专利名称：层析材料以及使用该材料的方法
技术领域：
本发明涉及用于分离核酸混合物的层析材料以及使用该层析材料分离核酸混合物的方法。
在已知的层析法中，使用具有特定粒径和孔径的无机颗粒状层析材料，它们的表面已用硅烷化剂进行改性，以产生固定相。与形成阴离子或者阳离子交换剂的试剂反应，则导致形成最终的层析材料。
例如，国际专利申请公布WO 91/05606描述了层析用载体材料，其适合于分离各种的核酸。合适的载体包括硅胶、氧化铝、二氧化钛、多孔玻璃或者树脂。载体材料应具有3-500μm的粒径，孔径为约10-1000nm，而比表面积为5-800m2/g。该颗粒状载体的表面用烷氧基硅烷进行硅烷化。因此，还描述了层析载体材料，其是以硅胶为基础，并具有通过烷氧基硅烷与二级羟胺的反应而得到的阴离子交换剂基团。
根据欧洲专利0 104 210，描述了硅胶材料，其粒径为3-100μm，空隙大小为10-1000nm，而比表面积为5-800m2/g。这些材料用硅烷化剂进行表面处理，然后在层析法中与离子交换剂一起使用，用于分离核酸。
最后，欧洲专利0744025公开了一种层析材料，其中硅胶载体用硅烷化剂处理，而且所选择的载体材料的孔径为4-6nm。载体的粒径为1-500μm。
在使用常规颗粒状层析材料的核酸混合物的层析分离中，已发现进行此等分离是非常耗时的。例如，如果在使用改性硅胶作为层析载体的某些柱中，预期核酸在载体上的吸附时间在重力流动条件下至少为20分钟将是可以接受的。
目前已知的层析材料也具有限定的空隙率，这是因为根据主流意见，只有多孔载体，即、具有更大表面积的载体，才能保证负载足够的离子交换剂。但是，该空隙率也具有缺陷核酸分离的质量不是最佳的。这主要是由于以下事实分离期间在混合物中存在的其他物种，如RNA和蛋白质，扩散至孔中，并由此对分离过程产生负面影响。
因此，本发明的目的是提供一种层析材料，其能够在尽可能最短的时间内进行核酸分离，而且同时实现优异的核酸混合物拆分，并分离出优异纯度的核酸。
本发明的另一个目的是提供一种分离核酸混合物的方法，其能够在尽可能最短的时间内最大可能地拆分单个组分，并使它们具有尽可能最高的纯度。
本发明还涉及用根据本发明的层析材料分离核酸混合物的方法，其中核酸的层析分离是在力的作用下进行的。
最后，本发明涉及用于分离核酸混合物的试剂盒，其包含根据本发明的层析材料。该试剂盒按照所希望的设置包括根据本发明的层析材料、以及在使用所述层析材料进行核酸混合物分离时的相应缓冲液。
载体的比表面积在0.05-50m2/g的范围内，优选在1-10m2/g的范围内特别是在1-5m2/g的范围内。
适合于改性带有离子交换剂官能团的表面的纤维性材料可用作载体。载体的合适材料例如是微纤维，其中微玻璃纤维是优选的。此等材料具有无孔表面。
在优选的实施方案中，纤维性材料可以在用作载体之前进行酸或碱处理。
纤维性载体可以块状形式(in the form of amass)直接用于层析法中。但是，在进行分离时也可进一步将该块状载体处理成合适的形式。
现已发现，对于许多的应用，根据本发明的层析材料可有利地包括膜形式的载体。对于层析材料的合适容量，优选该膜具有至少0.05mm的厚度，而不管总的表面积如何。
在根据本发明的层析材料的优选实施方案中，该膜为单层的形式。然而，该膜也可以是多层的形式，这取决于所希望的分离容量。
根据本发明的层析材料的载体与硅烷化剂反应。例如，硅烷化剂可以是国际专利申请公布WO 91/05606中描述的任意一种。同样，阴离子交换剂基团或者阳离子交换剂基团也可按照已知的方法负载于固定相上。其例子描述在国际专利申请公布WO 91/05606中。
根据本发明的层析材料具有以下优点在使用该材料时，可在极短的时间内分离核酸混合物。其原因在于，即使在强力存在时，例如作用在根据本发明的层析材料(其比常规层析材料具有更高的材料密度)上的真空，对于核酸分离仍有足够的保留时间。由于可达到高的材料密度，核酸分离可在非常小的床体积下进行。洗涤和洗脱体积也因此较低。
根据本发明的层析材料可用于分离核酸混合物，其中所得的馏分具有极高的准确度和纯度。特别是在与常规颗粒状层析材料相比时，证实了这一点。为此，在分离为RNA和DNA之前和之后，使核酸混合物在根据本发明的层析材料、以及两种常规层析材料上于琼脂糖中流动。
图2显示了使用根据本发明的层析材料分离核酸混合物组分。单个泳道显示了柱中的流出物泳道L分离前清除的溶胞产物泳道D柱流动液泳道W1第一洗涤液泳道W2第二洗涤液泳道E洗脱液用常规层析材料进行相同的实验。为此请参考图3和4。在泳道中使用相同的柱流动物。
图2显示了在泳道E的洗脱物中，由质粒DNA中完全分离出RNA。另外，可以清楚地看出，在洗脱之前的单独运行没有丢失任何DNA。
图3和4显示了使用常规的颗粒状层析材料分离核酸混合物组分。特别是在图3所示的纯制中，表明在泳道E中丢失了大量的DNA。另外，如泳道W2中所示，RNA浓度的贫化较差，其中在第二洗涤流出液中继续存在显著量的RNA。
如图4所示，在使用另外一种常规层析材料时，浓度的贫化也很差。泳道W2表明在第二洗涤液中仍存在相当多的RNA。
与常规颗粒状层析材料相比，本发明层析材料的另一个优点在于在洗脱物E中不存在层析材料(细固体)的颗粒。这使得如此得到的核酸的质量大大提高。
根据本发明使用本发明的层析材料分离核酸混合物的方法的特征在于，在力的作用下进行分离。
在优选的实施方案中，本发明的方法是在施加真空下进行的。
例如，在将核酸混合物施放在根据本发明的层析材料上后，施加真空，在约20秒的时间内进行分离。这与常规硅胶柱完全相反，在使用至少10倍的床体积时，其需要的分离时间在重力流动下至少为20分钟。
根据本发明的层析材料实际上可用于所有的层析法中。这些层析法包括柱层析、自旋柱或自旋杯(spin cup)中的分离、或者大批量的分离，其中层析材料为悬浮液的形式或者吸附在反应容器、微量滴定板、移液管、搅拌棒或者测试条(test strip)上。
在自旋杯中进行层析分离时，使用离心力，使得放置在自旋杯上的样品在离心机中进行层析分离。
在使用本发明的层析材料时，可以非常有效地分离任何核酸混合物。因此，在包含大量RNA外还包含非常少量DNA的混合物中，可分离出纯度极高的DNA。另外，可完全避免使用毒性物质，如苯酚、氯仿或者溴化乙锭。再者，在不使用核糖核酸酶的情况下完整地进行分离。
图1显示了一个装有根据本发明的层析材料的层析柱的例子。底部玻璃料(2)的厚度为1mm，密封住出口。该底部玻璃料(2)放置在常规的市售塑料柱(1)中，该塑料柱的出口朝向底部变尖，用于施加真空。在该塑料柱上设置根据本发明的层析材料(3)，其为微玻璃纤维膜的形式，厚度为2mm。最后，在塑料柱的顶部设置厚度为1mm的顶部玻璃料(4)。
在所有的其他层析法中使用类似的设置，例如在自旋杯中以及在微量滴定板(96孔板)上。
根据本发明之使用本发明层析材料的用于分离核酸混合物的方法以简单的步骤梯度进行，其中包括洗涤负载有核酸混合物的层析装置，然后用合适的缓冲盐溶液洗脱所希望的核酸。在DNA与本发明的层析材料结合期间，大多数的RNA被分离，而残留的RNA在洗涤操作期间被洗出。因此，用核糖核酸酶进行处理不是必须的。
如果层析分离是在柱或者微量滴定板中进行的，则例如通过施加真空在极短的时间内按组分排列进行分离，所述时间例如是约20秒。同样，在放置于离心机中的自旋杯内可实现效率优异的分离，而且由于离心力分离可在非常短的时间内进行，例如约20秒。
根据本发明的层析材料可以各种方式进行销售。例如，以所希望的设置，与层析法所需要的装置如缓冲液一起，以试剂盒的形式提供根据本发明的层析材料。当然也可包括其他市售形式。
以下将根据实施例来说明本发明，但本发明的范围绝不仅限于这些在小制备中，使用1-3ml含有高复制质粒的培养物或者5-20ml含有低复制质粒的培养物。如果是中等或者大的制备，则相应地使用更大的量。实施例2由细菌中分离DNA在合适的离心容器中，使如实施例1中所述用于小制备的细菌培养物的量于13000×g下离心3分钟，然后完全弃掉上清液培养基。用移液管除去由离心容器边缘流回的任何培养基，而且也弃掉。
通过涡旋将沉淀的细菌完全重新悬浮在0.4ml由50mM Tris-HCl(pH8.0)/10mM EDTA/100μg/ml核糖核酸酶组成的缓冲液中。必须没有任何可见的细胞团或者细胞聚集体。
添加0.4ml由200mM氢氧化钠/0.1％(w/v)SDS组成的缓冲液，由此使经悬浮的细胞发生溶胞。上下颠倒多次，由此使悬浮细胞与溶胞缓冲液混合，直至形成均一相。由于出现了基因组细菌DNA，该相具有非常高的粘度。在室温下其保温最长5分钟。
添加0.4ml由3.1-3.4M醋酸钾(pH 5.5，含有醋酸)组成的缓冲液，由此中和溶胞混合物。添加缓冲液后，重复进行上下颠倒，以使混合物搀混在一起，直至得到均一相。该相具有低的粘度。必须没有任何可见的细胞溶胞产物的残留物。
在室温下，使在中和过程中沉淀出的细菌蛋白质和细胞残渣的沉淀物在＞13000×g下离心10分钟，然后移出澄清的上清液(“澄清的溶胞产物)。实施例3使用根据本发明的层析材料制造层析柱将5g无孔的玻璃纤维(其比表面积为5m2/g)与60g的3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷和0.13ml的三乙胺在750ml的无水二甲苯中混合。施加真空三次，然后通入氮气，由此使反应混合物脱气，接下来在没有空气和湿气的情况下在130℃加热4小时。过滤混合物，然后用二甲苯和四氢呋喃洗涤。在真空中于50℃下干燥经改性的玻璃纤维。
产物接着与750ml以及42g的二乙胺混合，并在回流下加热18小时。用二氧六环和甲醇洗涤该产物，然后在真空下于70℃干燥。经改性的玻璃纤维块具有阴离子交换剂官能团，进一步处理以形成阴离子交换膜。使玻璃纤维块在丙酮中浆液化，然后卷成适当的形式或者进行浇铸，接着干燥。切割膜，以与柱的直径相一致，然后按照图1的设置插入。
在柱上负载由实施例2中得到的澄清溶胞产物，并通过施加喷水真空由膜抽吸完全。真空泵运行至不再有液体从膜中吸出。然后关闭真空泵。
为除去非特异性结合的组分，该柱用2.5ml由100mM NaAc/HAc(pH5.0)/600mM NaCl组成的缓冲液洗涤。为此，将所述缓冲液吸移至所述柱上，然后通过施加喷水真空由膜抽吸完全。真空泵打开，直至不再有液体从基质中除去。然后关闭真空泵。在小制备和中等制备的情况下，重复该洗涤步骤一次。
使所述柱由真空室脱开，然后添加0.8ml由100mM Tris-HCl(pH8.5)/1250mM NaCl组成的缓冲液，由此将结合在膜上的质粒DNA直接洗脱至合适的容器中。为此，将该缓冲液吸移至所述柱上，然后借助于合适的冲压，手工迫使缓冲液由膜中通过。为此，应使洗脱缓冲液快速地滴过，而绝不是流过。每个小的液滴用肉眼可清楚地辨别。
洗脱液与0.7体积的异丙醇混合至完全(室温)。以此方式沉淀出的质粒DNA在＞13000×g和4℃下离心30分钟，然后弃掉上清液。沉淀的DNA用80％乙醇洗涤一次，再进行离心，然后干燥(在室温下放置或者在真空中放置)。经干燥的DNA最后在37℃下溶解在合适量的TE缓冲液或者水中10分钟。
用光谱法测量溶解的质粒DNA，然后在琼脂糖凝胶上分析。
图2显示了使用TAE缓冲液(pH 8.3)在1％琼脂糖凝胶上对混合物组分的分离。以下组分施加在单个泳道上泳道L分离前清除的溶胞产物泳道D柱流动液泳道W1第一洗涤液泳道W2第二洗涤液泳道E洗脱液泳道L、D和W1清楚地表明RNA仍存在于制剂中。然而，在泳道E的洗脱液中，清楚地显示完全分离了核酸混合物组分，仅有质粒DNA，而没有任何RNA污染。
权利要求
1.一种用于分离核酸混合物的层析材料，其具有载体以及施加在该载体上的离子交换剂官能团，其特征在于所述载体包括纤维性材料。
2.如权利要求1所述的层析材料，其特征在于所述载体的比表面积为0.05-50m2/g。
3.如权利要求1或2所述的层析材料，其特征在于所述纤维性材料是由微纤维构成的。
4.如权利要求3所述的层析材料，其特征在于所述微纤维是微玻璃纤维。
5.如权利要求1-4之一所述的层析材料，其特征在于所述纤维性材料为块状物的形式。
6.如权利要求5所述的层析材料，其特征在于所述块状物是膜的形式。
7.如权利要求5或6所述的层析材料，其特征在于所述膜的厚度至少为0.05mm。
8.如权利要求7所述的层析材料，其特征在于所述膜为单层的形式。
9.如权利要求7所述的层析材料，其特征在于所述膜为多层的形式。
10.如权利要求1-9之一所述的层析材料，其特征在于所述载体与硅烷化剂反应。
11.如权利要求10所述的层析材料，其特征在于所述阴离子交换剂基团是通过硅烷化剂连接的。
12.如权利要求10所述的层析材料，其特征在于所述阳离子交换剂基团是通过硅烷化剂连接的。
13.使用如权利要求1-12之一所述的层析材料分离核酸混合物的方法，其特征在于所述层析分离是通过力的作用进行的。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于施加真空。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于所述层析分离是在柱中或者在微量滴定板上进行的。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述分离是通过离心力进行的。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于所述分离是在离心机中的自旋杯内进行的。
18.如权利要求13-17之一所述的方法，其特征在于所述层析分离是按步骤梯度进行的。
19.如权利要求13-18之一所述的方法，其特征在于不使用核糖核酸酶。
20.用于分离核酸混合物的试剂盒，其包含如权利要求1-12之一所述的层析材料。
全文摘要
本发明涉及一种用于分离核酸混合物的层析材料，其具有载体以及施加在该载体上的离子交换剂官能团，其特征在于所述载体包括纤维性材料。另外，本发明还涉及用根据本发明的层析材料进行核酸分离的方法。
文档编号G01N30/02GK1413300SQ00817561
公开日2003年4月23日 申请日期2000年12月20日 优先权日1999年12月23日
发明者约亨·蒂特根 申请人:蒂特根博士生物技术公司