μL的最终体积等分到微量滴定板上。通过以500rpm的速度摇晃启动凝聚。
为了测定纤维化程度，将1等份肽样品取出，并用含有10μM荧光团——硫黄素T的PBS缓冲液稀释5倍。该样品中肽的最终浓度为10μM。用荧光计(在本发明中是SPEXTM荧光计)对游离硫黄素和肽-硫黄素复合体的荧光发射光谱进行扫描。在450nm激发波长下(485nm下的发射单色仪)硫黄素T荧光的增强表明了纤维状肽的形成。另外，在某些实验中还使用平板荧光计测定纤维化程度。在这些实验中，用TECANTM平板荧光计(Tecan U.S.Inc.，研究三角公园，北卡罗来纳)测定硫黄素T的荧光，使用440nm的激发过滤器和490nm的发射过滤器。
用CD光谱法测定在有刚果红的条件下凝聚的时间进程，以及肽从新制备状态下的随机卷曲形式向陈化状态下的β-片层形式的转化。肽陈化9小时以后，产生一种红移β-片层光谱，可能是由于形成了缠绕的β-片层结构。
为了制备刚果红与预先形成的原纤维的复合体，将陈化肽与最终浓度为10微克/毫升、20微克/毫升和30微克/毫升的刚果红混合。
CD分析在200-260nm波长之间扫描刚果红与预先凝聚的肽和肽共凝聚物的复合体的远紫外CD光谱(图1)。在200nm处的负极端值表明新鲜肽具有随机卷曲构象。
陈化能导致构象改变成β-片层形式。在没有刚果红的条件下陈化的肽的CD光谱包括225nm处的负极端值和205nm处的正极端值。225nm处的红移负吸收可能是因为形成了缠绕的β-片层结构。所述肽的预先形成的凝聚物的红移CD光谱在与刚果红复合之后没有改变。
与预先形成的凝聚物的CD光谱不同，在有刚果红的条件下陈化的肽(共凝聚物)的CD光谱由218nm左右的负CD吸收带组成，因为所述肽片层形成了典型的β-片层构象。CD光谱还提供了共凝聚物中的随机卷曲形式具有较大作用的证据。因此，暗示在有刚果红的条件下凝聚速度变慢。两种形式的肽在CD光谱上的差别是由于共凝聚物中随机卷曲形式的增加，并且，还由于所述肽的改变凝聚状态的产生。
在700-300nm之间扫描所述肽的近紫外CD光谱。该区域可用于区分刚果红复合体。缓冲液中仅有肽本身以及游离的刚果红都不能在近紫外部分产生明显的CD信号。共凝聚物和预先形成的凝聚物的CD光谱差别表现在最大吸收的强度和波长方面；共凝聚物的CD光谱弱于预先形成的凝聚物的CD光谱(图2；参见表2)。肽与刚果红的预先凝聚的复合体的CD光谱包括580nm处的负吸收和516nm处的正吸收带。CD带的强度与复合体的浓度成比例。共凝聚物的CD光谱由以545nm为中心的正带组成。复合体光谱的差别是因为产生了不同复合状态的刚果红。激子偶连的CD光谱是刚果红与具有有序β-片层构象肽复合的标志。
紫外光谱分析利用紫外光谱分析区分预先凝聚的肽和共凝聚物与刚果红的两种复合体的吸收光谱。
图3表示测出的刚果红与多肽和陈化肽的复合体的光谱差异，其中，第一种复合体是淀粉样肽与刚果红的共凝聚物，第二种复合体是刚果红与预先形成的多肽凝聚物复合形成的。因为在这两种复合体中刚果红的总浓度相同，吸收强度的差别表明，预先形成的凝聚物的复合体与共凝聚物相比是增色的。
图4表示刚果红、共凝聚物、和预先形成的凝聚物的复合体与相同浓度的游离刚果红的光谱差别，其吸收光谱集中在480nm左右，而复合形式的最大吸收值略微偏向更大波长。图4中的负吸收峰以480nm为中心，因此，原因是与淀粉样肽结合耗尽了游离的刚果红。类似地，特别是对于刚果红与预先形成的凝聚物的复合体来说，一个正吸收峰以530nm为中心，这是因为复合以后刚果红的吸收特征发生了变化。该复合体具有以530nm为中心的最大吸收值，而共凝聚物的最大吸收值在530nm处达到最大，并且将这一吸收特征保持到530nm以外部分。因此，共凝聚物和预先形成的复合体的吸收光谱，能区分共凝聚物和预先形成的复合体中的刚果红和游离状态的刚果红的内在吸收特征。出现吸收光谱的差异，是因为与非复合状态的刚果红相比，在刚果红的肽结合状态的环境中吸收光谱的改变。刚果红的上述光谱变化可能是由于刚果红的电子状态或特征发生改变而诱导的。
荧光分析刚果红复合体的荧光发射光谱是在用一种缓冲液将肽稀释5倍之后获得的。将刚果红添加到刚稀释过的纤维状肽中，并在10μM的最终肽浓度下扫描荧光光谱。在所述荧光测定中，肽和刚果红的浓度分别为10μM和8.6μM。共凝聚物和预先形成的凝聚物-复合体在荧光强度和发射波长方面的差异，是由于这两种复合体上结合位点的相对疏水性不同。
讨论本实施例所披露的光谱学结果表明，诸如刚果红的淀粉样蛋白抑制剂能与淀粉样肽形成特殊的复合体。尽管这些复合体能减弱所述肽的神经毒性，但这种物质的医学用途需要按照发病阶段加以评估。所披露的结果表明，刚果红能结合并因此减弱凝聚肽的毒性。
尽管刚果红不能完全抑制肽的随机卷曲形式向β-片层形式转变，上文所披露的结果已经证实，刚果红能稳定淀粉样肽的中间凝聚形式。能产生上述作用的抑制剂需要用老年性痴呆模型对体外活性做认真地评估，以便确定该物质是否可以作为治疗剂或预防剂服用。本文所披露的光谱学方法可用于鉴定和区分淀粉样变性的抑制剂，并用于确定抗凝聚抑制剂作用的分子机理，该抑制剂在药物开发项目中有可能成为抗老年性痴呆的制剂，以及鉴定和区分与其它疾病或失调相关的淀粉样原纤维生成的潜在抑制剂。
* * * * *本发明不局限于本文所披露的具体实施方案的范围。实际上，通过上述说明书和附图，本领域技术人员可以明白除了本文所述之外的本发明的各种改进。这样的改进被认为落入了所附权利要求书的范围。
还应当理解的是，所有的碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量值是近似值，并且是用于说明目的的。
本文所引用的所有专利、专利申请、出版物和其它材料，以其全文形式收做本文参考。
权利要求
1.一种用于确定淀粉样多肽的凝聚构象的方法，该方法包括使一种在多肽能发生凝聚作用的条件下让淀粉样蛋白专一性光谱学探针接触淀粉样肽形成的复合体的光谱特征，与淀粉样蛋白专一性探针和具有已知构象的凝聚的淀粉样多肽的复合体的预定光谱特征相关联。
2.如权利要求1的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针是淀粉样蛋白结合染料。
3.如权利要求2的方法，其中，所述淀粉样蛋白结合染料是磺化重氮染料或其类似物。
4.如权利要求3的方法，其中，所述磺化重氮染料是刚果红。
5.如权利要求1的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针是荧光团标记过的肽。
6.如权利要求1的方法，其中，所述淀粉样多肽是β-淀粉样(Aβ)肽。
7.如权利要求1的方法，其中，所述光谱特征是用淀粉样多肽的远紫外(UV)圆二色性(CD)光谱法评估的。
8.如权利要求1的方法，其中，所述光谱特征是用磺化重氮染料的近紫外(UV)圆二色性(CD)光谱法评估的。
9.如权利要求1的方法，其中，所述光谱特征是用紫外(UV)光谱法评估的。
10.如权利要求1的方法，其中，所述光谱特征是用荧光光谱法评估的。
11.如权利要求1的方法，其中，所述淀粉样多肽是以纤维状形式凝聚的。
12如权利要求1的方法，其中，所述淀粉样多肽是与淀粉样蛋白专一性光谱学探针共凝聚的。
13.一种用于检测测试化合物抑制、破坏、或解聚淀粉样蛋白形成的效果的方法，该方法包括使(a)一种淀粉样蛋白专一性光谱学探针和与测试化合物接触的凝聚的淀粉样肽的复合体的光谱特征，与(b)在没有测试化合物的条件下淀粉样蛋白专一性光谱学探针复合体的预定光谱特征相关联，其中，光谱特征的差别表明测试化合物对淀粉样蛋白的形成或稳定性有作用。
14.如权利要求13的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针与预先形成的淀粉样多肽凝聚物接触。
15.如权利要求13的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针与淀粉样多肽共凝聚。
16.如权利要求13的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针是淀粉样蛋白结合染料。
17.如权利要求16的方法，其中，所述淀粉样蛋白结合染料是磺化重氮染料或其类似物。
18.如权利要求17的方法，其中，所述磺化重氮染料是刚果红。
19.如权利要求15的方法，其中，所述淀粉样蛋白专一性光谱学探针是荧光团标记过的肽。
20.如权利要求10的方法，其中，所述淀粉样多肽是β-淀粉样(Aβ)肽。
21.如权利要求13的方法，其中，所述光谱特征是用淀粉样多肽的远紫外(UV)圆二色性(CD)光谱法评估的。
22.如权利要求13的方法，其中，所述光谱特征是用磺化重氮染料的近紫外(UV)圆二色性(CD)光谱法评估的。
23.如权利要求13的方法，其中，所述光谱特征是用紫外(UV)光谱法评估的。
24.如权利要求13的方法，其中，所述光谱特征是用荧光光谱法评估的。
25.如权利要求13的方法，其中，所述淀粉样多肽是以纤维状形式凝聚的。
全文摘要
披露了用诸如刚果红及相关类似物的淀粉样专一性光谱学探针检测各种凝聚形式的淀粉样肽的方法/测定方法。这种检测方法可用于评估在有原纤维生成的其它潜在抑制剂的条件下所述肽的凝聚状态，提供了用于在体外模型中检测凝聚作用抑制剂的模型。所述检测结果可用于确定可以介入凝聚过程的时期，以便减弱淀粉样肽对神经元细胞的毒性。在具体例子中，用圆二色性、UV吸收和荧光光谱评估β－淀粉样肽的凝聚形式。
文档编号G01N33/48GK1415074SQ00817865
公开日2003年4月30日 申请日期2000年12月1日 优先权日1999年12月29日
发明者G·克里希纳穆尔菲 申请人:美国氰胺公司