专利名称：使用飞行时间型二次离子质量分析法的探针载体的分析方法
技术领域：
本发明涉及使用飞行时间型二次离子质量分析法的探针载体的分析方法、具体讲涉及通过飞行时间型二次离子质量分析法，对以矩阵状固定于探针载体上的探针状态进行分析的方法，例如使固定了多个核酸探针的探针载体表面上的矩阵成像，或对构成该矩阵的核酸探针进行定量分析的方法。另外，本发明涉及例如使用在基板上以矩阵状配置了很多核酸探针的所谓核酸芯片的靶核酸检测、分析方法。
背景技术：
作为探针载体例子的DNA芯片、RNA芯片等核酸芯片已经可以用于基因组解析、或基因表达解析等目的中，而这些解析结果预期可以对癌、遗传病、生活习惯病、传染病等诊断、预后予测、治疗方针的决定等提供重要的指标。
核酸芯片的制作方法中几种方法已为人们所知。如果以DNA芯片为例说明的话，有在基板上使用光刻(蚀)法逐个地合成DNA探针的方法(美国专利第5405783公报等)、或将预先合成的DNA或cDNA(互补DNA)供给到基板上进行结合的方法(美国专利第5601980公报、特开平11-187900号公报、Science Vol.270，467，1995等)为代表的的DNA芯片制作法。
一般来说，通过其中的任一个方法都可制作核酸芯片，将该芯片与以检测为目的的核酸，所谓的含有靶核酸的溶液置于杂交条件后，通过某个手段检测核酸芯片上核酸探针与该靶核酸有无形成杂交体，达到所期望的目的。
此时，为了保证解析的可靠性、即定量性、再现性，重要的是要知道与存在于各矩阵的核酸探针或与核酸探针形成杂交体的靶核酸或双方的量，即密度。另外，了解实际以什么样的矩阵形状(形状、大小、状态)存在(成像)从确保定量性、再现性的观点考虑也很重要。
另外，就象下面特别叙述的那样，当在用于芯片制作的基板不存在用来表示矩阵位置的物理地址时，如果通过例如喷墨法用将探针溶液以微小液滴供给的那样手法制作芯片，由于没有物理地址，存在着通过检测手段不知道分析芯片的哪一部分的问题。这样情况下，需要通过采用的检测手段本身对矩阵位置显影。
然而，芯片上的核酸探针或核酸探针与靶核酸的杂交体由于从原理上讲是以单分子膜水平存在的，对于这些分析基本上需要极高灵敏度的表面解析技术。
作为这样高灵敏度的表面解析技术，已知有对核酸探针和/或靶核酸进行同位素标记的方法，但由于手法繁杂、危险，需要特殊的施设、装置等理由，所以大多不是一般常用的。
作为其他的方法，考虑了对核酸探针和/或靶核酸进行荧光标记的方法，实际一般使用对靶核酸进行荧光标记，即所谓的荧光杂交法，但存在着荧光色素的稳定性、断开、荧光色素对基板表面的非特异吸附等问题，有时还存在核酸探针和杂交体的量的把握的课题。
其他作为一般的高灵敏度表面分析手段，还有使用FT-IR(傅立叶变换红外分光)法的ATR法、XPS(X线光电子分光)法等，但无论哪一种方法都不能说是对于核酸芯片上的杂交体的定量分析、或成像用有充分的灵敏度。特别是作为核酸芯片的基板使用一般的玻璃时，例如在FT-IR(ATR)存在起因玻璃的吸收的影响、在XPS中存在过载的影响等，不能说是有效的分析手段。
作为另一个高灵敏度表面分析手段，通过激光共振离子化法(RISResonance Ionization Spectroscopy)的DNA检测方法已经由美国专利第5821060号公报公布。该方法通过照射相当于由样品表面放出的注目元素的离子化能的波长的激光束，将当该元素离子化，进行检测，作为使元素由样品表面放出的手段，公布了使用激光束的方式、使用离子的方式，但存在着只能进行特定元素的检测的问题。
另外，作为另一个高灵敏度表面分析手段，有动态的二次离子质量分析法(dynamic-SIMS)，该手法在二次离子生成的过程中，但由于有机化合物分解至小的碎片离子、或粒子，由质谱得到的化学结构信息缺乏，不适用例如与核酸有关物质的那样有机物的分析。
而作为同样的二次离子质量分析法的一个手法，人们已知的飞行时间型二次离子质量分析(TOF-SIMS)法是用于研究固体样品的最表面存在什么样的原子或分子的分析方法，具有以下所述的特长。即、具有109原子/cm2(相当于最表面1原子层的1/105的量)的极微量成分的检测能力，可适用于任一种有机物、无机物，可以测定表面存在的所有元素或化合物，可以进行来自存在于样品表面的物质的二次离子成像。
以下，对该方法的原理进行简单说明。
在高真空中，如果将高速离子束(一次离子)照射到固体样品表面，由于溅射现象，表面的构成成分释放到真空中。此时由于电场作用将发生的带有正或负电荷的离子(二次离子)聚束到一个方向，在离开一定距离的位置进行检测。在溅射时，对应于样品表面的组成带有各种各样质量的二次离子产生，由于越轻的离子飞行速度越快，反之，越重的离子飞行速度越慢，通过对从二次离子发生之后直至被检测的时间(飞行时间)进行测定，可以分析产生的二次离子的质量。
以往的dynamic-SIMS中，如上所述，离子化时由于有机化合物一直分解至小的碎片离子或粒子，由质谱得到的化学结构信息缺乏，而TOF-SIMS，由于一次离子照射量极少，有机化合物以保持其化学结构的状态被离子化，由质谱可以了解有机化合物的结构。由于只有在固体样品表面的最外侧产生的二次离子释放到真空中，所以可以获得样品最表面(深数程度)的信息。
TOF-SIMS装置大致分为sector型和reflectrone型的两种类型。这些分析方法的差别之一是固定被分析样品的电极夹的电接地方法。在sector型中，在装置的机构上通过对上述电极夹外加数kV的正或负的电压，将二次离子导入质量分析计，而在reflectrone型中电极夹被接地，通过对二次离子引出电极外加数kV至数10kV的正或负的电压，将二次离子导入质量分析计。
在TOF-SIMS法中，多采用正的一次离子，不管一次离子的极性如何，正的二次离子和负的二次离子都要发生。不管一次离子极性如何，在一般的测定条件下，通过一次离子照射发生二次电子，由于该二次电子的发生量比一次离子量多，结果被分析样品的表面容易带正电，该带电电荷如果过量(所谓的过载状态)就会给测定带来麻烦。此时，如果考虑装置构成，使用sector型装置测定绝缘物的负的二次离子时可以获得带最大正电(由于发生的二次电子全部朝着外加上述正电压的二次离子引出电极)。
为了中和上述带正电，sector型、reflectrone型的两种类型往往都装备带电中和用的脉冲型电子枪。所谓利用该电子枪的具体的带电中和方法指的是一次离子(サブ～数nsec脉冲)照射、正或负的二次离子飞行时间计测后，直至照射下一次离子脉冲为止的期间内，使来自上述脉冲型电子枪的电子线向被分析样品照射一定时间。另外，在上述电子线照射被分析样品的期间，向sector型中的样品电极夹外加电压，以及向reflectrone型中的二次离子引出电极外加电压都被停止、被接地。
通过该方法，上述的带正电被抵消(或解除)，往往可以进行绝缘物的分析，由于与上述说明同样的理由，在使用sector型装置的绝缘物测定中，测定负的二次离子时由于易带最大正电，所以带电中和的界限此时最窄。反之为了避免过载，使用样品电极夹电接地的reflectrone型的装置比使用sector型装置(一般来说)更有利。特别是被分析样品导电率低时(换而言之，电阻率高，或介电率高)、例如对于玻璃等，reflectrone型更适合于测定。
另外，无论reflectrone型、还是sector型，由于TOF-SIMS法是灵敏度非常高的分析方法，所以过载的影响小，例如可以对金基板上以单分子膜水平形成的寡核苷酸进行分析(Proceeding of the12thInternational Conference on Secondary Ion Mass Spectrometry951，1999)。在该文献中，记载了固定于基板的DNA以及PNA通过TOF-SIMS法进行的分析结果，结果表明作为通过TOF-SIMS法检测的碎片离子，对于DNA探针可举如来自磷酸主链的PO2-和PO3-离子，来自碱基(胸腺嘧啶-H)-离子，另外对于PNA探针，仍然是(胸腺嘧啶-H)-离子。
然而，将上述TOF-SIMS法作为检测手段，通过使用作为一般用的方法的DNA芯片检测靶DNA，如果优选获得所期望的基因信息，由于(1)如果用TOF-SIMS法只能检测表面附近的极薄的层；以及(2)由探针DNA和靶DNA生成的碎片离子种类是同一种类的这二点理由，就会出现不能特异检测靶DNA的杂交体有无的问题。
作为解决这样问题的手段，有将PNA(肽核酸)结合于固相上做成探针，与靶核酸形成杂交体的方法(J.C.Feldner et alSIMS XIII国际会议；2001年11月11日～16日、奈良)。通过该方法，肽核酸在碱基部分虽然与DNA相同，但由于没有磷酸主链，所以如果来自磷酸主链的碎片离子能检测，那么PNA探针与靶核酸的杂交体形成就可以被确认。
然而由于肽核酸价格高，使用以肽核酸作为探针的芯片获得基因信息费用高，可以说尚未实用。而以DNA作为探针时，由于PO2-、PO3-离子的离子化效率都比较高，可与所有核苷酸结合，所有检测本身比较容易，包括以PNA作为探针的情况，核酸探针中随机含有4种碱基时，如果要检测碱基的碎片离子，从数目上是不利的，另外由于离子化效率低，检测本身往往比较困难。因此，期盼以往技术中没有的、检测效率高和对可进行定量检测的碎片离子进行检测的靶核酸的标记方法。
作为这样的碎片离子的检测方法，特开昭61-11665号公报记载了有关向通过电泳法、液相层析法、高速凝胶过滤法进行分子量分离的核酸碎片导入S、Br、I等非金属元素、或、Ag、Au、Pt、Os、Hg等金属元素之后，设置利用原子吸光分析法、等离子体发光分析法、或质量分析法对这些元素进行鉴定的手段的核酸碱基检测装置，但有关质量分析装置的具体记载、特别是卤素原子向核酸的导入方法没有记载。
另一方面，从另外观点看芯片上核酸杂交体的量的把握，实际需要对作为核酸探针领域形成的矩阵本身进行分析，作为特开平11-187900号公报中一例记载的DNA芯片的制作方法的将预先合成的DNA探针溶液利用喷墨法吐出到基板表面使其结合时，没有了解基板上矩阵(结合吐出的DNA的点)的位置的手段，对于这样的情形，优选通过TOF-SIMS法，对点上的探针或杂交体进行成像，对成像的点的碎片离子进行分析。然而，在上述特开平11-187900号公报中没有那样的记载，而在特开昭61-11665号公报中虽然提及上述那样的质量分析法，但有关通过TOF-SIMS法对芯片上的杂交体成像方法和靶核酸的量的分析完全没有记载。
即，期盼以往技术中没有的、进一步改善的检测效率和对可定量检测的碎片离子可进行检测的探针和/或靶物质的检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供可以更正确地进行固定于探针载体的探针状态的分析、例如配置位置的成像或其量的分析的探针载体分析方法。
本发明的另一个目的在于提供可以正确地进行使样品与探针载体反应的测定用样品中形成的探针与靶物质的结合体，更具体讲，核酸探针与靶核酸的杂交体形成的、例如配置位置的成像或其量的分析的测定用样品的分析方法。
本发明的方法只要是作为可识别对方形成复合体的物质，无论那一方都可固定于载体，对任一方或双方导入离子化效率高的标记、例如卤素原子作为标记，都可以适用。作为所述的物质的例子，可举抗原、抗体、酶等蛋白质、与酶特异结合的底物、或相互互补的核酸等。
本发明人等利用上述TOF-SIMS，对在电阻率比较高的载体上的面积比较大的部分的核酸探针与靶核酸的杂交体的成像和量的把握时的课题进行研究的结果，完成以下的发明。
即本发明涉及的对探针和/或可与该探针特异结合的靶物质进行检测的方法，其特征是具有准备表面配置了上述探针和/或与该探针特异结合的上述靶物质的基板的工序；以及通过飞行时间型二次离子质量分析法(TOF-SIMS)对上述基板表面进行测定的工序，对上述探针或上述靶物质用可生成经该探针或该靶物质的碎片化不被生成的碎片离子的标记物质进行标记。
本发明能够提供可以对固定在探针载体上的探针和/或该探针与靶物质的结合体(核酸时，核酸探针与靶物质的杂交体)的有无形成，以探针或杂交体被固定在载体的状态，进行其配置位置的成像或其量的分析的方法。
本发明涉及的分析方法还具有以下各个构成。
本发明涉及的测定用样品的分析方法，是在对使样品与在载体上固定探针的多个区域各自独立配置成矩阵状的探针载体反应得到的分析用样品进行分析的方法中，其特征在于，将与上述探针可特异结合的样品中靶物质用卤素原子标记，通过飞行时间型二次离子质量分析法(TOF-SIMS)测定该卤素原子，检测上述探针与上述靶物质的结合体有无形成。
通过上述构成，可以提供对使样品与固定了探针的探针载体反应的测定用样品中形成的探针与靶物质的结合体(核酸的情况，核酸探针与靶物质的杂交体)有无形成，可以以探针或杂交体被固定在载体上的状态正确进行例如其配置位置的成像或其量的分析的测定用样品的分析方法。
另外，本发明涉及的探针载体的分析方法，是利用飞行时间型二次离子质量分析法对在探针固定区域中很多探针以矩阵状配置在载体上的探针载体进行分析的方法，其特征在于，是用卤素原子标记上述探针，检测该卤素原子的碎片离子，分析上述探针的状态。
通过本发明的上述构成，可以更正确地进行固定于探针载体的探针状态、例如配置位置的成像及其量的分析。
即通过上述构成，利用飞行时间型二次离子质量分析法，通过对探针载体上卤素标记核酸探针的卤素原子进行分析，在进行核酸探针的成像的同时可以进行量的把握。
另外，本发明涉及的核酸芯片上的核酸分析方法，作为多个核酸探针以矩阵状配置在基板上的核酸芯片的分析方法，是在包括使上述核酸探针与该靶核酸杂交，构成杂交体，于该状态下同时对上述核酸探针和上述靶核酸进行分析的工序的分析方法中，其特征在于，对上述核酸探针和上述靶核酸分别用既定数的不同物质预先进行标记，通过利用飞行时间型二次离子质量分析法对各个标记物质进行分析，对被标记的上述核酸探针和被标记的上述靶核酸进行分析。
此时，上述标记物质只要不是构成核酸探针的物质，也不是构成靶核酸的物质就可以。具体来说，作为上述标记物质，最好选择可以发生与来自构成核酸探针的物质的二次离子、以及来自构成靶核酸的物质的二次离子有明显区别的二次离子的物质。
通过具有上述构成的分析方法，利用飞行时间型二次离子质量分析法，对于在核酸芯片上形成杂交体的探针核酸和靶核酸，通过分别用另外的标记物质、例如卤素原子预先进行标记，形成杂交体后，借助起因于标记的各个标记物质的二次离子的测定，可以在对探针核酸和靶核酸一个一个地进行成像的同时进行量的分析。
图1A和1B是表示实施例2中成像的结果的图，图1A表示使用序列编号1、79Br-离子的结果，图1B表示使用序列编号1、81Br-离子的结果。
图2A和2B是用于说明成像用一次离子照射中的照射方法的图，图2A表示照射点的连续形式照射，图2B表示非连续形式照射，图2B中的各个编号表示照射点的照射顺序。
图3是表示实施例2中成像结果的图，图3A表示使用序列编号1、79Br-离子的结果，图3B表示使用序列编号1、81Br-离子的结果，图3C表示使用序列编号2、79Br-离子的结果，图3D表示使用序列编号2、81Br-离子的结果；图3E表示使用序列编号3、79Br-离子的结果；而图3F表示使用序列编号4、81Br-离子的结果。
图4A、4B和4C表示实施例2中成像结果的图，图4A表示利用F-离子、图4B表示利用79Br-离子、图4C表示利用81Br-离子的成像。
图5表示根据实施例2的定量分析结果，将进行杂交后的核酸探针的标记F-离子、靶DNA的标记79Br-离子以及81Br-离子的各测定量相对于对点在核酸芯片上的核酸探针溶液中核酸探针浓度作图后的曲线。
图6表示根据实施例3的定量分析结果，将进行杂交后的核酸探针的标记F-离子、靶DNA的标记79Br-离子以及81Br-离子的各测定量相对于对与核酸芯片上核酸探针杂交的检体溶液中靶DNA浓度作图后的曲线。
具体实施例方式
在本发明中，可以使用可生成经探针或靶物质的碎片化不被生成的碎片离子的标记物质标记的探针和/或靶物质对探针载体上固定的探针或与该探针特异结合的靶物质的状态、例如配置位置或其量进行分析。
具体来说，可以利用飞行时间型二次离子质量分析法(TOF-SIMS)对来自离子化效率高的物质、最好是来自卤素原子的离子碎片进行检测。
即，当利用TOF-SIMS法进行探针载体的成像和分析时，探针载体上的探针和/或靶物质最好是用既定数的卤素原子标记，通过TOF-SIMS法对卤素原子的碎片离子进行检测、分析。
上述探针和/或上述靶物质，其特征是用可生成经该探针和/或靶物质的碎片化不被生成的碎片离子的标记物质标记的。
具体来说，可以采用以下构成。
① 当利用TOF-SIMS法进行杂交体的成像和分析时，靶物质最好是用既定数的卤素原子标记，通过TOF-SIMS法对卤素原子的碎片离子进行检测、分析。
② 通过用飞行时间型二次离子质量分析法(TOF-SIMS)检测来自标记在探针的卤素原子的离子碎片进行固定于载体上的探针状态、例如配置位置或其量的分析。即，当利用TOF-SIMS法进行探针载体的成像和分析时，探针载体上的探针最好是用既定数的卤素原子标记，通过TOF-SIMS法对卤素原子的碎片离子进行检测、分析。
③ 当使用TOF-SIMS法进行上述杂交体形成时的成像和定量分析时，对探针核酸和靶核酸分别用既定数的不同物质进行标记，对该不同物质的碎片离子通过TOF-SIMS法进行检测、分析。此时利用的标记物质如果与构成探针核酸、靶核酸的物质、核酸等构成要素不同，可以明确将来自标记物质的二次离子和起因于核酸的碎片离子区别开最好。另外，通过将探针核酸、靶核酸各个的标记物质数做成既定数，可从量上把握各个核酸。
作为本发明中的标记物质的例子，没有限定，如可举氟、氯、溴、碘等卤素原子。
由于卤素原子离子化效率比较高，所有如果利用其碎片离子，预期在检测灵敏度提高的同时，通过降低一次离子强度，过载影响也可以相应地部分排除，与下面叙述的方法并用可以在电阻率高的基板上进行大面积的成像。
本发明中使用的标记物质在TOF-SIMS分析中，最好是与探针和靶物质含有的碎片相比离子化效率高的物质。另外，对探针和靶物质双方进行标记时，可以用各个不同的标记物质进行标记。
另外，通过用既定数的卤素原子进行标记，特别应用于核酸时，可以解决只检测上述的核酸固有碎片离子时的问题，而且可以进行更高的定量分析。
还有，通过用既定数的卤素原子进行标记，可以解决只检测上述的核酸固有碎片离子时的问题，而且可以进行更高的定量分析。
用卤素原子进行的标记数没有特别限定，对于标记的位置、标记方法也适用，而且只要是不妨碍后续的探针和靶物质的结合体的形成(对于核酸，杂交体的形成(杂交))，可以使用任一方法。
实际上，对一个核苷酸标记一个位置是现实的，其意思可以说是在用卤素原子进行标记时，标记的既定数优选为从1直至上述探针核酸和靶核酸的核苷酸数的任一个数，例如、核酸是合成寡核苷酸时，考虑到标记的人工、花费、卤素原子的离子化效率的高低等，以1～5个更好。
另外，利用象PCR法那样地酶催化延伸反应，想要导入标记时，对于标记为荧光色素那样比较大的分子，由于立体障碍，标记的导入数存在上限。另外标记是卤素原子时，不会引起显著的立体障碍，例如作为延伸反应使用的核酸碱基单元，如果使用卤素修饰体，在延伸产物中，也可以对一类碱基(例如腺嘌呤)全部进行标记。因此，标记选择卤素原子时，在定量把握标记数的同时，从灵敏度、标记导入方法方面看也是优选的。
使用TOF-SIMS法时，氟、氯、溴、和碘各原子的各个二次离子可以高灵敏度检测，就象下面叙述的方法，由于可将上述4种卤素原子导入靶核酸，所以这些卤素原子适合用于本发明。
固定于载体上的探针识别特定靶物质，可与该物质形成结合体，对于核酸，核酸探针通过含有的互补序列可与靶核酸特异结合。固定于载体上的探针可以与特定靶物质特异结合，本发明方法从原理上讲不仅核酸也可以应用于可用卤素原子标记的物质、例如抗原、抗体、酶等蛋白质、或与酶特异结合的底物等。
在本发明中，对于核酸探针向载体的固定可以利用众所周知的方法，作为固定在载体上的探针的一个例子，如在由含有可与靶核酸杂交的碱基序列的寡核苷酸等构成的核酸探针一部分根据需要通过含有借助于衔接物与载体的结合部，在与载体的结合部中含有与载体表面连接的构造的探针。另外，这样构成情况中的与载体的结合部在核酸探针分子内的位置只要是在不损伤所期望的杂交反应的范围内，就没有特别限定。
本发明中的探针载体是在所定间隔，以矩阵状等配置固定了探针的独立区域、例如多个点状点的载体，所以该形态中包括探针阵列、微芯片、核酸芯片等。
另外，探针具有可与载体表面结合的结构，优选探针向载体上的固定通过这个可结合的结构进行。此时，探针含有的可与载体表面结合的结构优选是通过导入氨基、巯基、羧基、羟基、酸卤化物(卤甲酰基；-COX)、卤化物(-X)、氮丙啶、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、异硫氰酸基、磺酰氯基(-SO2Cl)、醛基(甲酰基；-CHO)、肼以及碘乙酰胺等有机官能基中的至少1种的处理形成。
另外，根据探针侧与载体结合需要的结构，对载体表面实施必要的处理、例如通过实施在载体表面形成巯基用的马来酰亚胺基、氨基用的环氧基、醛基或N-羟基琥珀酰亚胺基等，可以通过共价键固定探针。
另外，如果考虑到其稳定性，优选探针通过共价键与基板表面结合。
作为探针和靶物质的组合，可举如从核酸探针和靶核酸的组合、抗原、抗体、酶等蛋白质、与酶特异结合的底物等选择的可形成结合体的组合。
对本发明中使用的核酸探针没有特别限定，只要是可识别靶核酸，无论什么样的都可以，优选是DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互补DNA)、cRNA(互补RNA)、(来自cDNA的)PCR扩增产物中的一个，最好是将由他们中的至少1种构成的核酸探针固定于载体上。
作为本发明使用的靶核酸，如果考虑到后述的用卤素原子的标记方法，优选是DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互补DNA)、cRNA(互补RNA)、(来自cDNA的)PCR扩增产物中的一个，可以将含有由他们中的至少1种构成的靶核酸的样品作为分析对象。作为靶核酸无论是合成核酸，还是来自动物、人、植物、微生物等的天然核酸都可以。
本发明中作为测定用样品(与样品反应后进行必要处理的探针载体以下作为代表主要用“核酸芯片”说明)的成像方法，将一次离子对着核酸芯片表面具有特定面积的部分，以具有对该面积相对小的面积的点通过脉冲方式依次照射，利用对由于该脉冲照射发生的二次离子按照一次一次的脉冲照射从飞行时间上进行质量分析的方法，但此时，作为排除过载的影响的方法，按照非连续的形式进行一次离子的脉冲照射，将得到的各个质量分析结果按照一次脉冲非连续照射的形式再构成后进行图像化是极其有效、优选的方式。
以往，当利用TOF-SIMS法进行核酸芯片的成像和核酸芯片上的核酸的量的分析时，考虑到点的大小、或检测的效率等，成像区域的面积优选例如300μM×300μM以上，作为用于DNA芯片制作的基板，使用经常使用的玻璃等电阻率比较高的基板，为了获得必要的析象清晰度将一次离子束直径定为5μM，使得象电视机的显象机那样在一定的方向使离子束对300μM×300μM的范围进行依次扫描(光栅扫描)，得到图像，但过载影响大，不能获得良好的图像。
因此，在本发明中，作为核酸芯片的成像方法，使用对于该核酸芯片表面具有的特定面积的部分，以具有比该面积相对小的面积的点通过脉冲方式依次照射一次离子，对于每一个脉冲照射都对通过该脉冲照射发生的二次离子通过飞行时间进行质量分析的方法，此时，作为排除过载的影响的方法，按照非连续的形式进行一次离子的脉冲照射，按照一次脉冲照射的形式对得到的各个质量分析结果进行再构成、图像化是极其有效而且优选的方式。
此时作为非连续的形式的例子，可举如随机的图形或基于特定程序的非连续的形式。
如果用简单模型对这样的连续形式和非连续形式进行说明的话，如下所述。
图2A表示照射中的连续形式的例子，图2B表示非连续形式例子。此时，例如如果将矩形的区域以5×5个的点，作为照射一次离子脉冲的话，就象图2A表示的那样，从一个点到邻接的点依次照射所有的点的形式是连续的形式，另外就象图2B表示的那样，照射一个点，下一个点转向至少不邻接的点，依次照射全部的点的形式是非连续的形式。
非连续的形式也可以随机形成，此时对邻接的点进行连续照射的可能性也存在，也可以形成预先按照特定程序的非连续形式。作为优选的图形如上所述，可以适当采用对邻接的点不连续进行照射，或对邻接的行、列存在的点不连续进行照射等规则。
作为卤素原子，可举如氟、氯、溴、以及碘原子，利用TOF-SIMS法可以检测氟、氯、溴、以及碘原子的各碎片离子。这4种卤素原子例如可以通过以下说明的方法导入到核酸探针。
也可以通过一个一个的卤素原子对探针载体各矩阵的核酸探针进行标记。
另外，对于靶物质是否存在还不清楚的样品，用卤素原子对样品进行标记处理，使它与探针反应，当样品中存在探针可以识别的靶物质时，由于这些结合体可以形成，利用对该结合体标记的卤素原子可以进行检测。
利用TOF-SIMS法可以检测氟、氯、溴、以及碘各原子的碎片离子，还有，由于利用下面叙述的方法也可以将上述4种卤素原子导入靶核酸，在本发明中可以有效利用这些卤素原子。
对于卤素原子向靶核酸的导入方法也没有特别限定，作为人们了解的方法的例子，如使卤素原子与靶核酸的核苷酸碱基结合的方法，在本发明应用该方法也很合适。此时，卤素原子在该靶核酸与核酸探针形成杂交体时，优选结合在不妨碍该靶核酸的杂交体形成的位置。这样的位置是嘧啶碱基的5位、嘌呤碱基的8位。但是靶核酸所有的核苷酸碱基的卤素原子不一定都要结合在这个位置。
对于卤素原子向核酸探针的导入方法也没有特别限定，作为人们了解的方法的例子，如使卤素原子与核酸探针的核苷酸碱基结合的方法，在本发明应用该方法也很合适。此时，卤素原子在该核酸探针与靶核酸形成杂交体时，优选结合在不妨碍该核酸探针的杂交体形成的位置。这样的位置是嘧啶碱基的5位、嘌呤碱基的8位。但是核酸探针所有的核苷酸碱基的卤素原子不一定都要结合在这个位置。
作为卤素原子向核酸探针或靶核酸的导入的更具体方法的例子，上述核酸为合成DNA时，在用DNA自动合成仪合成DNA时，可以使用含有结合了卤素原子的合成单元、即可举使用具有以下结构式的2’-脱氧核苷-3’-亚膦酰胺的方法 (各式中、X表示卤素原子、DMTO表示二甲氧基三苯甲基、iPr表示异丙基、CNEt表示2-氰乙基)。
另外，当上述核酸为合成RNA时，用RNA自动合成仪合成RNA时，可以使用结合了卤素原子的合成单元、即核苷-3’-亚膦酰胺，作为所述的合成单元的例子，可举如具有以下结构式的化合物。
(式中、X为卤素原子(F、Cl、Br、或I)、DMTO为二甲氧基三苯甲基、iPr为异丙醇、CNEt为2-氰乙基、ME为甲基、TBDMS表示t-丁基二甲氧基硅烷基)。
另外，上述核酸是合成PNA时，在用PNA自动合成仪合成PNA时，使用结合了卤素原子的合成单元、即核酸碱基结合肽类似物合适。
另外，作为上述核酸是cDNA时的卤素原子导入法的例子，如通过逆转录酶对cDNA进行延伸合成时，可以使用结合了卤素原子的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸。
作为上述核酸是由基因组DNA诱导的DNA时的卤素原子导入法的例子，如通过DNA聚合酶对该DNA进行延伸合成时，利用结合了卤素原子的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸的方法，上述核酸是cRNA时，卤素原子向该cRNA的导入通过RNA聚合酶对该cRNA进行延伸合成时可以使用结合了卤素原子的核苷-5’-三磷酸。
在上述各延伸反应也可以使用PCR反应、或RT-PCR(逆转录PCR)反应。此时象上述那样通过延伸反应的核苷酸单体可以导入标记，另外在上述反应使用的引物的合成时也可以导入标记。
本发明中使用的核酸芯片的核酸探针或靶核酸种类没有特别限定，可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互补DNA)、cRNA(互补RNA)、寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸等。
作为本发明分析方法中可利用的标记物质的其他例子，如Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、Rh等金属、或他们的络合物，络合物中包括有机(金属)络合物。有机金属络合物向核酸的导入法方法，例如可以采用Science，Vol.262，1025，1993记载的方法。
以下举实施例，对本发明进行具体说明。这些实施例虽然是本发明的最好的实施方式的例子，但本发明并不限定于这样的实施例。
(核酸探针芯片的制作)根据特开平11-187900号公报所述方法制作核酸探针芯片。
(1)基板清洗将25.4μm×25.4μm×1μm的合成石英基板放入槽中，于用纯水稀释到10％的超声波清洗用洗剂(ブランソンGPIII)浸泡过夜。然后，于洗剂中进行20分钟超声波清洗，然后通过水洗除去洗剂。用纯水涮后，于加有纯水的容器中再进行20分钟超声波处理。然后将基板于预先加热到80℃的1N氢氧化钠水溶液浸泡10分钟。进行流水水洗、纯水清洗、提供该下面工序。
(2)表面处理将结合了氨基的硅烷偶联剂、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷 KBM603(信越化学工业)的1重量％水溶液于室温下搅拌2小时，对上述硅烷化合物分子内的甲氧基进行水解。然后将上述(1)得到的基板在室温下于该溶液浸渍1小时后，用纯水清洗，用氮气吹基板的两面，使其干燥。然后将基板在加热到120℃的烘箱中烘烤1小时后，最终将氨基导入基板表面。
然后按照终浓度0.3mg/ml将N-马来酰亚胺己酰氧琥珀酰亚胺(同仁化学研究所以下EMCS)2.7mg溶解于二甲基亚砜(DMSO)/乙醇的1∶1溶液。将进行了硅烷偶联剂处理的石英基板在该EMCS溶液中于室温下浸渍2小时，使经硅烷偶联剂处理基板表面带有的氨基与EMCS溶液的琥珀酰亚胺基反应。通过该阶段在基板表面应当存在来自EMCS的马来酰亚胺基。将从EMCS溶液取出的基板依次用DMSO和乙醇的混合溶剂以及乙醇进行清洗后、吹氮气使其干燥。
(3)探针DNA的合成委托DNA合成业者(ベツクス)合成下记序列编号1的单链核酸(dT的40聚体)。另外在序列编号1的单链DNA 5’末端在合成时通过使用巯基修饰物(グレンリサ一チ公司)导入巯基(SH)基。脱保护、DNA的回收按照常规方法进行，另外在纯化中使用HPLC。从合成一直到纯化的一系列工序全部委托合成业者进行。
序列编号15′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′(4)利用热喷墨打印机吐出DNA和向基板结合将上述序列编号1的各单链DNA按照8μM的浓度分别溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制1重量％的溶液。将使用作为热喷墨法一种的泡沫喷墨法的泡沫喷墨打印机BJF-850(佳能公司制)用的打印机头BC-50(佳能公司制)改造成可吐出数100μl溶液，将该头搭载到已经改造成可向上述石英基板上吐出的吐出绘图机。将上述DNA溶液100μl注入到改造池部，将EMCS处理基板装配到吐出绘图机上，对板进行点印。点印时的吐出量为4pl/一滴，点印范围为基板中央部10mm×10mm的范围，以200dpi即127μM的间距吐出。在该条件下点印的点的直径为约50μM。
点印结束后，将基板于加湿盒内静置30分钟，使玻璃板表面的马来酰亚胺基与核酸探针末端的巯基反应。然后用纯水清洗基板，保存在含有1M的NACl的50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0、以下称为溶液A)中。
(杂交以及通过TOF-SIMS进行的成像和分析)
(1)模型靶核酸的合成序列编号25′ A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3′ 首先合成对5’末端侧的5个腺嘌呤碱基用溴原子实施了修饰的模型标记核酸(下记序列编号2、dA的40聚体)(ベツクス)。然后该5’末端侧的5个溴修饰碱基用如下所示构造的8-溴-3’-脱氧腺苷亚膦酰胺在自动合成仪进行合成时导入。脱保护、DNA的回收按照常规方法进行，另外在纯化中使用了HPLC。由合成到纯化的一系列工序都委托合成业者进行。另外，序列中的A(Br)表示溴修饰脱氧腺苷。另外，已知作为修饰位置的腺嘌呤的8位是不妨碍杂交的位置。
(2)封闭和杂交将实施例1制作的芯片于室温下在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的溶液A中浸渍3小时，对芯片表面进行封闭(以核酸等非特异的吸附为目的)后，在按照50nM浓度溶解了上述序列编号2的模型靶核酸的溶液A中浸渍，于45℃下杂交15小时。然后，用纯水(室温)淋洗后，吹氮气干燥，在TOF-SIMS分析前保存在真空干燥器中。
(3)利用TOF-SIMS进行分析使用ION TOF社生产的TOF-SIMS IV对已杂交的DNA芯片进行成像和分析。
以下给出了装置条件。
(一次离子)
一次离子25kV Ga+、随机扫描方式一次离子的脉冲频率2.5kHz(400μsec/发射)一次离子脉冲幅度1ns一次离子束直径5μm(二次离子)对一次离子的照射图形再构成的图像二次离子检测方式阴性测定领域300μm×300μm二次离子图像的像素数128×128累计次数256(4)结果图1A和1B示出了通过TOF-SIMS IV型装置根据上述条件，对上述(2)中进行杂交的DNA芯片进行分析，由得到的数据对溴离子进行成像的结果。图1A、1B分别是来自79Br-离子、81Br-离子的结果。
表1
表1表示由图1A和1B得到的各1个点的计数的数。由图1A和1B、以及表1可知在DNA芯片上形成的核酸探针和杂交体通过溴标记靶DNA的点的标记物质溴进行成像和量的把握。
(来自基因组的溴标记靶DNA的成像和分析)(1)来自基因组的靶DNA检测用核酸芯片的制作在Nature Biotechnology Vol.18，438，2000中记载了用于检测人口腔扁平上皮癌的二个细胞系、HSC4和HSC5的基因组DNA的外显子7的变异的寡核苷酸芯片的制作以及使用该芯片，检测由上述外显子诱导的荧光标记DNA。
在本实施例中根据上述方法，制作寡核苷酸芯片，将标记由荧光换成溴合成DNA，再使用该DNA进行杂交。
以下就具体的步骤进行叙述。
(DNA探针的合成和芯片制作)序列编号35′HS-(CH2)6-O-PO2-O-GATGGGCCTCCGGTTCAT 3′与实施例1同样合成含有与上述HSC4的外显子7的碱基序列一部分(含有编号No.248的部分)互补的碱基序列，在5’末端带有用于与基板结合的巯基的上述尾序列编号3的DNA，再使用该DNA，与实施例1同样制作DNA芯片。
(2)来自基因组的溴标记DNA的合成序列编号4E7S5′-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3′(exon 7，sense)序列编号5E7A5′-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3′(exon 7，anti-sense) 5-氟-2′-脱氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，使用上述序列编号4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通过PCR反应合成来自HSC4基因组的外显子7部分。即，对于含有20ng基因组DNA和各0.4μM的有义引物、反义引物的50μl PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循环反复进行40次循环，进行PCR扩增。得到的扩增产物链长被设计为171核苷酸。
然后以扩增产物的一部分作为模板，使用0.2μM有义引物(上述序列编号4)和10μM量的上面给出其构造的一种溴标记核苷酸5-溴-2′-脱氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三种核酸碱基进行SSPCR(单链PCR)。PCR循环为96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、进行25次循环。另外，得到的溴标记单链DNA通过凝胶过滤进行纯化。
(3)封闭和杂交将上述(1)制作的芯片用与实施例1同样方法封闭后，用纯水淋洗，用于以下杂交。将实施了封闭的芯片浸渍于含有按照10nM浓度溶解的来自上述(2)合成的基因组的DNA的20％甲酰胺的6×SSPE(0.9M-NaCl、60mM-NaH2PO4、6mM-EDTA)中，于80℃加热10分钟，然后于45℃下杂交15小时，然后用2×SSPE于55℃下进行清洗操作。接下来用纯水(室温)轻轻淋洗，吹氮气干燥后、在TOF-SIMS分析前一直保存在真空干燥器中。
(4)通过TOF-SIMS进行成像和分析在与实施例2同样的条件下杂交后DNA芯片用TOF-SIMS进行成像和分析。
表2只示出了得到的数值数据。
表2
由表2可知在由基因组诱导的实施了溴标记DNA的DNA芯片上的杂交通过TOF-SIMS可进行量的把握。
另外，通过与本实施例大致同样的方法，由mRNA诱导的cDNA被卤素原子标记以及通过TOF-SIMS进行成像和分析也是可能的。
(探针结合状态的分析)首先用与实施例1同样的操作进行(1)基板清洗和(2)表面处理。
(3)核酸探针DNA的合成委托DNA合成业者(ベツクス)合成下记序列编号6～8的各单链核酸。下记序列中、碱基T表示通常的2’-脱氧胸苷，另外UBr是5-溴-2′-脱氧尿苷，在合成时用以下所示亚膦酰胺体(グレンリサ一チ公司)导入。
另外，3’末端的U(Br)使用下面所示U(Br)结合CPG柱(グレンリサ一チ)导入。导入溴的尿嘧啶的5位不妨碍杂交。
而对于这些DNA的5’末端在合成时通过使用巯基修饰物(グレンリサ一チ公司)导入巯基(SH)。另外，脱保护、DNA的回收按照常规方法进行，在纯化中使用HPLC。由合成直至纯化的一系列工序都委托合成业者进行。
序列编号65′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTU(Br)3′
序列编号75′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTU(Br)U(Br)U(Br)3′序列编号85′HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTU(Br)U(Br)U(Br)U(Br)U(Br)3′(4)利用热喷墨打印机吐出DNA和向基板结合将上述序列编号6～8的各单链DNA按照8μM的浓度分别溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制)1重量％的溶液。
用实施例1使用的吐出绘图机，将有关各个DNA的上述各DNA溶液100μl注入到改造池部，将3枚EMCS处理基板装配到吐出绘图机上，将3种DNA溶液点印到各1枚基板上。点印时的吐出量为4pl/一滴，点印范围为基板中央部10mm×10mm的范围，以200dpi即127mm的间距吐出。在该条件下点印的点的直径为约50μm。
点印结束后，将基板于加湿盒内静置30分钟，使玻璃板表面的马来酰亚胺基与核酸探针末端的巯基反应。然后用纯水清洗基板，保存在纯水中。DNA结合基板(DNA芯片)在用TOF-SIMS进行分析之前，吹氮气干燥，再于真空干燥器中进行干燥。
(通过TOF-SIMS进行成像和分析)(1)用ION TOF公司生产的TOF-SIMS IV对实施例4制作的DNA芯片进行成像和分析。以下一并给出了装置条件。
(一次离子)一次离子25kV Ga+、随机扫描方式一次离子的脉冲频率2.5kHz(400μsec/发射)一次离子脉冲幅度1ns一次离子束直径5μm(二次离子)对于一次离子的照射图形再构成的像
序列编号4E7S5′-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3′(exon 7，sense)序列编号5E7A5′-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3′(exon 7，anti-sense) 5-溴-2’-脱氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，即在实施例3中使用上述序列编号4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通过PCR反应合成来自HSC4基因组的外显子7部分。
即，对于含有20ng基因组DNA和各0.4μM的有义引物、反义引物的50μl PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循环反复进行40次循环，进行PCR扩增。得到的扩增产物链长被设计为171核苷酸。
然后以扩增产物的一部分作为模板，使用0.2μM有义引物(上述序列编号4)和10μM量的上面给出其构造的一种溴标记核苷酸5-溴-2’-脱氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三种核酸碱基进行ssPCR(单链PCR)。PCR循环为96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、进行25次循环。另外得到的溴标记单链DNA通过凝胶过滤进行纯化。而由有义引物延伸的链取代胸腺嘧啶碱基都变成了溴标记的尿苷。
② DNA芯片的制作取代EMCS处理的基板，将涂布了聚赖氨酸的载玻片(SigmaAldrich Japan)作为基板，通过与实施例4同样的方法，用泡沫喷墨法吐出上述溴标记单链DNA制作DNA芯片。将吐出了DNA溶液的基板于保湿容器中放置2小时后，用纯水清洗，然后用氮气吹纯水，进行干燥，再于100℃下加热1小时，进行干燥后，在用TOF-SIMS进行分析之前保存在真空干燥器中。
③ 利用TOF-SIMS进行成像和分析在于实施例4和同样的条件下，对②的DNA芯片用TOF-SIMS进行成像和分析。
表4只示出了得到的数值。
表4
由表4可知由从基因组诱导的实施了溴标记的DNA核酸探针构成的DNA芯片通过TOF-SIMS可进行量的把握。
利用与本实施例大致同样的方法可以对由mRNA诱导的cDNA用卤素原子进行标记和通过TOF-SIMS进行成像、以及定量分析。
(核酸探针阵列的制作)首先，按照与实施例1同样的步骤，进行(1)基板清洗和(2)表面处理。
(3)探针DNA的合成委托DNA合成业者(ベツクス)，合成40碱基长的下记序列编号9的单链核酸(对于dT的35聚体，在其3’末端侧连接5个5-氟-3’-脱氧尿苷U(F))。另外，在序列编号9的单链DNA的5’末端在合成时用巯基修饰物(グレンリサ一チ)导入巯基(SH)。DNA合成后，脱保护、DNA的回收按照常规方法进行，另外，在纯化中使用了HPLC。从合成一直到纯化的一系列工序全部委托合成业者进行。
另外，上述3’末端侧的U(F)的导入用下面结构表示的亚膦酰胺(グレンリサ一チ)进行。
另外已知取代胸腺嘧啶导入的这个U(F)的氟取代位置5位对杂交没有影响，因此，可进行与dT的40聚体同样的杂交反应。
序列编号95’HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTU(F)U(F)U(F)U(F)U(F)T 3’(4)通过热喷墨打印机吐出DNA和向基板结合将上述(3)所述的序列编号9的单链DNA分别按照终浓度10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、和0.625μM溶解于含有甘油7.5重量％、尿素7.5重量％、硫二甘醇7.5重量％、以及乙炔醇(商品名アセチレノ一ルEH；川研フアインケミカル公司制)1重量％的溶液中。
用实施例1使用的吐出绘图机，将上述DNA溶液数100μl注入到改造池部，将EMCS处理基板装配到吐出绘图机上，对EMCS处理表面进行点印。点印时的吐出量为4pl/一滴，点印范围为基板中央部10mm×10mm的范围，以200dpi、即127μm的间距吐出。在该条件下点印的点的直径约50μm。
点印结束后、将基板于加湿盒内静置30分钟，使基板表面的马来酰亚胺基与核酸探针5’末端的巯基(-SH)反应，使DNA探针固定。然后用纯水清洗基板，保存在含有1M的NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0；上述溶液A)中。DNA结合基板(DNA芯片)在用TOF-SIMS进行分析之前，吹氮气干燥，再于真空干燥器中进行干燥。
(杂交反应以及通过TOF-SIMS法进行成像和定量的分析)
(1)模型靶核酸的合成首先委托合成业者(ベツクス)合成对5’末端侧的5个腺嘌呤碱基用溴原子实施了修饰的模型标记核酸(下记序列编号10、dA的40聚体)。然后该5’末端侧的5个溴修饰碱基用如下所示构造的8-溴-3’-脱氧腺苷亚膦酰胺(グレンリサ一チ)，在自动合成仪进行合成时导入。脱保护、DNA的回收按照常规方法进行，另外，在纯化中使用了HPLC。由合成到纯化的一系列工序都委托合成业者进行。另外，序列中的A(Br)表示溴修饰脱氧腺苷。另外，已知作为修饰位置的腺嘌呤的8位是不妨碍杂交的位置。
序列编号105’ A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)A(Br)AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’ (2)封闭和杂交将实施例7制作的DNA芯片于室温下在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的溶液A中浸渍3小时，对芯片表面进行封闭(以核酸等非特异的吸附为目的)，用溶液A淋洗。然后，在按照50nM浓度溶解了上述序列编号10的模型靶核酸的溶液A中浸渍，于45℃下杂交15小时。然后，用纯水(室温)淋洗后，吹氮气干燥，在TOF-SIMS分析前保存在真空干燥器中。
(3)通过TOF-SIMS进行分析使用ION TOF公司生产TOF-SIMS IV型装置对进行了杂交的DNA芯片进行成像和分析。
以下一并给出了测定中使用的装置、条件。
(一次离子)一次离子25kV Ga+、随机扫描方式一次离子的脉冲频率2.5kHz(400μsecc/发射)一次离子脉冲幅度1ns一次离子束直径5μm(二次离子)有关一次离子的照射图形再构成的成像二次离子检测方式阴性测定领域300μm×300μm二次离子图像的像素数128×128累计次数256(4)结果用TOF-SIMS IV型装置于上述条件下对在上述(2)进行了杂交的核酸探针浓度5μM的DNA溶液制作的DNA芯片进行分析，根据得到的数据对于来自探针DNA的氟离子和来自靶DNA的溴离子分别进行二维成像的结果如图4A～4C所示。图4A是对氟(F-)离子的成像图像，图4B和4C分别是对79Br-离子、81Br-离子的成像图像。
图5是就实施例7所述的通过不同的核酸探针浓度的DNA溶液制作的5种DNA芯片，杂交后分别就各芯片上的一个点，用TOF-SIMS测定检测的氟离子、79Br-离子和81Br-离子的计数的数对使用的核酸探针浓度作的图。
通过本发明的分析方法由图4A～4C判定通过利用分别对核酸芯片上的核酸探针、以及与核酸探针形成杂交体的靶核酸进行修饰的修饰原子，在杂交体形成后可以同时而且分别成像。虽然没有给出图示，但通过对图像累加，含有核酸探针和靶核酸两方的杂交体本身也可成像。另外，来自各核酸分子的来自磷酸主链的碎片、来自核酸碱基的碎片等也可一并观察到。
另外，图5表明对于各个点，有关被固定的探针核酸量、以及靶核酸量可以同时且一个一个地进行定量是有把握。
(利用靶DNA浓度存在差别的检体进行杂交的成像和定量分析)对于用实施例7所述的探针核酸浓度10μM的DNA溶液制作DNA芯片，在分别含有500nM、50nM、5nM、1nM、和0.2nM各个浓度的实施例8所述溴修饰靶DNA的条件下，分别进行杂交，利用TOF-SIMS法进行成像和定量分析。
图6表示根据定量分析结果，将通过TOF-SIMS测定检测的氟离子、79Br-离子、和81Br-离子的计数的数对靶DNA浓度作图的结果。由图6可知DNA芯片上的探针浓度(氟离子的计数的数)对于各基板大致一定，另外根据使用的靶核酸浓度，杂交体的量发生变化由溴离子的计数的数定量是有把握。
(对来自基因组的靶DNA杂交后的成像以及定量分析模型系)(1)来自基因组的靶DNA检测用核酸芯片的制作根据实施例3说明的Nature Biotechnology Vol.18，438，2000所述荧光标记DNA检测方法，制作实施了氟标记的寡核苷酸芯片，另外合成实施了溴标记的模型靶寡核苷酸，使两者杂交。
以下按照具体的步骤进行叙述。
(1)氟标记DNA探针的合成和DNA芯片的制作作为氟标记核酸探针，利用与实施例7所述同样的合成法制作含有与上述HSC4的外显子7含有的碱基序列的一部分(含有编号No.248的部分)互补的碱基序列，而且在5’末端导入了用于与基板结合的巯基，另外取代胸腺嘧啶，结合共计5个氟标记脱氧尿苷的下记序列编号11的DNA。再用该序列编号11的DNA，通过与实施例7同样的步骤制作DNA芯片。在芯片制作时使用的溶液中探针DNA浓度为10μM。
序列编号115’HS-(CH2)6-O-PO2-O-GAU(F)GGGCCU(F)CCGGU(F)U(F)CAU(F)G3’(2)来自基因组的溴标记模型靶DNA的合成和杂交作为溴标记模型靶DNA通过与实施例8所述同样的合成法制作含有与上述序列编号11的DNA碱基序列互补的序列，取代腺苷结合了共计5个溴修饰脱氧腺苷的下记序列编号12的标记模型DNA。将该溴标记模型靶DNA和上述(1)所述DNA芯片同样置于与实施例8同样的杂交条件(靶DNA浓度50nM)下。然后，利用TOF-SIMS法进行分析。
序列编号123’CTA(Br)CCCGGA(Br)GGCCA(Br)A(Br)GTA(Br)C 5’(3)利用TOF-SIMS法进行成像和定量分析在与实施例8同样的条件下，进行封闭和杂交，杂交后的DNA芯片通过TOF-SIMS进行成像和定量分析。
表5给出了由定量分析结果得到的氟离子、79Br-离子以及81Br-离子的计数的数。
表5
表5示出了在与实施例8和实施例9的同样杂交、分析条件下的分析结果大致同样的结果，通过本发明的分析方法，与实际的探针DNA和靶DNA同样，通过对混合了4种碱基的碱基序列组也分别实施卤素标记，确认也可以对探针DNA和靶DNA一个一个地进行检测、分析。
(来自基因组的靶DNA杂交后的成像和定量分析)在本实施例就使用实施例10制作的来自基因组的靶DNA的分析用DNA芯片的实际进行来自基因组的靶DNA的成像和定量分析，举例说明。
(1)来自基因组的溴标记靶DNA的制备序列编号4E7S5’-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT-3’(exon 7，sense)序列编号5E7A5’-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3’(exon 7，anti-sense) 5-溴-2’-脱氧尿苷三磷酸(Br-dUTP)首先，使用上述序列编号4、5的PCR引物(HSC4、HSC5都委托ベツクス合成)，通过PCR反应合成来自HSC4基因组的外显子7部分。即、对于含有20ng的基因组DNA和各0.4μM的有义引物、反义引物的50μl的PCR混合物按照94℃(30秒)、60℃(45秒)的循环反复进行40次循环，进行PCR扩增。得到的扩增产物链长被设计为171核苷酸。
然后以扩增产物的一部分作为模板，使用0.2μM有义引物(上述序列编号12)和10μM量的上面给出其构造的一种溴标记核苷酸5-溴-2’-脱氧尿苷三磷酸(Sigma Aldrich Japan)，和其他三种核酸碱基进行ssPCR(单链PCR)。PCR循环为96℃(30秒)、50℃(30秒)、60℃(4分)、进行25次循环。另外，得到的溴标记单链DNA通过凝胶过滤进行纯化。而由有义引物延伸的链取代胸腺嘧啶碱基都变成了溴标记的尿苷。
(2)封闭和杂交将实施例10制作的DNA芯片用与实施例7同样的方法进行封闭后，用纯水淋洗，用于以下杂交。
将实施了封闭的DNA芯片浸渍于按照10nM浓度溶解了(2)中合成的来自基因组的溴标记单链DNA的含有20％甲酰胺的6×SSPE(0.9M-NaCl、60mM-NaH2PO4、6mM-EDTA)中，于80℃下加热10分钟，然后于45℃下杂交15小时。然后，用2×SSPE于55℃下进行清洗操作。然后，用纯水(室温)轻轻淋洗，对进行了杂交的DNA芯片吹氮气干燥后，在用TOF-SIMS法进行分析之前保存在真空干燥器中。
(3)利用TOF-SIMS法进行成像和定量分析在与实施例8同样的条件下，对杂交后DNA芯片用TOF-SIMS进行成像和定量分析。
表6给出了由定量分析结果得到的氟离子、79Br-离子、81Br-离子的计数的数。
表6
表6表明通过应用本发明分析方法，在备有氟标记探针的DNA芯片上进行由基因组诱导，实施溴标记的靶DNA杂交后，利用TOF-SIMS法对固定于DNA芯片上的探针DNA和靶DNA双方可一个一个地进行检测、分析。
另外，通过与本实施例大致同样的步骤对由mRNA诱导的cDNA也通过进行实施用卤素原子的标记的核酸探针的制作以及芯片化、和进行实施其他卤素标记的靶DNA的PCR制备，杂交后对于核酸探针和靶DNA也可以通过TOF-SIMS法进行个别的成像和分析。
序列表<110> Tadashi，OKAMOTOHiromitsu，TAKASEHiroyuki，HASHIMOTO<120> 使用飞行时间型二次离子质量分析法的探针载体的分析方法<130> CFO17354WOCN<150> JP 2002-190010<151> 2002-06-28<150> JP 2002-191391<151> 2002-06-28<150> JP 2002-191414<151> 2002-06-28<160> 11<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 用于杂交试验的探针序列<400> 1tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40<210> 2<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列
<220>
<221> modified_base<222> (1)..(5)<223> 溴化的腺嘌呤<400> 2aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40<210> 3<211> 18<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列<400> 3gatgggcctc cggttcat 18<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列<400> 4actggcctca tcttgggcct 20<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 靶的序列<400> 5tgtgcagggt ggcaagtggc 20
<210> 6<211> 39<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列<220>
<221> modified_base<222> (39)..(39)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 6tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttu 39<210> 7<211> 41<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列<220>
<221> modified_base<222> (39)..(41)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 7tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttuu u41<210> 8<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列
<220>
<221> modified_base<222> (36)..(40)<223> 溴化的尿嘧啶<400> 8tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttuuuuu 40<210> 9<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列<220>
<221> modified_base<222> (35)..(39)<223> 氟化的尿嘧啶<400> 9tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttuuuuut 40<210> 10<211> 40<212> DNA<213> 人工<220>
<223> Sequence for Target Substance<220>
<221> modified_base<222> (1)..(5)<223> 溴化的腺嘌呤<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40<210> 11<211> 19<212> DNA<213> 人工<220>
<223> 探针的序列<220>
<221> modified_base<222> (3)..(3)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (9)..(9)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (14)..(14)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (15)..(15)<223> 氟化的尿嘧啶<220>
<221> modified_base<222> (18)..(18)<223> 氟化的尿嘧啶<400> 11gaugggccuc cgguucaug 19
权利要求
1.检测方法，是用于对配置在基板上的探针和/或可与该探针特异结合的靶物质进行检测的检测方法，其特征是具有准备表面配置了所述探针和/或与该探针特异结合的所述靶物质的基板的工序；以及利用飞行时间型二次离子质量分析法测定所述基板表面的工序，对所述探针或所述靶物质通过可生成由该探针和/或该靶物质的碎片化不能生成的碎片离子的标记物质进行标记。
2.分析用样品的分析方法，在使样品与在载体上固定探针的多数区域各自独立配置成矩阵状的探针载体反应，对由该反应得到的分析用样品(载体)进行分析的方法中，其特征是用卤素原子对可与所述探针特异结合的、样品中的靶物质进行标记，通过利用飞行时间型二次离子质量分析法测定该卤素原子来检测由所述反应得到的所述探针与所述靶物质有无形成结合体。
3.探针载体的分析方法，是利用飞行时间型二次离子质量分析法对固定了探针的多数区域在载体上配置成矩阵状的探针载体进行分析的方法，其特征是用卤素原子标记所述探针，检测该卤素原子的碎片离子来分析所述探针的状态。
4.权利要求2或3所述的分析方法，其中，所述探针和/或所述靶物质是核酸。
5.核酸芯片上的核酸的分析方法，是多个核酸探针以矩阵状配置在基板上的核酸芯片的分析方法，在具有使所述核酸探针与样品中靶核酸杂交，构成杂交体，在该状态下同时对所述核酸探针和所述靶核酸进行分析的工序的方法中，其特征是对所述核酸探针和所述靶核酸分别用既定数的不同的标记物质预先进行标记，通过利用飞行时间型二次离子质量分析法分析所述各个标记物质，进行被标记的所述核酸探针和被标记的所述靶核酸的分析。
6.权利要求5所述的方法，其特征是作为所述标记物质选择使用可以发生可明确区别为来自构成所述核酸探针的物质和来自构成所述靶核酸的物质的二次离子的二次离子的物质。
7.权利要求1～6中任一项所述的分析方法，其中，利用所述飞行时间型二次离子质量分析法进行的分析是量的分析。
8.权利要求6所述的分析方法，其中，所述标记物质是卤素原子，所述核酸探针和靶物质核酸分别用各自规定数的不同卤素原子标记。
9.权利要求1～8中任一项所述的分析方法，其中，将一次离子做成具有与所述载体或核酸芯片的分析对象区域的面积相比相对小的面积的点，对该分析对象区域全体依次进行脉冲照射，对通过该脉冲照射发生的二次离子按照在分别的每一个脉冲照射时的飞行时间进行质量分析而图像化。
10.权利要求9所述的分析方法，其中，按照非连续的形式进行一次离子的脉冲照射，根据一次离子脉冲照射的非连续的形式对得到的各个质量分析结果进行再构成而图像化。
11.权利要求10所述的分析方法，其中，所述非连续的形式是随机的形式。
12.权利要求11所述的分析方法，其中，所述非连续的形式是特定的程序化的形式。
13.权利要求2～4和8～12中任一项所述的分析方法，其中所述卤素原子是氟、氯、溴和碘原子中的任一种。
14.权利要求8所述的分析方法，其中，对所述核酸探针和靶核酸进行标记的卤素原子的既定数是分别从1开始至构成所述核酸探针和靶核酸的核苷酸数的任一个数。
15.权利要求14所述的分析方法，其中，所述卤素原子的既定数是1～5个。
16.权利要求4和8～15中任一项所述的分析方法，其中，所述卤素原子结合在所述核酸探针和/或靶核酸的核苷酸的碱基上。
17.权利要求16所述的分析方法，其中，所述卤素原子在所述核酸探针与所述靶核酸形成杂交体时，结合在不妨碍与所述靶核酸的该杂交体形成的位置。
18.权利要求17所述的分析方法，其中，所述卤素原子结合在嘧啶碱基的5位或嘌呤碱基的8位。
19.权利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是合成DNA，所述卤素原子向该合成DNA中的导入在用DNA自动合成仪合成该合成DNA时，使用作为结合所述卤素原子的合成单元的2’-脱氧核苷-3’-亚膦酰胺进行。
20.权利要求18所述的分析方法，其中，结合了所述卤素原子的合成单元是用以下结构式表示 (各式中、X表示卤素原子、DMTO表示二甲氧基三苯甲基、iPr表示异丙基、CNEt表示2-氰乙基)。
21.权利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是合成RNA，所述卤素原子向该RNA中的导入是在用RNA自动合成仪合成该RNA时，使用作为结合了所述卤素原子的合成单元的核苷-3’-亚膦酰胺进行的。
22.权利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是合成PNA，所述卤素原子向该PNA中的导入是在用PNA自动合成仪合成该PNA时，使用作为结合了所述卤素原子的合成单元的核苷-3’-亚膦酰胺进行的。
23.权利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是cDNA，所述卤素原子向该cDNA的导入是在使用逆转录酶延伸合成该cDNA时，使用结合了所述卤素原子的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸进行的。
24.权利要求14所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是由基因组DNA诱导的DNA，卤素原子向该DNA中的导入是在通过DNA聚合酶延伸合成该DNA时，使用结合了所述卤素原子的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸进行的。
25.权利要求18所述的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是cRNA，所述卤素原子向该cRNA中的导入是在通过RNA聚合酶延伸合成该cRNA时，使用结合了所述卤素原子的核苷-5’-三磷酸进行的。
26.权利要求14记载的分析方法，其中，所述核酸探针和/或靶核酸是由cDNA诱导的DNA，卤素原子向该DNA中的导入是在通过DNA聚合酶延伸合成该DNA时，使用结合了所述卤素原子的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸进行的。
27.权利要求9所述的方法，其中，对所述核酸探针和所述靶核酸分别进行标记的所述各标记物质中的至少一个物质是金属或金属化合物。
28.权利要求22所述的方法，其中，所述金属或金属化合物中的金属元素选自Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、和Rh。
29.权利要求22所述的方法，其中，所述金属化合物是有机金属络合物。
30.权利要求29所述的方法，其中，所述有机金属络合物是含有选自Au、Ag、Cu、Ni、Co、Cr、Al、Ta、Pt、Pd、Zn、Sn、Ru、和Rh的金属元素的络合物。
全文摘要
本发明提供可以正确进行配置在载体上的探针状态或该探针与靶核酸有无形成杂交体的分析、例如配置位置的成像或其量的分析的测定用样品的分析方法。对使样品与探针载体反应的在测定用样品中形成的核酸探针的状态或该探针与靶核酸有无形成杂交体在通过可生成由该探针和/或靶物质的碎片化不能生成的碎片离子的标记物质进行标记的状态下，通过利用飞行时间型二次离子质量分析法进行测定检测。
文档编号G01N23/225GK1672040SQ0381810
公开日2005年9月21日 申请日期2003年6月26日 优先权日2002年6月28日
发明者冈本尚志, 高濑博光, 桥本浩行 申请人:佳能株式会社