专利名称：具有精神分裂症样的认知行为异常的动物及其产生方法
技术领域：
本发明涉及以精神分裂症样的认知行为异常为特征的疾病动物模型及其产生方法。
精神分裂症的发生期主要是在青春期和青年时期，多数是慢性经过，主要是与外界交往渐渐减少，活动能力日益减低，其典型的症状表现在知觉、思想、情感、行动方面。在社会上精神病症状分为阳性症状(幻觉、妄想、思维减弱、紧张、运动障碍等)和阴性症状(情感淡化、意欲低下、病理性退隐等)，由于本疾病的特殊性，亟需确立一种系统的治疗体系，它包括早期发现、治疗、尽早返回社会并参加社会活动以及预防复发。
唯一能改善精神分裂症阳性症状的治疗药物是具有拮抗神经传递物质、多巴胺和5-羟色胺的药物。患者需要长期口服这些药物，大多数患者服用最多的药物是吩噻嗪类化合物、硫杂蒽类化合物、丁酰苯类化合物、苯甲酰胺类化合物。
除了对这些药物的作用机制研究之外，以苯丙胺为代表的兴奋剂事实上可诱发人类精神分裂症的阳性症状，因此有人曾对多巴胺的作用提出了一种假说通过多巴胺的异常作用可促使精神分裂症发作。另外，根据这些事实，慢性给药苯丙胺有时可用于精神分裂症的动物模型。具有诱发人类幻觉的药物，同样也可用作精神分裂症的动物模型。作为上述的例子，可举例所给苯环己哌啶的动物，所述药物为与记忆和学习的脑生理机能相关的谷氨酸受体抑制剂。
这些精神分裂症的动物模型多数依赖于给药时产生的暂时性脑机能异常，而并非在人当中所见到的重复出现的慢性精神分裂症的病态。另外，多巴胺拮抗药的作用主要以改善阳性症状为主，对阴性症状的改善极有限。其原因认为是没有合适的精神分裂症的动物模型。
到目前为止，有关精神分裂症的发病机理存在着各种各样的学说。其中学说之一主要以Winberger为代表的学者提出的神经发育障碍学说(文献1)，实际上什么样的生物因子以怎样的机制引起脑神经发育异常至今还不完全清楚。本发明就是为了使学说更具有科学性首次提供一种动物模型。
为了解决上述课题，本发明人特别着重上述的神经发育障碍学说。即，本发明人通过给与特定的蛋白质因子抑制脑机能的发育，或者通过表达编码蛋白质因子的基因，来产生与精神分裂症极相类似的并具有持续性认知行为异常的动物模型。
以下，是对本发明进行详细的说明，这些最佳方式的详细说明以及实施例并不表示是限定或限制本发明的有效范围。
图2是根据大鼠生后数天，针对前置刺激抑制和惊吓反应变化的测定图。
图3是针对对照给药组和EGF给药组的前置刺激抑制给与氯氮平后测定其给药效果之图。
图4是针对对照给药组和EGF给药组的前置刺激抑制和惊吓反应给与氯氮平和氟哌啶醇后测定其给药效果之图。
图5是针对生后52天和24天的大鼠，通过测定给药表皮生长因子产生的运动量异常的效果图。
图6是针对生后52天的大鼠，通过给药表皮生长因子产生的运动量异常以及通过氯氮平和氟哌啶醇来改善运动量异常的效果测定图。
图7是通过给与表皮生长因子后导致的对社会作用的异常以对嗅觉反应行为作为指标的测定图。
图8是通过能动反应法测定的给与表皮生长因子后对大鼠的学习能力带来的影响。
给与这些蛋白质因子或这些蛋白质因子表达的时期必须是在动物的发育期，应当是怀孕中的胎儿时期或出生后早些时期。本说明书中所说的发育期的幼小动物是指该动物的神经系统正处于发育阶段，神经系统发育还不完全的动物。在神经系统发育不完善的幼小动物中，蛋白质因子抑制脑机能的发育效果是显著的。例如，对于老鼠来说，从重量上判定大脑完全发育约在生后20-30天。因此本发明所使用的动物必须是在脑发育结束前才能给与蛋白质因子或使其表达。
另外，本发明所用的动物模型，除人以外的所有哺乳类动物都适用于本发明。优选动物种类为猴、黑猩猩、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠等。到目前为止多数实验数据来自于大鼠、小鼠、黑猩猩和猴，这些动物为特别优选的种类。
作为给与所述蛋白质因子或使其表达的方法大致可分为2种。其中一种方法是，直接将蛋白质因子注入动物的腹腔或皮下等。由于蛋白质因子在消化道内易被分解，所以不适于口服。蛋白质因子的给药量与该蛋白质因子的种类、动物的种类和给药方法有所不同，通常以1天为0.01mg/kg-100mg/kg适宜，优选每天0.1mg/kg-10mg/kg。有关蛋白质因子的给药方法，由于在体内该蛋白质因子被分解代谢，使体内的浓度较低，所以连续数天重复性注射药物是必要的。这些蛋白质因子可以使用通过基因重组法可在细菌内大量生产的因子或可使用来自于动物细胞的纯化蛋白质因子等。
另一种方法是，应用这些编码蛋白质因子的基因，使该蛋白质因子过量表达。有关表皮生长因子、肿瘤生长因子α、肝素结合性表皮生长因子及双调节素，它们的编码基因是已知的，应用本技术领域中常用的各种方法，可使其该蛋白质因子进行过量的表达。即，对动物的预定部位如脑室等注入上述编码蛋白质因子的基因，通过强制性使该蛋白质因子进行过量表达，进而可以产生本发明的认知行为异常的动物模型。为了使这些基因能在局部进行表达可采用如下所述方法，即重组病毒载体法、在磷酸钙中使DNA形成微小结晶经细胞吞食的磷酸钙协同沉淀法、用瞬间高压电在细胞膜上打孔的方法(电穿孔法)、DEAE-葡聚糖法以及在人工脂质膜内封入DNA并与细胞膜融合形成的脂质转染法等。另外，也可应用所谓的使用特殊的枪使金粒子与DNA结合并射入组织内的粒子枪法。采用这些方法注入的基因其结果与该蛋白质因子的给药结果相同。
另外对动物的胚胎发生初期或受精卵进行基因转换使上述蛋白质因子过量表达，通过这一操作过程可产生本发明的动物模型。为了达到这样一种目的所采用的手段一般是在显微镜下向在微玻璃管内的受精卵采用直接注入DNA的微注射法，和以胎儿胚性细胞(ES细胞)重组目的DNA并把ES细胞还原为初期胚的方法。采用这种方法，若一次产生基因导入的动物，仅需维持其动物体系，便可作为精神分裂症的动物模型。
本发明动物模型的应用，尤其适用于与精神分裂症和/或与此类似的精神病的治疗或诊断药物开发过程，同时也适用于与精神分裂症和/或与此类似的精神病的机理阐明。如上所述，精神分裂症治疗药物的开发，就现状而言，并不是能够解决所有的精神病的症状。特别是对阴性症状有显著改善的药物还未开发，究其原因是缺乏可做研究用的良好的动物模型。所以，本发明的动物模型可以解决上述的问题。另外，根据神经发育障碍学说产生的本发明的动物模型，有益于从生物化学上阐明精神分裂症的机制。本说明书所述作为认知行为异常模型的使用方法是通过本发明方法产生的动物的使用方法，意味着是一种如下所述的方法将本发明产生的动物作为开发与精神分裂症和/或与此类似的精神疾患症状的治疗或诊断药物的手段以及作为从生物化学上阐明精神分裂症的机制的方法。但是，本发明的认知行为异常的动物不仅仅限定于上述的使用方法，也可用于其它用途，这也属于本发明的范畴之内。
依据本方法产生的精神分裂症的动物模型，在神经发育结束后的生长过程中如同在精神分裂症患者中所看到的呈现持续性认知行为异常的症状。所以精神分裂症多发生在青春期或青春期以后。对本发明的动物模型中的认知行为异常的评价方法将在下面阐述。又，本说明书中所说认知行为异常是持续性的，而非暂时性的，只有时间持续10天以上才可称为认知行为异常。
作为认知行为异常的评价方法，可通过行为学方法测定惊吓反应中的前置刺激抑制、潜伏抑制、社会相互作用、动物的运动量等。有关惊吓反应中的前置刺激抑制，其评价指标与人类相同，都是以惊吓反应作为感觉-运动反应能力的试验指标。该试验的特点就是科学地、客观地来评价在精神分裂症中重点对其注意力和脑内信息处理能力的异常性。其试验就是在120分贝的大音量中在引起惊吓之前，事先在30-150毫秒内使之接受不能引起自身惊吓反应的较弱音量的刺激(前置刺激)，然后测定所需大音量突然引起惊吓反应的降低。由于这个前置刺激而造成的降低部分则称为前置刺激抑制，在精神分裂症患者和其动物模型中其前置刺激抑制显示了异常的减少是已知的(文献2)。
所说潜伏刺激就是评价由于在一系列的训练试验中进行的试验前的所谓「适应」所导致的训练抑制性，如上面所举例的前置刺激抑制和试验的图形相似(文献3)。例如在巴浦洛夫型的条件反射训练中，若已经适应了铃声(CS)而并不是事先提供食物(US)，那么铃声(CS)就等于供给食物(US)的训练而受到抑制。通常，在精神分裂症患者及其模型中，由于缺少分散注意力和/或「适应」的训练，被认为是很难完成CS事前供食的训练抑制和潜伏抑制(文献3)。
所说社会相互作用的试验可将精神分裂症患者不愿意与人接触、远离社会作为指标。在动物当中，初次看到不认识的动物时，一般都靠嗅觉进行交流，所以主要测定嗅觉活动等(文献4)。我们知道一般的精神分裂症患者及其模型，对嗅觉的指标都很低。
图2表示出生后数天分析的前置刺激抑制(图2A)和惊吓反应(图2B)程度的结果。在图2中，○表示细胞色素-C给药对照组(n＝10)的结果，▲表示表皮生长因子给药组(n＝10)的结果。图2A的前置刺激抑制测定是分别在出生后21、28、30、37、46、51、60、90天在75分贝的前置刺激中进行的。其值用平均值±SEM表示，星号表示2组的有意差(*P＜0.05，**P＜0.01)。图2B表示在120分贝音量所致的惊吓反应中，对照组大鼠和EGF大鼠的之间的差异(对照百分率)。关于图2的结果，被认为是在出生28天之后的动物存在着有意差。2.氯氮平对前置刺激抑制异常的改善效果用本动物模型评价了已被认可的作为人类精神分裂症的治疗药物为8-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-5H-二苯并[b，e][1，4]-二氮杂草(氯氮平Sigma-Aldrich Fine Chemicals)的药效，及讨论了该动物模型的对药物效果评价的可行性。氯氮平在人类重组表皮生长因子给药组和对照组(细胞色素-C给药)中是从前置刺激抑制慢性异常初次看到的出生后21天开始，以2.5mg/kg的用量每天连续注入腹腔内。到出生后30天(P30)、33天(P33)、37天(P37)时，测定了前置刺激抑制(PPI)(图3)。关于生后30天(P30)、33天(P33)、37天(P37)的结果，分别用图3A、3B、3C表示。用氯氮平治疗9天后也就是在大鼠出生后30天时，在表皮生长因子给药组(EGF CZP)中与细胞色素-C给药组(Cont CZP)相比，前置刺激抑制的异常是有意义的(图3A)，但在大鼠生后33天(P33)或37天(P37)时，在表皮生长因子给药组(EGF CZP)中与细胞色素-C给药组(Cont CZP)之间的前置刺激抑制的有意差消失了(图3B、3C)。
同样，也对作为人类精神分裂症的治疗药物4-(4-[p-氯苯]-4-羟基哌啶子基-4′-氟丙基苯基甲酮(氟哌啶醇Sigma-Aldrich Fine Chemicals)进行了评价。氟哌啶醇采用腹腔注射，剂量为0.3mg/kg。图4分别对下例4组进行了探讨，即作为载体注入生理盐水的大鼠对照组(CON/VEH)、注入生理盐水的表皮生长因子给药组(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生长因子给药组(EGF/CLZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生长因子给药组(EGF/HPD，n＝6)。生理盐水、氯氮平、氟哌啶醇的给药时间均为一周。在最后一次给药23小时之后，又对各组大鼠进行了试验。图4A是在75分贝的前置刺激强度时的前置刺激抑制的数据，星号表示与CON/VEH组比较的有意差(*p＜0.05、**p＜0.01)。图4A显示了氯氮平给药后使前置刺激抑制得到显著的改善。但是，氟哌啶醇给药则无显著变化。图4B显示各组对120分贝音量的惊吓反应的程度(相对CON/VEH组的百分率)。与CON/VEH组比较，在表皮生长因子给药组中，显示惊吓反应有意义的增高，而上述的抗精神病药物对于120分贝的惊吓反应是无效的。3.表皮生长因子给药后导致运动量的持续异常测定了动物出生后第24天和第52天的运动量。方法是对出生后第24天，使用运动量测量装置(Neuro Science)进行了自动测定。在第52天时，测定了水平运动和垂直运动，这种运动是在51×51×80cm的箱子内进行的，其中每隔17cm画一条线，测定10分钟越过线的次数以及跳跃的次数。
图5表示出生后24天(P24)和52天(P52)水平运动(Line Cross)和垂直运动(Rearing)次数的平均值(±SEM)。图5A表示出生后24天的结果(n＝10、雌性8只，雄性7只)，图5B表示出生后52天的结果(n＝10、雌雄各5只)。图5左侧纵轴表示水平运动的次数，右侧纵轴表示垂直运动的次数。左半部的柱状线表示越线的次数，右半部的柱状线表示跳跃的次数。白柱表示给药对照组(CON)，黑柱表示表皮生长因子给药组(EGF)。
就生后24天而言，表皮生长因子给药组(EGF)和细胞色素-C给药组(CON)相比，在水平、垂直两项运动量中没有观察到有意义差(图5A)。如果让动物继续发育，当出生后52天具有生殖功能时与细胞色素-C给药组比较，则在表皮生长因子给药组的垂直运动的次数上观察到有意义的改变(图5B)。这些都与人类精神分裂症的发病时期以青春期后多发相一致。
另外，使用生后52天的大鼠针对运动量方面抗精神病药物的效果进行了探讨。图6表示是对下列4组进行探讨的结果，即注入作为载体的生理盐水的对照组(CON/VEH)、注入生理盐水的表皮生长因子给药组(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生长因子给药组(EGF/CLOZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生长因子给药组(EGF/HAL，n＝6)。各组雌雄动物数相同。生理盐水、氟哌啶醇、氯氮平给药时间为三周，最后一次给药48小时后，对各组进行了试验。星号(*)和井号(#)分别表示与CON/VEH组和与EGF/VEH组之比的有意差(*p＜0.05、#p＜0.05)。如图6所示，由于慢性注入氟哌啶醇和氯氮平，使EGF大鼠组的垂直运动有意义的减少了。但是，这些药物对水平运动是无效的。4.表皮生长因子给药后所致社会相互作用的异常按照File等的方法，对表皮生长因子给药后所致大鼠社会相互作用的异常情况进行了探讨。用出生后52天龄的大鼠2只。观察了2只大鼠之间对嗅觉反应的行为并以对嗅觉反应行为的时间作为陌生的指标。在评价社会相互作用的试验里，造成一种环境就是在对照组和表皮生长因子给药组中引起大鼠产生回避行为。具体的是在并不适应强光的环境中，即在很宽敞的地方观察对嗅觉反应的行为。两组动物对嗅觉反应的行为用摄象机拍摄下来，再记录这两组动物对嗅觉反应的行为(图7)。
图7纵轴表示对嗅觉反应行为时间的平均值(±SEM)。下面用4组探讨了对嗅觉反应的行为。即注入作为载体的生理盐水的大鼠对照组(CON/VEH)、注入生理盐水的表皮生长因子给药组(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生长因子给药组(EGF/CLOZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生长因子给药组(EGF/HAL，n＝6)。EGF处理过的大鼠，在其处理前三周给药氯氮平或氟哌啶醇，最后一次给药48小时后，对各组分别进行试验。星号表示与CON/VEH组比较的有意差(**p＜0.01)。与对照大鼠组相比，在表皮生长因子给药组中，对不曾认识的对方动物对嗅觉反应的行为显著地减低(CON/VEH)。另外，在表皮生长因子给药组中，对减低的嗅觉反应的行为通过氯氮平给药后可恢复(EGF/CLOZ)。然而，氟哌啶醇对嗅觉反应行为的恢复是无效的(EGF/HAL)。5.通过主动回避反应探讨训练能力通过主动回避反应对训练能力进行了探讨。主动回避试验采用了生后51-60天龄的大鼠，并在穿梭盒子中进行了试验(1天进行10次)。这里所述的条件刺激(conditioning stimulusCS)是指，给与80分贝的音量和室内光5秒钟的刺激。当进行条件刺激(CS)时，为了使其刺激停止回避下面将要叙述的无条件刺激(unconditioned stimulusUS)，必须将试验动物移动到穿梭盒子装置的另一方(回避行为)。这里所述无条件刺激(US)，使用电休克刺激，用0.6mA强度的恒定电流通过10秒钟，研究并探讨动物通过训练学习是否能够回避电休克。
图8表示各训练次数中显示的回避反应的百分比的平均值(±SEM)。图8中的○表示细胞色素-C给药对照组(CONn＝10)，▲表示表皮生长因子给药组(EGFn＝10)。有关回避电休克的能力，在训练中两组都有显著的改善，但没有明显的差别。另外，有关反应的时间或越过穿梭盒子中两侧的次数，两组间无差别。在发育阶段中经过EGF处理的动物学习能力是正常的，这可排除脑机能损害的可能性。
由本发明提供的精神分裂症样的认知行为异常的动物模型，是通过特定蛋白质因子抑制脑机能的发育而产生的模型。通过应用本发明的动物可开发或评价精神分裂症的治疗药物和诊断药物。
参考文献1. Weinberger DR.Arch.Gen Psychiatry 44660-669(1987)2. BraffDL，Geyer MA.Arch Gen Psychiatry 47181-188(1990)3. Brauch I，Hemsley DR，Gray JA.J.Nerv.Ment.Dis.176598-606(1991)4. Sams-Dodd F.Rev Neurosci.10(1)59-90.(1999).5. Morrison R；“Neurotrophic Factors”Loughlin SE and Fallon JH eds.Academic Press，Chaptor11339-357(1993)
权利要求
1.一种诱导产生具有持续性认知行为异常的动物的方法，该方法包括针对发育期的幼小动物多次给与或连续给与选自表皮生长因子、肿瘤生长因子α、肝素结合性表皮生长因子和双调节素。
2.一种根据权利要求1所述方法诱导产生的具有持续性认知行为异常的动物。
3.一种使用根据权利要求1所述方法产生的动物作为具有持续性认知行为异常的模型的方法。
4.一种诱导产生具有持续性认知行为异常的动物的方法，该方法包括在发育期的幼小动物中局部导入编码蛋白质因子的基因并使该蛋白质因子在所述动物体内表达，所述蛋白质因子选自表皮生长因子、肿瘤生长因子α、肝素结合性表皮生长因子和双调节素。
5.一种根据权利要求4所述方法诱导产生的具有持续性认知行为异常的动物。
6.一种使用根据权利要求4所述方法产生的动物作为具有持续性认知行为异常的模型的方法。
7.一种诱导产生具有持续性认知行为异常的动物的方法，该方法包括将编码蛋白质因子的基因导入动物发育的初期胚或受精卵中，经过基因转导使该蛋白质因子在由所述初期胚或受精卵发育成的动物个体中表达，所述蛋白质因子选自表皮生长因子、肿瘤生长因子α、肝素结合性表皮生长因子和双调节素。
8.一种根据权利要求7所述方法诱导产生的具有持续性认知行为异常的动物。
9.一种使用根据权利要求7所述方法产生的动物作为具有持续性认知行为异常的模型的方法。
全文摘要
为了提供与精神分裂症极相类似的具有慢性认知行为异常的动物，采用发育期的幼小动物，给与特定的蛋白质因子抑制脑的机能发育，从而产生了认知行为异常的动物。本发明所认定的认知行为异常的动物与精神分裂症极相类似，它对开发治疗和诊断精神分裂症的药物是有用的。
文档编号G01N33/15GK1392772SQ01803071
公开日2003年1月22日 申请日期2001年10月10日 优先权日2000年10月10日
发明者那波宏之, 二村隆史 申请人:新澙大学校长代表的日本国