用于体外评估个体hiv病毒感染的进展状态的方法

专利名称：用于体外评估个体hiv病毒感染的进展状态的方法
技术领域：
本发明涉及个体感染属于人类免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的进展状态的体外诊断以及这种传染病的治疗性治疗领域。
背景技术：
AIDS疾病主要由个体感染HIV逆转录病毒而引起，因为迄今为止感染HIV病毒的个体估计约达4千万人，所以AIDS疾病是目前在全世界最具破坏性的疾病。
仅在2001年间，就有5百万个体感染HIV，而同时有3百万个体死亡。自从1983年发现主要的AIDS病因物质，即HIV病毒以来，为了解这种病毒的作用机制并研制正确的方法用于(i)可重复地诊断传染病及(ii)对特定患者疾病进展的预测已做出了大量的努力。
为了监视的目的，成人或13岁或以上年龄的青少年，在存在25个AIDS指征之一的疾病如KS、PCP或弥漫性MAC，美国疾病控制中心(CDC)现在将其定义为AIDS。13岁以下儿童，AIDS的定义与青少年和成人相似，但包括列入AIDS定义疾病目录下的淋巴样间质性肺炎和复发性细菌感染(CDC，1987b)。1993年成人和青少年病例定义扩大到包括每立方毫米血中CD4+T细胞计数少于200个细胞的感染HIV病毒的个体(CDC，1992)。现在的监视定义取代了1987年公布的基于临床疾病和HIV感染证据而非CD4+T细胞测定的标准(CDC，1987)。
在临床实践中，症状学和免疫功能测量特别是CD4+T淋巴细胞水平测量常用于指导HIV感染患者的治疗。
虽然为了在实验室繁殖HIV，科学家们已经建立了永生T细胞系(Popovic等人，1984；Zagury等人，1986；Garry，1989；Clark等人，1991)，但仍有HIV于体外感染并杀伤CD4+T淋巴细胞。在体外慢病毒系统中已经观察到几种CD4+T细胞杀伤机制并可以解释HIV感染个体中这些细胞进行性的丢失(Garry综述，1989；Fauci，1993a；Pantaleo等人，1993a)。这些机制包括当HIV在细胞表面发芽或细胞内不均一分散的RNAs和非整合DNA的积累使细胞膜破裂(Pauza等人，1990；Koga等人，1988)。证据也显示细胞内络合的CD4和病毒包膜产物能导致细胞杀伤(Hoxie等人，1986)。
除了这些CD4+T细胞缺失的直接机制外，间接的机制也可导致未感染的CD4+T细胞死亡(Fauci综述，1993a；Pantaleo等人，1993a)。未感染的细胞经常与感染的细胞融合，导致称为合胞体的巨大细胞，合胞体与体外HIV的致细胞病变效应有关(Sodroski等人，1986；Lifson等人，1986)。当游离的HIV包膜蛋白质gp120结合到未感染细胞表面而使之易于受到抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应时，未感染的细胞也可以受到杀伤(Lyerly等人，1987)。因HIV包膜蛋白质与某些主要组织相容性复合体II类(MHC-II)分子有一定程度的同源性，其它自身免疫现象也导致了CD4+T细胞死亡(Golding等人，1989；Koenig等人，1988)。
许多研究者提出HIV编码或源于无关因素的超抗原可以启动大量刺激CD4+T细胞并使之扩充，最终导致这些细胞缺失或无反应性(Janeway，1991；Hugin等人，1991)。已经提出不适时地诱导产生程序性细胞死亡即凋亡是HIV感染中CD4+T细胞丢失的又一种机制(Ameisen和Capron，1991；Terai等人，1991；Laurent-Crawford等人，1991)。最近的报导指出HIV感染个体外周血和淋巴结的细胞凋亡都比非HIV感染个体广泛得多(Finkel等人，1995；Pantaleo和Fauci，1995b；Muro-Cacho等人，1995)。
还观察到HIV感染骨髓和胸腺的CD4+T细胞前体并破坏这些器官中祖先细胞最佳营养和成熟所必需的微环境(Schnittman等人，1990b；Stanley等人，1992)。这些发现可有助于解释AIDS患者CD4+T细胞群的缺乏(Fauci，1993a)。
近来的研究证明甚至在HIV感染初期外周血和胸腺组织中就有相当多的病毒负荷和活跃的病毒复制(Fox等人，1989；Coombs等人，1989；Ho等人，1989；Michael等人，1992；Bagnarelli等人，1992；Pantaleo等人，1993b；Embretson等人，1993；Piatak等人，1993)。一个小组已报道在疾病进程的早期HIV感染个体的淋巴结中25％CD4+T细胞内潜伏有HIVDNA(Embretson等人，1993)。其它数据也提议HIV感染是每天新病毒感染、破坏及替换10亿以上CD4+T细胞的连续巡回持续的动态过程(Wei等人，1995；Ho等人，1995)。
关于HIV感染患者病情进展的预测，当前第一种方法由评估患者全血样本中HIV病毒数量的增加组成，例如用特异性地直接针对HIV蛋白的抗体、特别是针对HIV衣壳糖蛋白gp120的抗体进行常规免疫测定。
当前第二种AIDS患者进展预测的方法由测量患者全血样本的HIV基因组拷贝数组成，例如通过采用与HIV基因组RNA特异性杂交的一种或几种核酸引物进行该样本核酸的定量PCR扩增。
上述这二种方法是有用的，因为众多研究已显示血流中拥有高水平HIV的人比拥有低病毒水平的个体更可能发展为AIDS相关症状或死亡。
当前的第三种针对AIDS患者进展的预测方法由测量感染患者(HIV+患者)全血中绝对CD4+T细胞水平组成，例如采用直接针对CD4抗原的抗体标记进行该患者血液样本的流式细胞术分析。
上述所有预测方法可以重复使用但也有各自的技术局限性，例如在有关疾病进展与它们的生物学意义方面的技术局限性。
由于所用抗体的特异性，评估患者生物学样本的HIV病毒粒子数量而使用抗体包括一些缺点，因为众所周知产生于不同HIV病毒分离株的HIV结构蛋白质的抗原特异性明显不同并可由此产生假阴性结果。
测量患者生物样本的HIV基因组拷贝数的确预示着已整合到感染个体细胞基因组内的前病毒已经进入了活跃的复制周期并且疾病在活跃地进展。然而，该技术不能同时反映患者针对病毒进展的免疫应答。
因为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的发病机理大多归因于具有CD4受体(CD4+)的T淋巴细胞减少，所以测量患者CD4+T细胞水平也预示疾病进展。进行性的CD4+T细胞缺失与临床并发症的增加有关。因为这种关联，所以将测量CD4+T细胞水平用于建立监测治疗AIDS相关的决定点。CD4+T淋巴细胞水平也用做人类免疫缺陷病毒(HIV)疾病患者预测的标识。
然而，测量患者CD4+T细胞水平除了能得知免疫缺陷外，并不能直接反映患者的免疫状态。特别是测量CD4+T细胞水平不能说明导致或介导观测到的CD4+缺失的可能生物效应细胞状态，并且不能说明导致所观测到的患者免疫缺陷的可能生物效应细胞状态。
的确，也可提到通过对患者细胞尤其是CD4+细胞表达的已知HIV共受体如CCR5共受体的氨基酸序列突变检测，对特定HIV感染患者的AIDS进展进行预测，因为已经观察到，在编码CCDR5共受体的两个拷贝之一上携带有特异性突变的HIV感染人群比拥有该基因两个正常拷贝的人群具有较慢的疾病过程。
然而，一旦考虑到AIDS疾病进展状态，本领域仍需要另外的方法而允许本领域技术人员测定已感染HIV病毒患者的AIDS进展状态，以便能够更精确地预测疾病进展，包括许多熟知的AIDS相关疾病的发生或进展，并且也能够更精确地监视对于HIV感染患者更有益的治疗性治疗。例如，本领域需要能够预示AIDS进展优选地与HIV感染的生物学有生物学关联的新的生物学标记，例如，与所检测患者的免疫状态相关联的新的生物学标记。
的确，这些新的生物学标记可与上述一种或几种已知的标记联合使用。
此外，为了预防HIV病毒感染个体发生AIDS，或更通常地来说，为了治疗HIV病毒感染的患者，本领域仍需要新的在治疗上有用的化合物。特别是确定新的抗HIV多联治疗或HAART(“高度有用的抗逆转录病毒治疗”)，需要包括特异性针对除了HIV蛋白酶和HIV逆转录酶以外的其它靶分子并将作用于疾病不同阶段相关靶的新的药学活性化合物。特别是，本领域需要在HIV已开始活跃复制的HIV感染患者中尤其是CD4+T细胞数量接近减少并且因此易感于免疫缺陷HIV感染患者中以及在其CD4+T细胞已开始缺失的HIV感染患者中具有生物学活性的新的目标药物化合物。
发明概述首先，本发明涉及体外评估个体HIV病毒感染的进展状态的方法，其中所述方法包括步骤(a)用特异性结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物与所述生物样本进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的该结合配体化合物的数量预示着病毒感染的进展状态。
本发明也涉及专为实施上述方法而设计的试剂盒。
本发明也涉及HIV感染患者治疗性活性化合物的体外筛选方法。
特别地，本发明涉及用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物的体外筛选方法，其中所述方法包括步骤(a)在待检测的候选治疗性化合物存在下将由人活化NK细胞组成的第一种细胞群和由表达NKp44L蛋白的人CD4+T细胞组成的第二种细胞群相接触；(b)测量通过活化的NK细胞引起的CD4+T细胞溶解；(c)比较步骤(b)的细胞溶解值和在步骤(a)缺乏候选化合物时的细胞溶解值；(d)选择抑制或阻断NK介导的CD4+T细胞溶解的候选化合物。
本发明还涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的配体化合物与至少一种生理可接受赋形剂的组合，其中所述配体化合物选自(i)特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异性结合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物。
本发明也涉及到预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含与编码SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特异性杂交的有效量反义多核苷酸与至少一种生理可接受赋形剂的组合。
本发明也涉及利用治疗性活性化合物和在本说明书中进一步描述的药物组合物治疗HIV感染患者的方法。
另一方面，本发明涉及包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互独立的任一氨基酸残基，X4是指除了A和W以外的任一氨基酸残基，并且其中X8是指除了E和S以外的任一氨基酸残基。
本发明也涉及用于筛选预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物的体外方法，其中所述方法包括步骤(i)将待测试候选化合物与上述多肽进行孵育；(ii)分析待测试候选化合物与上述多肽的结合。
本发明也涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的特异性结合于式(I)多肽的配体化合物与至少一种生理可接受赋形剂的组合。
附图简述

图1.HIV感类个体CD4+T细胞中NKp44L的表达与疾病阶段相关1A)HIV-1感染患者CD4+T细胞上NKp44L的特异性表达。比较未感染(对照，空心符号)组和HIV感染(实心符号)组。水平线标志是指平均值。横坐标检测的血细胞表型。纵坐标检测的NKp44L标记阳性的细胞百分比。
1B)在HIV感染患者中CD4+T细胞NKp44L表达与外周血CD4细胞数呈负相关。使用Sperman非参数等级相关性检验显示相关性(r)和其统计学意义(P)。横坐标患者全血样本中每立方毫米CD4+T细胞的数量。纵坐标检测的NKp44L标记阳性的CD4+细胞的百分比。
1C)CD4+T细胞中NKp44L表达和病毒载量的相关性。Sperman非参数等级相关性检验显示相关性(r)和其统计学意义(P)。横坐标病毒载量值，以每毫升患者全血样本中HIV基因组拷贝数表示。纵坐标检测的NKp44L标记阳性的CD4+细胞百分比。
1D)PHA活化后HIV感染个体CD4+T细胞中NKp44L过量表达。5个未感染(对照，空心符号)和5个HIV感染(实心符号)患者比较。NA非活化细胞；PHAPHA活化细胞。横坐标分别在对照和HIV感染个体中非活化细胞和PHA活化的细胞。纵坐标检测的NKp44L标记阳性的CD4+细胞百分比。
图2.HIV感染患者CD3-CD56+NK细胞的NKp44表达在每立方毫米少于500个CD4+细胞的HIV感染个体中表达NKp44的NK细胞比例显著地高于未感染细胞(对照)。
图3.HIV感染患者表达NKP44L的CD4+T细胞具有较高的NK溶解敏感性3A)使用NK92 NK细胞系分析针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的两种纯化的CD4+T细胞的细胞毒活性。用抗NKp44L单克隆抗体(a44)处理后细胞毒活性受到部分阻断。
3B)针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的纯化CD4+T细胞的两种IL-2激活的自体(auto)NK原代细胞和作为细胞毒活性阳性对照的K562(星形)的细胞毒活性。
3C)针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的两种纯化的CD4+T细胞的未激活自体(auto)NK原代细胞和作为细胞毒活性阳性对照的K562(星形)的细胞毒活性。
在图3A、3B和3C中，左边组和右边组代表两次独立的分析并且显示结果的可重复性。
图4.用表达多种HIV蛋白的痘苗病毒处理纯化的CD4+T细胞后NKp44L的过量表达用表达HIV蛋白的几种重组痘苗病毒以20pfu/细胞感染纯化的CD4+T细胞。两天后，将细胞洗涤两次并用抗NKp44L的单克隆抗体(灰色粗线)或用IgM同种型对照(黑细线)染色。通过流式细胞术分析细胞。UI未感染的细胞。WT用野生型痘苗病毒感染的细胞。Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat、Nef用分别表达Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat或Nef的痘苗病毒感染的细胞。每一小图中对NKp44L表达的百分比加以注释。横坐标NKp44L表达，纵坐标细胞数。
图5.用重组gp160 HIV蛋白处理纯化的CD4+T细胞后NKp44L的过量表达在10μ/ml IL2存在条件下，在2天时间内用5μg/ml对照蛋白质(Ctl黑圆形)或重组gp160蛋白质(gp160-A黑三角；gp160-B黑方形)或不用蛋白质(UT未经处理的细胞)孵育一百万个细胞。
5A)洗涤细胞并以抗NKp44L的单克隆抗体和CD4单克隆抗体或同种型对照染色并通过流式细胞术进行分析。每一小图中对CD4+T细胞内NKp44L表达的百分比加以注释。横坐标CD4表达，纵坐标NKp44L表达。
5B)分析用重组gp160HIV蛋白孵育的CD4+T细胞的NK溶解敏感性以了解已激活的自体纯化NK细胞的细胞毒活性。在不同效应细胞/靶细胞(E/T)比率(横坐标)下进行NK溶解活性分析。空心菱形加虚线未处理的细胞；下方的实心蛋白质处理的对照细胞；实心三角形gp160-A处理的细胞；实心方形gp160-B处理的细胞。纵坐标特异性的NK溶解(％)。
图6.诱导NK溶解高敏感性和NKP44L过量表达的来自HIVgp41蛋白质的肽库用5μg/ml源于HIVgp41蛋白质(记为从A到J)或作为对照的来源于qp120蛋白质(qp120)肽库处理一百万个纯化的CD4+T细胞。如材料和方法部分所描述，每个肽库包含10种肽。在10U/ml IL2存在条件下将细胞孵育两天，然后洗涤两次。
6A)分析用不同肽库孵育的CD4+T细胞的NK溶解敏感性以了解激活的自体纯化NK细胞的细胞毒活性。在不同效应细胞/靶细胞(E/T)比率下进行NK溶解活性分析。纵坐标特异性NK溶解(％)。
6B)用抗NKp44L单克隆抗体和CD4单克隆抗体或同种型对照进行细胞染色并进行流式细胞术分析。在这组图中，结果仅为未处理的细胞(无)或以源于gp120或p41肽库(库C和J)处理的细胞。对每组CD4+T细胞NKp44L表达的百分比进行了注释。观察到对于其它库NKp44L低表达，从0.2％到1.3％。横坐标NKp44L表达，纵坐标CD4表达。
图7.分析源自HIVgp41蛋白质的C库的每种肽用5μg/ml C库的肽(见图6)(记为C141-C150)或作为对照的肽gp41-E162或gp120-87处理一百万纯化的CD4+T细胞。在10U/ml IL2存在条件下将细胞孵育两天，然后洗涤两次。
7A)对用不同肽孵育的CD4+T细胞的杀伤模式进行检测以了解对NK的敏感性。数据显示使用激活的自身纯化NK效应细胞的E/T比率为40/1。纵坐标特异性NK溶解(％)。
7B)用抗-NKp44L单克隆抗体和CD4单克隆抗体或同种型对照进行细胞染色并进行流式细胞术分析。纵坐标NKp44L表达。
图8.gp41 HIV蛋白所表达的NH2-SWSNKS-COOH基序的强烈作用8A)肽gp41-C147(野生型WT)序列和两种不同的恰在“SWSNKS”基序(对照1Ctl1)内或在全部15mer序列(对照2Ctl2)内具有某些修饰的对照肽序列。
用1μg/ml高度纯化的WT肽或两种对照肽(Ctl1和Ctl2)处理一百万纯化的CD4+T细胞。在10μ/ml IL2存在条件下将细胞孵育两天，然后洗涤两次。
8B)分析用不同肽孵育的CD4+T细胞的NK溶解敏感以了解激活的自身纯化NK细胞的细胞毒活性。在不同效应细胞/靶细胞(E/T)比率(横坐标)下进行NK溶解活性分析。空心菱形加虚线未处理的细胞；下方的实心WT肽处理的细胞；实心方形Ctl1肽处理的细胞；实心三角形Ctl2肽处理的细胞。纵坐标特异性NK溶解(％)。
8C)用抗NKp44L单克隆抗体和CD4单克隆抗体或同种型对照进行细胞染色并进行流式细胞术分析。对每组CD4+T细胞NKp44L表达的百分比加以注释。横坐标NKp44L表达，纵坐标CD4表达。
图9.加入“活性SWSNKS”肽后NK溶解活性和NKp44L表达的动力学研究在0-2880分钟内，用1μg/ml高度纯化的野生型(WT)肽或两种对照肽(Ctl1和Ctl2)处理一百万个纯化的CD4+T细胞数次。孵育后，将细胞洗涤两次然后分析激活的自身纯化NK细胞的细胞毒活性。在不同效应细胞/靶细胞(E/T)比率下进行NK溶解活性分析(A)。用10μg/ml抗NK44L单克隆抗体预处理细胞后进行NK细胞毒活性分析(B)。流式细胞术分析显示NKp44L的细胞表面表达(A)和细胞内表达(B)。空心菱形加虚线未处理的细胞；下方实心WT肽处理的细胞；实心方形Ctl1肽处理的细胞；实心三角形Ctl2肽处理的细胞；下方空心加虚线用抗NKp44L单克隆抗体预处理后WT肽处理的细胞；空心方形加虚线用抗NKp44L单克隆抗体预处理后Ctl1肽处理的细胞。
图10.不同人类细胞NKp44L的细胞表面表达K562、Jurkat和静息PBMC的NKp44L细胞表面表达。用1μg/ml抗NKp44L单克隆抗体(灰色粗线)或IgM同种型对照(黑色细线)孵育细胞，并进行流式细胞术分析。横坐标NKp44L表达，纵坐标细胞数目。
发明详述根据本发明已经发现HIV感染个体的CD4+T细胞表达称为NKp44L的特异性蛋白质，而非HIV感染个体的CD4+T细胞不表达该蛋白质。在(i)不表达CD3抗原的HIV感染患者的外周血单核细胞(PBMC)中、(ii)表达CD3抗原但不表达CD4抗原的HIV感染患者的PBMC中，或者(iii)表达CD8抗原的HIV感染患者的PBMC中都不表达NKp44L蛋白。特别是，在来自HIV感染个体的经活化CD4+T细胞如经PHA活化的CD4+T细胞中NKp44L蛋白的表达水平进一步增高。
此外，根据本发明已经显示NKp44L蛋白表达水平的增加与HIV感染患者CD4+T细胞数减少和因此而发生的AIDS进展有关。因而，NKp44L蛋白的表达水平预示着HIV感染患者的免疫状态。
另外，根据本发明已经发现NKp44L蛋白表达的增加与所检测患者的HIV病毒载量的增加有关。因此，NKp44L蛋白表达水平也预示着感染患者的HIV病毒的复制活性状态。
另一方面，根据本发明还已经发现HIV感染患者的CD4+T细胞尤其是表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞是由受自然杀伤(NK)细胞特别是激活的NK细胞和特别是源于同一患者的自身NK细胞作用而导致细胞溶解的特异性靶细胞组成。
重要的是，本发明人已经显示HIV感染个体的NK细胞是通过非MHC依赖的触发机制由表达NKp44L蛋白的自身CD4+T细胞特异性激活的。
因而，根据本发明已经明确HIV感染患者CD4+T细胞NKp44L表达与AIDS疾病进展，尤其是与多种AIDS相关疾病发生相关的免疫缺陷的进展具有较高的生物相关性。
换言之，根据本发明已经发现在HIV感染个体CD4+T细胞膜表面的NKp44L蛋白表达水平与感染疾病的进展或发展状态，尤其是CD4+T细胞进行性缺失引起的患者免疫缺陷的进展之间有统计学意义上的相关性。
从本发明人上面简述的PBMC的NKp44L蛋白表达水平，更加特别地是PBMC细胞群中CD4+T细胞的NKp44L蛋白表达水平的实验结果中，显示出它本身是由个体感染HIV病毒的进展状态的准确的生物学标记组成。此外，NKp44L蛋白表达水平由赋予很高生物学意义的HIV感染进展状态的新的生物学标记组成，因为发明者已经显示，通过激活的NK细胞进行的非MHC依赖的CD4+T细胞识别，CD4+T细胞的NKp44L表达触发自身NK细胞并激活这些用于特异性CD4+T细胞溶解的NK细胞。在这个特定的上下关系中，通过NKp44L蛋白特异性地与其特异性表达于NK细胞膜表面的受体对应物，即已由Cantoni等人(1999)和Vitale等人(1998)描述的NKp44受体蛋白质结合，HIV感染患者CD4+T细胞NKp44L蛋白的表达激活NK细胞。
此外，NKp44L蛋白质以前已由另一发明实体分离而且已经显示多种肿瘤细胞系表达这种蛋白质，此外，已经表明某些肿瘤细胞表达的NKp44L是一种能特异性结合于上述NKp44受体蛋白质的配体，其中受体蛋白质由包括激活的NK细胞在内的NK细胞表达。该发明实体以前表明由激活的NK细胞所表达的NKp44受体蛋白质至少是由受激活的NK细胞导致部分肿瘤细胞溶解的部分原因(未发表的信息)。
总之，本发明人得到的结果已经使得他们可利用NKp44L蛋白作为已诊断为HIV感染个体的疾病进展的新的生物学相关标记实施多种方法。
此外，本发明人惊奇地发现源于HIV的gp41蛋白质的特异性多肽显著增强了CD4+T细胞膜上NKp44L蛋白的表达。
根据本发明也已确定HIV感染患者CD4+T细胞的NK细胞溶解依赖于特异性的HIV多肽。
HIV-1 gp41包含3个结构域，胞外域(外功能域)、跨膜结构域和胞内结构域(内功能域)。gp41外功能域含有3个主要功能区，即定位于gp41的N端的融合肽，随后有2个紧邻gp41外功能域N和C末端部分的4-3七次重复，分别命名为NHR(N末端七次重复)和CHR(C末端七次重复)。N和C末端重复也称为“HR1”和“HR2”。
在HIV和CD4+T细胞之间的膜融合期间，作为必需结构而起作用的NHR和CHR区要求构象的改变。
令人惊讶地是，本发明人发现了一种源于gp41蛋白质的短肽，它定位于已知的HR1和HR2区之间，诱导NKp44L在CD4+T细胞的表面表达。
换言之，本发明人已鉴定了一种源于HIV gp41蛋白质的短肽，它是造成NKp44L表面表达并因此造成由内源性NK细胞引起的CD4+T细胞溶解的原因。
本发明人获得的这些结果使得他们可利用源于gp41的不同于已知HR1和HR2区的特异性肽作为治疗剂新的靶实施筛选方法。
重要地是，本发明人也显示肿瘤细胞表面表达蛋白质NKp44L并且所述的源于gp41的短肽诱导或增强NKp44L的表达。
因此根据本发明，所述源于gp41的短肽可用于肿瘤细胞表面NKp44L的表达然后诱导NK细胞对它们的特异性溶解。
因此，本发明涉及治疗方法和包含以上简述的多肽的用于制造抗癌药物组合物的药物组合物。
在题为“本发明的其它方法和组合物”部分将详细描述上述筛选方法和相关的组合物。
本发明的体外诊断方法本发明的第一个目的在于HIV病毒个体感染进展状态的体外评估方法，其中所述方法包括步骤(a)用特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物与所述生物样本进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此测量的所述结合配体化合物的数量预示着病毒感染的进展状态。
此处所用的“HIV”病毒由HIV-1或HIV2病毒并且特别是HIV-1或HIV-2病毒的任何病毒株或分离株组成。
如此处所使用的感染“进展状态的评估”由预示着所检测HIV感染患者免疫状态的原始实验数据组成，因为如上所述(A)CD4+T细胞的细胞膜表面NKp44L蛋白的表达与(B)(i)所述患者CD4+T细胞的比率或(ii)针对该患者CD4+T细胞的NK细胞溶解活性水平之间有统计学相关性。因此，根据本发明，CD4+T细胞表达NKp44L蛋白越多，该患者HIV疾病进展越快。的确，对于所检测患者疾病进展状态的总体正确的临床诊断或预测来说，仅测量NKp44L蛋白表达水平也许是不够充分的。因此测量NKp44L表达水平可通过或结合疾病的其它诊断或预测标记来完成，例如先前在本说明书中引用的现有技术标记之一。
如此处所使用的SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的“胞外域部分”由包含氨基酸序列SEQ ID NO1中928位氨基酸至1168位氨基酸的多肽组成。
如此处所使用的“配体化合物”由任何分子组成，或者为(i)已从其生物学环境中纯化的天然存在或天然产生的分子，或者为(ii)经部分生物或化学合成(半合成)制造的分子，或者为(iii)经全部生物或化学合成制备的分子。所述配体化合物必须特异性地(选择性地)结合于NKp44L蛋白，这在本发明上下文中是指当用含有人类细胞的生物样本孵育时，该配体化合物唯一地结合于至少一部分这些人类细胞所表达的NKp44L，并且因此反过来不以可检测的方式与这些细胞表达的、不同于NKp44L或不同于CD4+T细胞的膜表面所暴露的NKp44L蛋白部分的蛋白质结合。最优选地是，生物样本选自(i)全血样本、(ii)自全血样本纯化出来的外周单核细胞和多形核白细胞悬浮液、(iii)自全血样本纯化出来的外周血单核细胞(PBMC)悬浮液、(iv)自全血样本纯化出来的T细胞悬浮液、以及(v)自全血样本纯化出来的CD4+T细胞悬浮液。
如此处所用的结合于CD4+T细胞的配体化合物的“数量”主要是指在分析生物样本中能够与所述配体化合物结合的CD4+T细胞的比率或百分比，换言之，是在分析生物样本中表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的比率。在另一个实施方案中，为了测定结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的“数量”，也考虑配体化合物的数量，例如结合于表达NKp44L蛋白的每个细胞的配体化合物分子的数量。直观地说，结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的“数量”可以分析样本中CD4+T细胞的比率，优选的是以百分比表示，其中所述CD4+T细胞膜表面表达的NKp44L蛋白可以通过所述配体化合物与所表达的KNp44L蛋白质的特异性结合而检测到。
因为本发明人已经显示HIV感染患者CD4+T细胞的NKp44L蛋白表达水平与该患者的CD4+T细胞数量有关，所以本发明的另一个目的在于在包含HIV病毒感染患者的血细胞的生物样本中存在的CD4+T细胞比率的体外测定方法，其中该方法包含步骤(a)用特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物与所述生物样本进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的该结合配体化合物的数量预示着该生物样本中包含的CD4+T细胞比率。
如在此处所用的分析生物样本中包含的CD4+T细胞的“比率”由制备分析生物样本的初始体积全血细胞中的CD4+T细胞的数量组成。例如，CD4+T细胞的比率可以表示为用于制备该生物样本的每立方毫米初始全血样本中CD4+T细胞的数量。
根据上述方法，本领域技术人员可容易地确定所检测患者的CD4+T细胞的比率，例如像文中实例所显示的那样，通过参照此前或同时测定所得到的、每个CD4+T细胞比率值对NKp44L表达水平值所绘出的标准对照曲线得到CD4+T细胞比率。在本实施方案中，本领域技术人员根据上述方法首先测定NKp44L表达水平，然后从标准对照曲线中确定相应的CD4+T细胞比率。例如本领域技术人员可以使用图1B中显示的标准曲线。
因为如上所公开成人和青少年AIDS病例的定义目前扩大为包括每立方毫米CD4+T细胞计数少于200个的HIV感染个体，并且HIV感染个体CD4+T细胞比率和所述CD4+T细胞的NKp44L蛋白表达水平有严格的相关性，因而通过测量所述NKp44L表达水平恰当地评价HIV感染个体疾病的进展状态，其中所述的NKp44L表达水平是通过使用上述第一种方法测量上述定义的结合于该个体CD4+T细胞的配体化合物数量而测定的。例如，像配体化合物特异性地结合于表达的NKp44L蛋白所揭示的那样，如果NKp44L蛋白的表达水平值超过表达NKp44L蛋白的分析生物样本的CD4+T细胞20％，所指定患者将包含于AIDS病例中，因为如图1B所示20％的数量值对应每立方毫米少于200个CD4+T细胞。
因为已经显示，HIV感染患者的CD4+T细胞的NKp44L蛋白表达水平与该患者的HIV病毒载量相关，本发明的进一步的目的在于感染HIV病毒患者的血细胞生物样本中HIV病毒载量的体外测定方法，其中该方法包括步骤(a)用特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域的配体化合物与所述生物样本进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的所述结合配体化合物的数量预示着该生物样本的HIV病毒载量。
根据上述方法，本领域技术人员可容易地确定所检测患者的HIV病毒载量，例如，像文中实例所示那样，通过参照此前或同时测定所得到的、每个HIV病毒载量值对NKp44L表达水平值所绘出的标准对照曲线得到HIV病毒载量。在该实施方案中，本领域技术人员根据上述方法首先测定NKp44L表达水平，然后参考标准曲线中确定相应的HIV病毒载量。例如本领域技术人员可以使用图1C中显示的标准曲线。
在上述任何一种方法的优选的实施方案中，生物样本选自(i)全血样本、(ii)自全血样本纯化出来的外周单核细胞和多形核白细胞悬浮液、(iii)自全血样本纯化出来的外周血单核细胞(PBMC)悬浮液、(iv)自全血样本纯化出来的T细胞悬浮液、以及(v)自全血样本纯化出来的CD4+T细胞悬浮液，例如根据文中实例所教导的方法。
在用于上述任何一种方法的配体化合物的第一个优选的实施方案中，所述配体化合物由针对SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗体或针对其胞外结构域的抗体组成。根据该第一个优选的实施方案，如先前所定义该配体化合物由通过部分或全部生物合成而产生的配体化合物组成。
所述抗NKp44L抗体可由以下过程获得的多克隆抗体组成(i)给予动物免疫有效量的纯化NKp44L蛋白，优选的是与免疫佐剂如弗氏完全佐剂结合，(ii)然后收集已免疫动物的全血，和(iii)纯化抗NKp44L的多克隆抗体，例如使用事先固定有纯化NKp44L蛋白的免疫亲和层析基质。这些用于获得纯化多克隆抗体的技术对本领域技术人员是众所周知的。
所述抗NKp44L抗体可由多克隆抗体组成，在该种情况下根据已知的Kohler和Milstein于1975年描述的技术，该抗NKp44L抗体可从由纯化NKp44L蛋白免疫的动物B细胞和骨髓瘤细胞融合之后而得到的杂交瘤中制备。
所述抗NKp44L抗体也可由通过Kozbor等人于1983年描述的三源杂交瘤技术(trioma technique)或人类B细胞杂交瘤技术所产生的抗体组成。
所述抗NKp44L抗体也可由噬菌体展示文库(Ridder等人，1995)获得的抗体片段的单链Fv抗体片段(美国专利US4,946，778；Martineau等人，1998)或人源化抗体(Reinmann等人，1997；Leger等人，1997)组成。
最优选地是，抗NKp44L抗体由以下步骤获得的单克隆抗体组成(i)制备SEQ ID NO1的一批纯化的重组NKp44L蛋白；(ii)用步骤(ii)提供的有效量的纯化NKp44L蛋白免疫小鼠如BALB/c小鼠，例如以一个月的时间段为间隔，连续3次注射该纯化蛋白质；(iii)例如使用Clona Cell-HY杂交瘤克隆试剂盒根据制造商的技术说明书(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，BC，Canada)，通过将步骤(ii)中免疫小鼠的纯化B细胞进行融合制备杂交瘤细胞系；(iv)培养步骤(iii)制备的杂交瘤细胞系并选择能够分泌针对NKp44L的单克隆抗体的克隆；和(v)纯化步骤(iv)中所选择杂交瘤细胞克隆产生的单克隆抗体。
产生抗NKp44L单克隆抗体的最优选的杂交瘤细胞克隆由杂交瘤细胞系NKp44L#7.1组成。像实例中所教导的那样，优选地制备抗NKp44和抗NKp44L单克隆抗体。
为了在上述方法的步骤(i)中制备SEQ ID NO1的一批纯化的重组NKp44L蛋白，本领域技术人员可以采用包括以下步骤的方法(i)用已插入编码SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的核酸优选地是SEQ IDNO3的核酸的表达载体，或已插入编码包含其胞外结构域的多肽的核酸的表达载体转染受体宿主细胞，优选地是哺乳动物细胞系如COS-7细胞，并且所述表达载体中该核酸有效地与至少包含在该受体宿主细胞中有功能的启动子的表达信号相连接，从而当置于适当的培养条件下时所得到的转染宿主细胞实际上产生了NKp44L蛋白；(ii)在适当的培养基中培养转染的细胞宿主，以便产生NKp44L蛋白或其胞外部分；(iii)从培养细胞的上清液或培养的转染宿主细胞的细胞裂解物中收集NKp44L蛋白或其胞外部分；(iv)纯化步骤(iii)中收集的NKp44L蛋白或其胞外部分，例如通过先前已固定于免疫亲和层析基质上的抗NKp44L抗体或备选地纯化的NKp44蛋白。
文中实例显示了制备纯化NKp44L的优选方法。
在用于上述任何一种方法的配体化合物的第二个优选的实施方案中，该配体化合物由SEQ ID NO2的纯化NKp44蛋白或包含其胞外结构域部分的多肽组成。这第二个实施方案进一步阐明了其中通过完全生物合成产生配体化合物的实施方案。
如此处所使用，NKp44蛋白的胞外域部分定位于SEQ ID NO2的NKp44蛋白N末端而且由SEQ ID NO2的第22位氨基酸残基始至第169位氨基酸残基为止的氨基酸序列组成。
为了产生纯化形式的NKp44蛋白或其胞外结构域部分，本领域技术人员可有利地参考Cantoni等人(1999)公开的方法。例如，可通过以下步骤制备纯化形式的NKp44重组蛋白质(i)用插入编码SEQ ID NO2的NKp44的核酸优选地是SEQ ID NO4的核酸的表达载体，或插入编码其胞外结构域的多肽的核酸的表达载体转染受体细胞宿主，优选地是哺乳动物细胞系如COS-7细胞，所述表达载体中该核酸有效地与至少包含在所述受体宿主细胞中有功能的启动子的表达信号相连接，从而当置于适当的培养基中时所得到的转染宿主细胞实际上产生了NKp44蛋白；(ii)在适当的培养基中培养所转染的宿主细胞，以致于产生了NKp44蛋白或其胞外结构域；(iii)从细胞培养的上清液或所培养的转染宿主细胞的细胞裂解产物中收集NKp44蛋白或其胞外部分；(iv)纯化步骤(iii)中收集的NKp44蛋白或其胞外部分，例如通过先前已固定于免疫亲和层析基质上的抗NKp44抗体或备选地纯化的NKp44L蛋白。
为了测定结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，在上述任何一种方法中的步骤(b)中，最优选的是用可检测的分子标记该配体化合物，所以测定由检测所述可检测分子产生的物理信号组成，其中所获得的该物理信号值反映结合于由最初从HIV感染患者收集的生物样本中的CD4+T细胞所表达的NKp44L蛋白的配体化合物数量。
根据第一个优选方面，所述可检测的分子由放射性分子组成，例如当通过常规技术用放射性标记配体化合物本身或当配体化合物也结合于放射性标记的可检测分子时。
根据该第一个优选方面，用选自[32p]、[3H]和[35S]的放射性同位素标记所述放射性分子。
根据第二个优选方面，所述可检测的分子由荧光分子组成。
根据该第二个优选方面，所述荧光分子最优选地选自本领域技术人员都已知的绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。作为例证的所述荧光分子由荧光报告子FITC蛋白质组成并且标记可以使用MolecularProbes Inc(美国)投放市场的FITC标记试剂盒。
根据第三个优选方面，所述可检测分子由发光分子组成。
根据该第三个优选的实施方案，所述发光分子最优选地选自萤光素酶。
根据第四个优选方面，所述可检测分子由配体分子选择性识别的受体组成。
根据该第四个优选方面，所述可检测分子由生物素组成，最优选的是在生物素化的配体化合物形式时，此时配体分子由含有抗生物素蛋白或链亲和素(streptavidin)分子组成，该配体分子可为(i)放射性标记的、(ii)发荧光的或(iii)发光的，以便产生能够被检测用于测量CD4+T细胞的NKp44L蛋白表达水平的物理信号。
根据本发明任何一种方法的步骤(b)，可以采用本领域技术人员掌握的任何一种允许测量化合物并且尤其是可检测的化合物结合到细胞膜表面的技术，对能够结合分析样本中CD4+T细胞所表达的NKp44L蛋白的配体化合物的数量进行测量。
最优选地是，采用多种可检测的标记，最优选地是多种荧光标记，包括可检测的特异性结合于NKp44L蛋白的配体化合物，通过对生物样本进行流式细胞术分析，实施上述任何一种方法的步骤(b)。
在优选的实施方案中，分别用至少两个可检测的标记，最优选地是两个荧光标记(i)特异性结合于NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的可检测的配体化合物；(ii)特异性结合于CD4抗原的可检测标记最优选的是针对CD4抗原的抗体标记进行流式细胞术分析。最优选地是，(i)可检测配体化合物是荧光标记的，以便在适当光激发下发射出第一个特定波长的荧光信号和(ii)结合到CD4抗原的可检测标记是荧光标记的，以便在适当光激发下发射出不同于第一个特定波长的第二个特定波长的荧光信号。
当联合使用上述两个可检测的标记时，(i)采用双色流式细胞术分析，经过计数确定分析生物样本中CD4+T细胞的数量，能够发射第二个特定波长的光的细胞数量对应着能够结合CD4抗原的荧光标记的标记物，和(ii)采用双色流式细胞术术，经过计数确定分析生物样本中表达NKp44L蛋白的细胞数量，能够发射第1个特定波长的细胞的数量对应着能够特异结合NKp44L蛋白的荧光标记的配体化合物，从而计算出样本中表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的比率。
在上述双色流式细胞术分析测量方法的第一个特定实施方案中，在(i)对应于荧光标记的能够结合CD4抗原的标记物的第二个特定波长下和(ii)对应于能够结合NKp44L蛋白的荧光标记化合物的第一个特定波长下同时检测发射光来确定表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的比率，从而直接计算出样本中表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的比率。
在本发明的任何一种方法的第二个优选的实施方案中，测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物数量的步骤(b)由通过显微镜包括共焦显微镜测量的结合于该配体化合物的生物样本的细胞计数组成。根据该第二个优选的实施方案，进行测量的试剂优选与上述的用于流式细胞术分析的试剂相同。
本发明的另一个目的在于HIV病毒个体感染进展状态的体外评估试剂盒，其中该试剂盒包含(i)特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物；(ii)特异性结合于CD4抗原的标记物分子。
上述定义的试剂盒也分别用于(i)体外测定存在于包含HIV病毒感染患者血细胞的生物样本的CD4+T细胞比率；和(ii)体外测定从HIV病毒感染患者收集的包含血细胞的生物样本的HIV病毒载量。
在上述本发明的试剂盒中，配体化合物包含先前已在本说明书中描述过的多种优选的实施方案中的配体化合物。
在上述本发明的试剂盒中，特异性结合于CD4抗原的标记物分子包含先前已在本说明书中描述过的多种优选的实施方案中的标记物分子。
最优选地是，如上所述(i)配体化合物和(ii)标记物分子是不同荧光标记的。
最优选地是，标记的配体化合物由特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的标记的单克隆抗体组成。
最优选地是，标记的标记物分子由抗CD4的单克隆抗体组成，如美国典型培养物保藏中心可提供该抗体，保藏号为ATTC-CRL-8002。
正如下文将详述的，根据本发明所获得的实验结果扩展到HIV病毒感染治疗的治疗领域，并且本发明因此也涉及治疗性活性化合物的筛选方法、药物组合物以及治疗HIV感染患者的方法。
筛选方法、药物组合物和本发明的治疗方法根据本发明已经显示，当CD4+T细胞表达的NKp44L蛋白和激活的NK细胞表达的NKp44受体蛋白质之间的结合受到阻碍时，针对表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的非MHC依赖的NK细胞溶解受到阻断。
更加具体而言，在实例中显示，当将针对NKp44L蛋白的单克隆抗体加入到从HIV感染患者收集的全血细胞悬浮液中时，针对表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞的非MHC依赖的NK细胞溶解受到阻断。本发明人获得的这些实验结果意味着，上述单克隆抗体与表达于CD4+T细胞膜表面的NKp44L蛋白的结合阻止了HIV感染患者的CD4+T细胞被NK细胞通过NKp44L受体蛋白质与NKp44L蛋白特异结合而发生的识别，从而有效地阻止了CD4+T细胞被NK细胞的细胞溶解作用，否则会发生该种细胞溶解，由此HIV感染患者的免疫缺陷得以进展。
因此，根据本发明显示任何一种通过阻止NK细胞的NKp44受体蛋白质与CD4+T细胞的NKp44L蛋白特异性结合而起生物学作用的化合物都可用于抑制或阻断HIV病毒感染个体CD4+T细胞被NK细胞进行细胞溶解的治疗剂。更加具体而言，任何(i)通过特异性结合于HIV感染患者NK细胞表达的NKp44受体蛋白质，或(ii)通过特异性结合于HIV感染患者CD4+T细胞表达的NKp44L蛋白阻止NK细胞NKp44受体蛋白质与CD4+T细胞NKp44L蛋白特异性结合的化合物都可用于抑制或阻断HIV感染个体CD4+T细胞被NK细胞进行细胞溶解的治疗剂。
因此，根据本发明，通过检测NKp44受体蛋白质和NKp44L蛋白之间存在结合或不存在结合的任何方法，可有效地筛选任何一种此类有用的治疗剂或化合物。
本发明的筛选方法因此，本发明的另一个目的在于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物体外筛选方法，其中该方法包括步骤(a)将待检测候选化合物与液体溶剂中的筛选系统孵育，其中所述筛选系统包含(i)暴露于溶剂中的第一配偶体(partner)，为多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；(ii)暴露于溶剂中的第二配偶体，为多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；其中(iii)一方面，多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，(iv)另一方面，多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，能够彼此结合；(b)对(iii)多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子与(iv)多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的结合进行定量；(c)对在步骤(b)中定量的结合与缺乏所述候选化合物而实施步骤(a)时所定量的结合进行比较；(d)当所述候选化合物抑制或阻断(iii)多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子与(iv)多个SEQ IDNO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子结合时，选择出呈现阳性的候选化合物作为治疗剂。
在上述筛选系统中，液体溶液(其中所述液体溶液也可称为“溶剂”)优选水溶液，包括盐水溶液，其中该盐水溶液包括用于培养细胞优选哺乳动物细胞最优选地是人类细胞的任何合适的培养基。
在上述筛选方法所用筛选系统中，第一和第二“配偶体”独立地选自(i)多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，或备选地是多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，或(ii)其上结合有多个SEQ IDNO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的基质物质，或备选地其上结合有多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或其胞外结构域部分的多个多肽分子的基质物质，其中该基质物质包含以暴露于溶剂的方式在其膜表面表达多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子或备选地多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的细胞。
根据上述筛选方法筛选的候选化合物可以属于任一种类，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
在筛选方法的一个特定实施方案中，候选化合物由如Parmley和Smith(1988)所描述的包含于噬菌体载体内的DNA插入片段的产物组成。具体而言是使用了随机肽文库。随机DNA插入片段编码8到20个氨基酸长度的肽(Oldenburg等，1992；Valadon等，1996；Lucas，1994；Westerink，1995；Felici等，1991)。根据该特定实施方案，表达特异性结合(i)SEQID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质或其胞外结构域部分的多肽的重组噬菌体上保留有用于上述筛选方法的候选化合物。
在上述筛选方法中使用的候选化合物也可以根据本领域技术人员众所周知的技术，通过任何免疫亲和层析技术筛选出来，其中免疫亲和层析技术采用其上已事先固定有(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外结构域部分的多肽分子，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质或包含其胞外结构域部分的多肽分子的色谱基质。
在上述筛选方法的第一个优选的实施方案中，步骤(a)中使用的筛选系统包括使用如Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995)描述的光学生物传感器。这个技术允许实时检测分子之间的相互作用，而不需要经过标记的分子。这个技术基于表面胞质共振(SPR)现象。简单地说，第一蛋白质配偶体(partner)分子(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外结构域部分的多肽或者(ii)SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质或包含其胞外结构域部分的多肽分子连接到表面(如羧甲基葡聚糖基质)。然后，将第二蛋白质配偶体分子(iii)SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质或包含其胞外结构域部分的多肽分子或者(iv)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外结构域部分在待测试候选化合物存在或缺乏的条件下与所述基质进行孵育，并且检测第一配偶体和第二配偶体之间的结合，包括结合水平，或者不存在结合。为了该目的，将光束照向不含待检测样本的基质的表面积那侧并且光束由该基质表面反射。因角度和波长的特定组合，SPR现象引起反射光强度下降。第一和第二蛋白质配偶体分子结合引起基质表面折射指数的改变，该种改变作为SRP信号变化而检测到。
根据上述筛选方法的第一个优选的实施方案，筛选系统的“第一配偶体”由固定有第一蛋白质配偶体分子的基质组成，筛选系统的“第二配偶体”由第二配偶体蛋白质分子本身组成。
在上述筛选方法的第二个优选的实施方案中，筛选系统的“第一配偶体”由在它们的膜表面表达多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的细胞，有利地是哺乳动物细胞，优选地是人类细胞并且最优选地是NK细胞组成，筛选系统的“第二配偶体”由在它们的膜表面表达多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的细胞，有利地是哺乳动物细胞，优选地是人类细胞并且最优选地是CD4+T细胞组成。
本发明也涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物的体外筛选试剂盒，其中该试剂盒包含筛选系统，该筛选系统包含(i)暴露于溶剂的多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的第一个配偶体；(ii)暴露于溶剂的多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的第二配偶体；
其中(iii)一方面，多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，和(iv)第二方面，多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，能够彼此结合。
在上述筛选试剂盒中，像先前定义的那样，第一和第二配偶体用于上述第一种筛选方法。
本发明还针对预防和治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病化合物的体外筛选方法，其中该方法包括步骤(a)在待检测候选治疗化合物存在的情况下，将由人活化NK细胞组成的第一细胞群和由表达NKp44L蛋白的人CD4+T细胞组成的第二细胞群相接触；(b)测量经活化NK细胞所导致的CD4+T细胞溶解；(c)将步骤(b)中获得的细胞溶解值与步骤(a)中缺乏候选化合物时所得到的细胞溶解值相比较；(d)选择能够抑制或阻断NK介导的CD4+T细胞溶解的候选化合物。
尽管上述的第二种方法由体外方法组成，但就预防活化的NK细胞溶解CD4+T细胞来说，上述第二种筛选方法通过直接证明所述候选化合物的生物学活性而对于直接反映候选化合物治疗的潜力有技术上的优势。
活化的NK细胞可由来源于NK细胞系的细胞组成，如Gong等(1994)描述的NK92细胞系或可由原代培养的正常人类纯化的NK细胞组成。
表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞可由用载体转染的以允许所述细胞表达NKp44L蛋白的最终以细胞系形式的CD4+T细胞组成，或可由最初从HIV感染患者血液样本纯化的CD4+T细胞组成。
在上述第二种筛选方法的特定实施方案中，活化的NK细胞和CD4+T细胞是自体的因为它们都来源于同一HIV感染患者。
优选地是，细胞溶解的测量由常规技术组成，其中作为靶细胞的CD4+T细胞最初赋予了放射性51Cr，其中细胞溶解值是由通过细胞培养基中溶解的CD4+T细胞释放的51Cr数量测量的细胞溶解百分比组成。
最优选地，细胞溶解值可以通过分析增加的效应细胞(NK细胞)与靶细胞(CD4+T细胞)的比率例如效应细胞靶细胞比率从1∶1到50∶1时NK细胞的细胞溶解活性得到。
根据上述第二种筛选方法检测的候选化合物与根据本说明书中先前描述的第一种筛选方法检测的候选化合物相同。
本发明的药物组合物和治疗方法本发明进一步的目的在于预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物，它包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的配体化合物，所述的配体化合物选自(i)特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异性结合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物。
在上述药物组合物的第一个优选的实施方案中，所述配体化合物由针对SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗体或针对其胞外结构域部分的抗体组成。
在上述药物组合物的第二个优选的实施方案中，所述配体化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包括其胞外结构域的多肽组成。
在上述药物组合物的第三个优选的实施方案中，所述配体化合物由针对SEQ ID NO2的NKp44蛋白的抗体或针对其胞外结构域部分的抗体组成。
“生理可接受赋形剂或载体”是指可安全地全身或局部使用的固体或液体填充剂、稀释剂或物质。取决于特定的给药途径，许多种本领域已知的可药用载体包括固体或液体填充剂、稀释剂、助水溶物、表面活性剂和包封物质。与F(ab)2片段结合的载体的量提供了每单位组合物剂量材料的实际量。
可掺入本发明组合物中的用于全身施用的可药用载体包括糖、淀粉、纤维素、植物油、缓冲液、多元醇和藻酸。以下文件描述了特定的可药用载体(此处全部引用作为参考)美国专利号4,401,663，Buckwalter等1983年8月30日出版；欧洲专利申请号089710，LaHann等1983年9月28日发表；和欧洲专利申请号0068592，Buckwalter等1983年1月5日发表。用于肠胃外施用的优选载体包括丙二醇、吡咯烷酮、油酸乙酯、含水乙醇及其组合。
代表性的载体包括金合欢胶、琼脂、藻酸盐、羟烷基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、角叉藻聚糖、粉末状纤维素、瓜尔胶、胆固醇、明胶、树胶琼脂、阿拉伯树胶、梧桐胶、印度树胶、豆角胶、辛苯聚醇-9、油醇、果胶、聚(丙烯酸)和其同系物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、月桂基硫酸钠、多聚(环氧乙烷)、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇单硬脂酸酯、1，2-丙二醇单硬脂酸酯、黄单胞菌胶、西黄蓍胶、脱水山梨糖醇酯、硬脂醇、淀粉和其变体。适宜的变化范围在约0.5％到约1％。
为了配制本发明的药物组合物，本领域技术人员将方便地参考最新版本的欧洲药典或美国药典。
优选地，本领域技术人员可以参考第四版“2002”欧洲药典或还可以参考USP 25-NF20版美国药典。
包含于本发明每一剂量药物组合物中的治疗活性化合物的重量将取决于该治疗活性化合物的分子量以及能够阻断感染患者CD4+T细胞被NK细胞进行细胞溶解的有效重量。
为了测定本发明剂量的药物组合物中治疗活性化合物的合适量，本领域技术人员首先测定多种重量或浓度的所述治疗活性化合物的体外CD4+T细胞溶解抑制能力，例如通过进行与先前在此描述的本发明的第二种筛选方法一样的步骤(a)和(b)，然后保留或选择能够阻断细胞溶解的特定数量或浓度的所述治疗活性化合物。然后，本领域技术人员再将该保留或选择的数量或浓度转换成人类体内情况，以便使施以本发明的药物组合物的患者血液中该治疗活性化合物的浓度与体外阻断细胞溶解的浓度相同。
本发明也针对选自(i)特异性结合于SEO ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异性结合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物在制造用来预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物的用途。
本发明也涉及预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的方法，其中该方法包括给需要此种治疗的患者施以有效剂量选自(i)特异性结合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异性结合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物的步骤。
本发明的另一个目的在于预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的能够与编码SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特异性杂交的有效量反义多核苷酸。
优选地，通过克隆反义方向的SEQ ID NO3的NKp44L片段(起始于SEQ ID NO3的位置1并终止于位置902)获得所述反义多核苷酸。
因此，优选的反义多聚核苷酸由与核苷酸序列SEQ ID NO3中起始于核苷酸1并终止于核苷酸902的核酸互补的核酸组成。
本发明也针对能够与编码SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA特异性杂交的反义多核苷酸在制造用于预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物中的用途。
本发明进一步的目的在于预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的方法，其中该方法包括对需要此种治疗的患者施以有效量的能够与编码SEQ ID NO1的NKp441蛋白质的mRNA分子特异性杂交的反义多核苷酸的步骤。
本发明的其它组合物和筛选方法本发明人惊奇地发现源于HIV gp41蛋白质的特异性多肽显著地增强CD4+T表面Nkp44L蛋白质的表达(下文的实施例6-8)。
根据本发明，也确定了HIV感染患者CD4+T细胞被NK细胞进行细胞溶解与细胞表面NKp44L表达增加的同时CD4+T细胞上所述特异性多肽的结合直接相关。
因此，本发明的另一个目的是包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互独立的任一氨基酸残基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸残基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸残基。
本发明进一步包含含有以下氨基酸序列的多肽PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
如上述定义，多肽优选地源于gp41蛋白质并具有至少39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个连续的HIV-1 gp41蛋白质氨基酸，而且包含上述式(I)的氨基酸序列。
式(I)中的多肽可通过重组DNA技术产生，例如基于HIV gp41蛋白质的DNA序列，或通过使用标准肽合成技术的化学合成产生。
优选地，式(I)的多肽由以下氨基酸序列组成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
下文实施例6-8说明了氨基酸序列(II)的多肽所诱导的CD4+T细胞表面NKp44L表达的诱导作用。
细胞表面NKp44L表达的诱导作用的高度动力学与预先合成的NKp44L细胞内蛋白从细胞质到细胞表面的易位的诱导作用一致。
本发明也涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物的第一种体外筛选方法，其包括步骤(i)用式(I)的多肽与待检测的候选化合物进行孵育；(ii)分析式(I)的多肽与待检测候选化合物的结合。
候选化合物与式(I)多肽的结合可以由本领域技术人员例如通过采用双杂交系统来进行。本领域技术人员已知的其它方法可用于结合分析，如生物传感器技术(Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995))、亲和层析或高通量筛选(HTS)(Leblanc等2002)。
根据上述筛选方法筛选的候选化合物可以是任何种类，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
优选地，步骤(ii)由对步骤(i)最后获得的混合物进行凝胶迁移分析和检测候选化合物和式(I)多肽之间形成的复合体组成。
凝胶迁移分析可以像本领域技术人员已知的那样进行。
通过测定对应于所分析蛋白质的染色位置(蛋白质带)，很容易观察到候选化合物和本发明多肽之间形成的复合体，因为如果所分析的蛋白质为其与另一个蛋白质组成的复合体的一部分时，蛋白质的表观分子量发生了改变。
一方面，通过特异的抗体或特异针对式(I)多肽的抗体可以检测凝胶迁移分析的相应蛋白质的染色(蛋白质带)。另一方面，为了更容易地检测凝胶上的蛋白质/候选化合物，可以对式(I)的多肽进行标记。例如，为了便于识别凝胶上的不同蛋白质，本发明多肽可以与GST、HA、多聚组氨酸链或其它可检测的分子融合。
本发明进一步涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物的第二种体外筛选方法，其包括步骤a)(i)将第一种CD4+T细胞培养物与候选化合物和HIV病毒相接触；(ii)在缺乏所述候选化合物时，将第二种CD4+T细胞培养物与HIV病毒相接触；b)检测源自培养(i)和(ii)的CD4+T细胞表面NKp44L的存在。
像本领域技术人员已知的那样，例如通过对应于实施例6中的材料和方法部分描述的细胞荧光测定分析，可以对CD4+T细胞表面NKp44L的存在进行检测。
优选地，当源自培养物(ii)的CD4+T细胞表面NKp44L表达水平比源自培养物(i)的CD4+T细胞表面NKp44L表达水平高时，上述方法包含由阳性选择作为治疗剂的候选化合物组成的附加步骤(c)。
如相应的材料方法部分所描述的那样，通过采用荧光激活细胞分选仪(FACS)计数细胞表面表达NKp44L的CD4+T细胞的数量，来评估CD4+T细胞表面NKp44L表达水平的比较。
备选地，如对应于实施例7中的材料和方法部分描述的那样，通过测量CD4+T细胞的NK溶解活性，可直接进行CD4+T细胞表面NKp44L存在的检测。
虽然上述筛选方法的步骤(b)的具体实施方案是由体外方法组成的，但就预防CD4+T细胞被活化的NK细胞进行细胞裂解而言，该实施方案可以通过直接提供所述候选化合物具有生物活性的证据而直接反映候选化合物的治疗效果具有技术上的优势。
活化的NK细胞可以由NK细胞系的细胞组成，如Gong等(1994)描述的NK92细胞系或由原代培养的正常人类纯化的NK细胞组成。
表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞可以由用载体转染的以允许所述细胞表达NKp44L蛋白的最终以细胞系形式的CD4+T细胞组成，或由最初从HIV感染患者血液样本中纯化的CD4+T细胞组成。
在上述筛选方法的特定实施方案中，活化的NK细胞和CD4+T细胞是自体的，因为二者都来源于同一个HIV感染的患者。
优选地，细胞溶解的测量由常规技术组成，其中作为靶细胞的CD4+T细胞最初赋予了放射性51Cr，其中细胞溶解的值是由通过细胞培养基中溶解的CD4+T细胞释放的51Cr数量测量的细胞溶解的百分比组成。
最优选地，细胞溶解值可以通过分析增加的效应细胞(NK细胞)与靶细胞(CD4+T细胞)之间比率例如效应细胞靶细胞比率为从1∶1到50∶1时，NK细胞的细胞溶解活性而得到。
在结合一种或几种式(I)多肽的候选化合物中，可以选择刚刚上述的用于筛选方法的候选化合物。
因此，本发明也涉及预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的化合物体外筛选方法，其包括步骤(i)将候选化合物用于上述第一种筛选方法；和(ii)将步骤(i)中选择为阳性的候选化合物用于刚刚上述的第二种筛选方法。
本发明的另一个目的是预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物，它包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的特异性结合式(I)多肽的配体化合物。
优选地，用于上述药物组合物的生理可接受赋形剂与本说明书第一部分描述的关于NKp44L配体的赋形剂相同。
为了按药方配制本发明的药物组合物本领域技术人员将方便地参考最新版欧洲药典和美国药典。
为了测定本发明剂量的药物组合物中治疗活性化合物的合适量本领域技术人员首先测定多种重量或浓度的该治疗活性化合物的体外CD4+T细胞溶解抑制能力，例如通过实施先前在此描述的本发明的筛选方法，然后保留或选择能够阻断细胞溶解的特定数量或浓度的该治疗活性化合物。
然后，本领域技术人员再将该保留或选择的数量或浓度转换成人类体内情况，以便使施以本发明的该药物组合物的患者血液中治疗活性化合物的浓度与体外阻断细胞溶解的浓度相同。
优选地，配体化合物由针对本发明多肽的抗体组成。
优选地，配体化合物或包含其的药物组合物可与能够抑制HIV和CD4+T细胞膜融合的化合物组合。此类化合物如源于gp41蛋白质HR1或HR2区域的肽和更确切地称为T20、T21的肽或美国专利申请6,623,741中描述的那些肽。
本发明也涉及特异性结合于式(I)多肽的配体化合物在制造用于预防或治疗HIV家族病毒个体感染相关疾病的药物组合物中的用途。
另外，本发明人也显示蛋白质NK44L在肿瘤细胞表面表达，如Jurkat细胞和K562细胞。
他们也显示式(I)的多肽诱导肿瘤细胞进行NKp44L细胞表面表达，然后使这些多肽处理的肿瘤细胞易感于NK细胞的特异溶解。
因此，本发明涉及治疗癌症的方法和包含式(I)多肽的药物组合物。
本发明涉及治疗癌症的药物组合物，其包括与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量式(I)多肽的药物组合物。
优选地，用于上述药物组合物的生理可接受赋形剂与说明书的第一部分中关于配体NKp44L的所述赋形剂相同。
与此相似，为了配制本发明的药物组合物，本领域技术人员可以参考关于NKp44L配体的说明书的第一部分。
本发明也涉及治疗癌症的药物组合物，它包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的、与靶癌细胞融合的有效量式(I)的多肽。
优选地，以癌细胞为靶的所述化合物由针对癌特异性抗原的抗体组成，其中所述抗原如美国专利6,338,947描述的乳腺癌特异性的SCP-1、NY-ESO-1或SSX-2，黑素瘤特异性的SSX-2、NY-ESO-1或MAGE-3；或如美国专利6,440,663描述的肾癌特异性的抗原；美国专利6,238,668描述的结肠癌特异性的KH-1和N3。
通过下面的实施例进一步阐明本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。
实施例A.实施例1-5的材料和方法A.1HIV感染的供者在Hpital Pitié-Satpétrière，从同意的供者获得25个HIV感染患者的血液样本。生物-临床检查包括常规测定病毒载量、全血和CD4+T淋巴细胞计数。
通过血库(Hpital Pitié-Salpétrière)的白细胞分离，从20个未感染的供者获得血液样本作为对照组。
A.2细胞荧光测定分析对新鲜收获的PBMC进行三色FACS分析。用同种型匹配的免疫球蛋白作为阴性对照(BD)。用适当的抗体混合物于4℃孵育细胞1小时，即抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD56、抗NKp44、抗NKp46或抗NKp44L单克隆抗体。用FACS细胞溶解液(BD)溶解红细胞。像先前描述的那样，在FACScan上分析最小量20,000个白细胞。
为测定细胞表面活化标记物的表达，用PE或FITC缀合的抗HLA-DR、抗CD69、抗CD25或抗CD71(都来自BD)对PBMC染色并通过FACS进行分析。
A.3表达NKp44L的CD4+T细胞的纯化用RosetteSep CD4+富集试剂盒(StemCell)进行CD4+T细胞亚群分选。通过两步磁性分离，选择出表达NKp44L的阳性CD4+T细胞，用10g/ml抗NKp44L抗体于室温孵育CD4+T细胞1小时，随后按照10∶1的珠与细胞的比率，用山羊抗小鼠IgM包被的Dynabead(Dynal)于室温处理30分钟。通过FACS分析测定细胞级分的纯度。
A.4原代NK细胞的分离和NK细胞毒性分析NK细胞系产生于PBMC，然后用StemSep细胞分离系统和富集NK细胞的抗体混合物(StemCell technologies)进行纯化。用添加100单位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培养基(StemCell technologies)培养纯化的NK细胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44、和抗NKp46单克隆抗体染色后，以流式细胞术分析法评价这些制品的纯度。
如先前所描述，在4小时51Cr释放分析中分析细胞溶解活性。简单地说，用每106个细胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃标记靶细胞2小时，并用培养基洗涤两次。然后将靶细胞分布于在圆底96孔微量培养板(每孔4×103个细胞)，并且以几种E/T比率添加效应细胞。板子于37℃孵育4小时。然后收集悬浮液并以γ计数测量51Cr的释放。在包括抗体的实验中，以终浓度20μg/ml加入。根据常规方法计算相对特异性51Cr释放。计算中所扣除的自发51Cr释放值是总掺入放射活性的10-20％。减去从对照靶得到的非特异性溶解后即为结果。每个点代表三次数值的平均数。三次数值的范围总是在平均值5％内。
A.5统计学分析用Sperman′s非参数等级相关性分析法进行相关性分析。用GraphPadPrism进行所有的计算。
B.实施例6-10的材料和方法B.1 CD4+T细胞的纯化用RosetteSep CD4+富集试剂盒(StemCell)进行CD4+T细胞亚群分选。通过FACS分析测定细胞级分纯度。
B.2细胞荧光测定分析对纯化的CD4+T细胞进行双色FACS分析。同种型匹配的免疫球蛋白可用作阴性对照(BD)。用适当的抗体混合物，抗CD4或抗NKp44L抗体，于4℃孵育细胞1小时。如先前所述，用FACScan分析最小量20,000个CD4+T细胞。如先前所述，了解细胞内NKp44L的表达。简单地说，细胞于4％PFA缓冲液中孵育20分钟，然后洗涤并在4℃下于0.1％皂甙/PBS/1％BSA缓冲液中染色，然后用FACS分析细胞。
B.3原代NK细胞分离和NK细胞毒性分析NK细胞系产生于PBMC，然后用StemSep细胞分离系统和富集NK细胞的抗体混合物(StemCell technologies)纯化。在添加100单位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培养基(StemCell technologies)中培养纯化的NK细胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44和抗NKp46单克隆抗体染色后，通过流式细胞术分析法评价这些制品的纯度。
如先前所描述，在4小时51Cr释放分析中分析细胞溶解活性。简单地说，用每106个细胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃标记靶细胞2小时，并用培养基洗涤两次。然后将靶细胞分布于圆底96孔微量培养板(每孔4×103个细胞)，并且以几种E/T比率添加效应细胞。板子于37℃孵育4小时。然后收集悬浮液并以γ计数测量51Cr的释放。在包括抗体的实验中，以终浓度20μg/ml加入。如先前所述，计算相对特异性51Cr释放。计算中所扣除的自发51Cr释放值是总掺入放射活性的10-20％。减去从对照靶得到的非特异性溶解后即为结果。每个点代表三次数值的平均数。三次数值的范围总是在平均值5％内。
B.4表达HIV-1蛋白的重组痘苗病毒使用野生野痘苗病毒(WT)或多种重组痘苗病毒以20PFU/细胞的感染复数感染纯化的CD4+T细胞，将此种细胞用作靶细胞。由Transgène(Strasbourg，France)提供了HIV-1-LAI Gag、Pol、Env、Nef、Tat和Vif蛋白的重组痘苗病毒。
B.5肽和肽库合成的15mer肽可从Epytop(Nmes，France)购买或由AgenceNationale de la Recherche sur le SIDA友好提供。HPLC谱显示纯度都超过80％。肽库包括大约10种不同的肽并且每一肽与前面连续的肽重叠11个残基。
C.结果实施例1全长和反义NKp44L载体和稳定转染子的产生通过在pEF6载体(invitrogen)中连续亚克隆先前已克隆入PCR-Zero-blunt载体(Lnvitrogen)中的NKp44L的3个重叠RT-PCR片段得到全长载体(pEF6-NKp44L)；三个片段为片段A从1(从ATG翻译位点编号；核苷酸1-3)到902；片段B从813到2066；和片段C从1983到3507(包括TGA终止翻译位点)。根据操作说明书(STP3试剂盒，Novagen)，通过测序和体外转录/翻译分析确认全长序列的完整性。
通过将上述片段A以反义方向克隆进入pEF6载体获得RNA反义NKp44L载体(pEF6-NKp44L-AS5)。通过测序确认序列的方向和完整性。用pEF6-NKp44L-AS5载体通过电穿孔(230V，250μF)稳定转染1000万个721.221细胞并用10μg/ml杀稻瘟素(lnvitrogen)在24孔板选择。通过RT-PCR分析证实pEF6-NKp44L-AS5构建体在721.221细胞内的表达。
实施例2.单克隆抗体的制备使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒，根据操作说明书(StemCellTechnologies Inc.)，分别以NKp44-Ig或NKp44L-(HIS)6标签重组蛋白质免疫BALB/c小鼠3次，以产生抗NKp44受体(44/8，IgG1)和抗NKp44L的单克隆抗体(7.1，7.7和7.13)。通过基于重组蛋白质反应性的ELISA方法使用抗小鼠过氧化物酶杂交瘤筛选试剂(Roche)以及FACS分析对抗体进行选择。COS-7细胞产生NKp44L-(HIS)6标签重组蛋白质。哺乳动物表达载体(pcDNA3/V5-HIS-tag；Invitrogen)编码含有连续6个组氨酸残基的通过酵母双杂交得到的NKp44L 169个C-末端氨基酸的片段。在天然条件下，用镍亲和层析柱纯化重组NKp44L蛋白(Xpress system proteinpurification，Invitrogen)。获得几种抗NKp44L单克隆抗体经FACS分析有效的7.1(IgM)和能够进行免疫沉淀、免疫印迹和免疫染色的7.7(IgM)和7.13(IgM)。在硫酸铵沉淀(50％饱和溶液)后，如先前描所述(Malik和Strominger，1999)在高压灌流层析装置(High Pressure Perfusionchromatography Station)内以Poros G20 AL蛋白质G柱纯化抗NKp44单克隆抗体(44/8)，并且以甘露聚糖结合蛋白质(MBP)柱(Pierce)纯化IgM抗NKp44L单克隆抗体。使用SDS PAGE证实纯化的单克隆抗体的纯度。
实施例3.HIV感染个体CD4+T细胞NKp44L的表达与疾病阶段相关图1A)显示HIV感染患者CD4+T细胞NKp44L的特异性表达。比较未感染组(对照，空心标志)和HIV感染组(实心标志)。水平线标记为平均值。
图1B)显示HIV感染患者CD4+T细胞NKp44L的表达和外周血CD4细胞计数之间呈负相关。显示了用Sperman′s非参数等级相关性检验获得的相关性(r)和其统计学意义(P)。
图1C)显示CD4+T细胞NKp44L表达与病毒载量之间的相关性。显示了用Sperman′s非参数等级相关性检验获得的相关性(r)和其统计学意义(P)。
图1D)显示PHA活化后HIV感染个体CD4+T细胞NKp44L过量表达。比较5个未感染的(对照，空心标志)和5个HIV感染(实心标志)患者。NA未活化的细胞；PHAPHA活化的细胞。
实施例4.HIV感染患者CD3-CD56+NK细胞的NKp44表达表达NKp44的NK细胞的比例在每立方毫米低于500个CD4+细胞的HIV感染个体中明显高于未感染细胞(对照)。
实施例5.HIV感染患者表达NKp44L的CD4+T细胞具有较高的NK细胞溶解敏感性使用NK92 NK细胞系分析了针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的二种纯化CD4+T细胞的细胞毒活性(图3A)。用抗NKp44L单克隆抗体(a44)处理后，细胞毒活性受到部分阻断。
使用2种IL-2活化的自体(auto)NK原代细胞分析了针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的纯化CD4+T细胞和作为细胞毒活性阳性对照的K562(星形)的细胞毒活性(图3B)。
使用未活化的自体(auto)NK原代细胞分析了针对表达(圆形)或不表达(方形)NKp44L的2种纯化CD4+T细胞和作为细胞毒活性阳性对照的K562(星形)的细胞毒活性(图3C)。
实施例6.几种HIV病毒蛋白质对NKp44L表达的影响使用表达HIV病毒蛋白质的重组痘苗病毒进行感染来检查HIV病毒蛋白质对NKp44L表达的影响。如图4所示，感染表达gp160(33.9％)或gp41HIV Env蛋白质(35.6％)的痘苗病毒的CD4+T细胞的NKp44L表达明显增强。相反，其它所检测的HIV蛋白，如Gag、Pol、Tat、nef、vif或gp120，都不影响NKp44L蛋白的细胞表面表达。此外，在非病毒系统中证实了Env蛋白质对于增强NKp44L表达的作用。用两种不同来源的重组gp160蛋白质处理纯化的CD4+T细胞，并且如图5A显示这些gp160重组蛋白质影响NKp44L的表达。的确，当分别用gp160-A和gp160-B处理后，10.7％和9.6％的CD4+T细胞表达了NKp44L。另一方面，在未处理的细胞或用对照蛋白质孵育的细胞都中没有观察到影响。总之，这些结果表明重组gp160蛋白质明显增强在CD4+T细胞表面的NKp44L细胞表面表达。
实施例7.gp160诱导CD4+T细胞的NK细胞溶解对未处理细胞、用对照蛋白质处理的细胞或用两种重组gp160蛋白质处理的NK细胞溶解活性的比较(图5B)，显示出在有重组gp160蛋白质培养的CD4+T细胞存在下，靶细胞溶解增加。使用两种不同类型的重组gp160蛋白质表明用于诱导NKp44L过量表达和NK细胞溶解活性增高的方法对实验的结果没有影响。总之，这些结果表明，对于与NK细胞溶解活性显著增高相关的NKp44L过量表达来说，gp41 HIV EnV蛋白质是必需的。
实施例8.与NK细胞溶解活性增加有关的gp41 HIV Env蛋白质的肽基序的鉴定如材料和方法部分描述的那样，已经检测了所制备的包括所有gp41蛋白质的重叠肽库的影响。用5μg每一肽库孵育CD4+T细胞并针对激活的NK细胞进行检测。如图6A所示，用gp41 C肽库孵育的细胞，其NK细胞溶解增加了，而用所有其它肽库孵育的则无增加。检测了用每种肽库处理的纯化CD4+T细胞的NKp44L表达。该受体仅在gp41C库处理的细胞中可以检测到，并且阳性细胞的百分比是13.3％。在任何情况下，都检测不到用其它的检测肽库孵育的细胞上的NKp44L。这表明包含于库gp41C的一种或几种肽基序与通过NK44L过量表达而引起的NK细胞溶解直接相关。然后，对包含于库gp41C的所有肽进行重复实验检测。如图7A所示，在肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147存在下，NK细胞毒活性显著增高。相反，用其它所检测肽实验时NK细胞溶解活性仍很低，接近于背景值。同样，用肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147预处理CD4+T细胞后，NKp44L表达增高，阳性细胞的百分比在22％-16％之间变化，但用其它肽预处理后没有变化(阳性细胞低于7％)(图7B)。这些结果预示着gp41 Env HIV蛋白的特异性肽能增加NK细胞溶解活性。对该结论额外的支持来自于包括共有肽基序NH2-SWSNKS-COOH的称为gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147的连续肽。该gp41 HIV-1蛋白质特异性基序高度保守。在已经表明一些gp41连续的肽是NK细胞溶解的一些主要介导者后，评价肽基序NH2-SWSNKS-COOH是否与CD4+T细胞的NK细胞溶解直接相关是重要的。使用6mer肽进行的初步实验显示了细胞表面NKp44L表达或NK细胞毒活性略微增加，提示该序列太小或被一些肽酶攻击太快。然而，为了证实这一假设，已经构建了源于gp41-C146(WT)的在NH2-SWSNKS-COOH基序(Ctl1)或所有15mer序列(Ctl2)内有一些突变的两个15mer肽(图8A)。如图8B所示，在WT肽存在下，NK细胞毒活性显著增加。未处理的细胞(无处理)或用两种对照肽处理的细胞则相反。关于细胞表面NKp44L的表达也观察到类似情况，的确，用WT肽处理的细胞内大约17.4％的CD4+T细胞表达此标记物。相反，未处理的或以对照肽处理的细胞中NKp44L+细胞的百分比低于4％。这些结果显示包含于gp41蛋白质的NH2-SWSNKS-COOH基序与CD4+T细胞的NK细胞溶解非常相关。
gp41蛋白质的作用是时间依赖性的(图9)。用WT肽孵育30分钟后，启动NK细胞溶解活性，并在近4天时接近最大值。另一方面，用未处理的细胞或对照肽处理的细胞处理后，未观察到明显的影响。此外，在WT肽处理的细胞中，用抗NKp44L单克隆抗体预处理细胞后，NK细胞溶解活性增加受到强烈抑制，证实NK活性与细胞表面NKp44L表达的增加直接相关(图9C)。然而，对细胞表面NKp44L表达的动力学研究显示确实在WT肽处理10分钟后该受体在细胞表面迅速表达，约10％CD4+T细胞表达该蛋白质，并且于处理后4天达到表达的最大量(大约30％)。非常快速的NKp44L细胞表面表达提示缺乏新的NKp44L合成，并且提示该蛋白质存在于IL2培养的CD4+T细胞内。通过NKp44L的细胞内染色证实了该假设。如图9D所示，在细胞内可检测到NKp44L的高表达并且与肽的存在无关。
实施例9.不同人类细胞NKp44L的细胞表面表达如图10所示，检测K562、Jurkat和静息PBMC的NKp44L细胞表面表达。用1μg/ml抗NKp44L单克隆抗体(灰色粗线)或IgM同种型对照(黑色细线)孵育细胞，并用流式细胞术进行分析。结果清楚地显示，与PBMC相反，肿瘤细胞如jurkat和K562细胞在其表面表达NKp44L。
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<141>
<160>4<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1168<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Ile Val Ile Pro Leu Gly Val Asp Thr Ala Glu Thr Ser Tyr1 5 10 15Leu Glu Met Ala Ala Gly Ser Glu Pro Glu Ser Val Glu Ala Ser Pro20 25 30Val Val Val Glu Lys Ser Asn Ser Tyr Pro His Gln Leu Tyr Thr Ser35 40 45Ser Ser His His Ser His Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Tyr Ala Asp His50 55 60Asn Tyr Gly Ala Arg Pro Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Pro65 70 75 80Ser Val Leu Ile Ser Lys Asn Glu Val Gly Ile Phe Thr Thr Pro Asn85 90 95Phe Asp Glu Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ile Ser Thr Ser Glu Asp Gly100 105 110Ser Tyr Gly Thr Asp Val Thr Arg Cys Ile Cys Gly Phe Thr His Asp
115 120 125Asp Gly Tyr Met Ile Cys Cys Asp Lys Cys Ser Val Trp Gln His Ile130 135 140Asp Cys Met Gly Ile Asp Arg Gln His Ile Pro Asp Thr Tyr Leu Cys145 150 155 160Glu Arg Cys Gln Pro Arg Asn Leu Asp Lys Glu Arg Ala Val Leu Leu165 170 175Gln Arg Arg Lys Arg Glu Asn Met Ser Asp Gly Asp Thr Ser Ala Thr180 185 190Glu Ser Gly Asp Glu Val Pro Val Glu Leu Tyr Thr Ala Phe Gln His195 200 205Thr Pro Thr Ser Ile Thr Leu Thr Ala Ser Arg Val Ser Lys Val Asn210 215 220Asp Lys Arg Arg Lys Lys Ser Gly Glu Lys Glu Gln His Ile Ser Lys225 230 235 240Cys Lys Lys Ala Phe Arg Glu Gly Ser Arg Lys Ser Ser Arg Val Lys245 250 255Gly Ser Ala Pro Glu Ile Asp Pro Ser Ser Asp Gly Ser Asn Phe Gly260 265 270Trp Glu Thr Lys Ile Lys Ala Trp Met Asp Arg Tyr Glu Glu Ala Asn275 280 285Asn Asn Gln Tyr Ser Glu Gly Val Gln Arg Glu Ala Gln Arg Ile Ala290 295 300Leu Arg Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Lys Glu Met Asn Lys Ser Asp305 310 315 320Leu Asn Thr Asn Asn Leu Leu Phe Lys Pro Pro Val Glu Ser His Ile325 330 335Gln Lys Asn Lys Lys Ile Leu Lys Ser Ala Lys Asp Leu Pro Pro Asp340 345 350
Ala Leu Ile Ile Glu Tyr Arg Gly Lys Phe Met Leu Arg Glu Gln Phe355 360 365Glu Ala Asn Gly Tyr Phe Phe Lys Arg Pro Tyr Pro Phe Val Leu Phe370 375 380Tyr Ser Lys Phe His Gly Leu Glu Met Cys Val Asp Ala Arg Thr Phe385 390 395 400Gly Asn Glu Ala Arg Phe Ile Arg Arg Ser Cys Thr Pro Asn Ala Glu405 410 415Val Arg His Glu Ile Gln Asp Gly Thr Ile His Leu Tyr Ile Tyr Ser420 425 430Ile His Ser Ile Pro Lys Gly Thr Glu Ile Thr Ile Ala Phe Asp Phe435 440 445Asp Tyr Gly Asn Cys Lys Tyr Lys Val Asp Cys Ala Cys Leu Lys Glu450 455 460Asn Pro Glu Cys Pro Val Leu Lys Arg Ser Ser Glu Ser Met Glu Asn465 470 475 480Ile Asn Ser Gly Tyr Glu Thr Arg Arg Lys Lys Gly Lys Lys Asp Glu485 490 495Asp Ile Ser Lys Glu Lys Asp Thr Gln Asn Gln Asn Ile Thr Leu Asp500 505 510Cys Glu Gly Ala Thr Asn Lys Met Lys Ser Pro Glu Thr Lys Gln Arg515 520 525Lys Leu Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ser Asn Asn Gln Glu Pro Asp530 535 540Phe Ile Asp Asp Ile Glu Glu Lys Thr Pro Ile Ser Asn Glu Val Glu545 550 555 560Met Glu Ser Glu Glu Gln Ile Ala Glu Arg Lys Arg Lys Met Thr Arg565 570 575Glu Glu Arg Lys Met Glu Ala Ile Leu Gln Ala Phe Ala Arg Leu Glu580 585 590
Lys Arg Glu Lys Arg Arg Glu Gln Ala Leu Glu Arg Ile Ser Thr Ala595 600 605Lys Thr Glu Val Lys Thr Glu Cys Lys Asp Thr Gln Ile Val Ser Asp610 615 620Ala Glu Val Ile Gln Glu Gln Ala Lys Glu Glu Asn Ala Ser Lys Pro625 630 635 640Thr Pro Ala Lys Val Asn Arg Thr Lys Gln Arg Lys Ser Phe Ser Arg645 650 655Ser Arg Thr His Ile Gly GLn Gln Arg Arg Arg His Arg Thr Val Ser660 665 670Met Cys Ser Asp Ile Gln Pro Ser Ser Pro Asp Ile Glu Val Thr Ser675 680 685Gln Gln Asn Asp Ile Glu Asn Thr Val Leu Thr Ile Glu Pro Glu Thr690 695 700Glu Thr Ala Leu Ala Glu Ile Ile Thr Glu Thr Glu Val Pro Ala Leu705 710 715 720Asn Lys Cys Pro Thr Lys Tyr Pro Lys Thr Lys Lys His Leu Val Asn725 730 735Glu Trp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Lys Thr Gly Lys Pro Ser Asp Gly740 745 750Leu Ser Glu Arg Pro Leu Arg Ile Thr Thr Asp Pro Glu Val Leu Ala755 760 765Thr Gln Leu Asn Ser Leu Pro Gly Leu Thr Tyr Ser Pro His Val Tyr770 775 780Ser Thr Pro Lys His Tyr Ile Arg Phe Thr Ser Pro Phe Leu Ser Glu785 790 795 800Lys Arg Arg Arg Lys Glu Pro Thr Glu Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys805 810 815Lys Arg Trp Leu Lys Gln Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ser Ala Ile Leu
820 825 830His Arg Phe Asn Ser Pro Cys Gln Glu Arg Ser Arg Ser Pro Ala Val835 840 845Asn Gly Glu Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Asn Asp Ser Cys Ser Leu850 855 860Pro Asp Leu Thr Thr Pro Leu Lys Lys Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Leu865 870 875 880Asp Ser Val Tyr Ser Glu Thr Ser Thr Pro Thr Pro Ser Pro Tyr Ala885 890 895Thr Pro Thr His Thr Asp Ile Thr Pro Met Asp Pro Ser Phe Ala Thr900 905 910Pro Pro Arg Ile Lys Ser Asp Asp Glu Thr Cys Arg Asn Gly Tyr Lys915 920 925Pro Ile Tyr Ser Pro Val Thr Pro Val Thr Pro Gly Thr Pro Gly Asn930 935 940Thr Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ser Pro Glu Ser Ser Pro Glu Ile945 950 955 960Lys Arg Arg Thr Tyr Ser Gln Glu Gly Tyr Asp Arg Ser Ser Thr Met965 970 975Leu Thr Leu Gly Pro Phe Arg Asn Ser Asn Leu Thr Glu Leu Gly Leu980 985 990Gln Glu Ile Lys Thr Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Arg Ser Arg Thr Glu99510001005Val Asn Arg Gln Cys Pro Gly Glu Lys Glu Pro Val Ser Asp Leu Gln101010151020Leu Gly Leu Asp Ala Val Glu Pro Thr Ala Leu His Lys Thr Leu Glu1025 103010351040Thr Pro Ala His Asp Arg Ala Glu Pro Asn Ser Gln Leu Asp Ser Thr104510501055
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Leu Val Thr Ser Ser Lys Pro Arg Thr Met Ala Trp Thr Ser Arg Phe65 70 75 80Thr Ile Trp Asp Asp Pro Asp Ala Gly Phe Phe Thr Val Thr Met Thr85 90 95Asp Leu Arg Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Trp Cys Arg Ile Tyr Arg100 105 110Pro Ser Asp Asn Ser Val Ser Lys Ser Val Arg Phe Tyr Leu Val Val115 120 125Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Pro Trp Thr Pro Arg Asp Leu130 135 140Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly145 150 155 160Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser Gln165 170 175Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro Ala Ala Pro Ile Ala Leu180 185 190Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu Ser195 200 205Ala Leu Leu Val Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr Val Met Glu210 215 220Leu Arg Ser Leu Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu Gln Gln Val225 230 235 240Thr Asp Leu Pro Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu Arg Glu Ile245 250 255Leu Tyr Hi s Thr Val Ala260<210>3<211>3507<212>DNA
<213>人<400>3atgagcatag tgatcccatt gggggttgat acagcagaga cgtcatactt ggaaatggct 60gcaggttcag aaccagaatc cgtagaagct agccctgtgg tagttgagaa atccaacagt 120tatccccacc agttatatac cagcagctca catcattcac acagttacat tggtttgccc 180tatgcggacc ataattatgg tgctcgtcct cctccgacac ctccggcttc ccctcctcca 240tcagtcctta ttagcaaaaa tgaagtaggc atatttacca ctcctaattt tgatgaaact 300tccagtgcta ctacaatcag cacatctgag gatggaagtt atggtactga tgtaaccagg 360tgcatatgtg gttttacaca tgatgatgga tacatgatct gttgtgacaa atgcagcgtt 420tggcaacata ttgactgcat ggggattgat aggcagcata ttcctgatac atatctatgt 480gaacgttgtc agcctaggaa tttggataaa gagagggcag tgctactaca acgccggaaa 540agggaaaata tgtcagatgg tgataccagt gcaactgaga gtggtgatga ggttcctgtg 600gaattatata ctgcatttca gcatactcca acatcaatta ctttaactgc ttcaagagtt 660tccaaagtta atgataaaag aaggaaaaaa agcggggaga aagaacaaca catttcaaaa 720tgtaaaaagg catttcgtga aggatctagg aagtcatcaa gagttaaggg ttcagctcca 780gagattgatc cttcatctga tggttcaaat tttggatggg agacaaagat caaagcatgg 840atggatcgat atgaagaagc aaataacaac cagtatagtg agggtgttca gagggaggca 900caaagaatag ctctgagatt aggcaatgga aatgacaaaa aagagatgaa taaatccgat 960ttgaatacca acaatttgct cttcaaacct cctgtagaga gccatataca aaagaataag 1020aaaattctta aatctgcaaa agatttgcct cctgatgcac ttatcattga atacagaggg 1080aagtttatgc tgagagaaca gtttgaagca aatgggtatt tctttaaaag accataccct 1140tttgtgttat tctactctaa atttcatggg ctagaaatgt gtgttgatgc aaggactttt 1200gggaatgagg ctcgattcat caggcggtct tgtacaccca atgcagaggt gaggcatgaa 1260attcaagatg gaaccataca tctttatatt tattctatac acagtattcc aaagggaact 1320gaaattacta ttgcctttga ttttgactat ggaaattgta agtacaaggt ggactgtgca 1380tgcctcaaag aaaacccaga gtgccctgtt ctaaaacgta gttctgaatc catggaaaat 1440atcaatagtg gttatgagac cagacggaaa aaaggaaaaa aagacgaaga tatttcaaaa 1500gaaaaagata cacaaaatca gaatattact ttggattgtg aaggagcgac caacaaaatg 1560aagagcccag aaactaaaca aagaaagctt tctccactga gactatcagt atcaaataat 1620caggaaccag attttattga tgatatagaa gaaaaaactc ctattagtaa tgaagtagaa 1680atggaatcag aggagcagat tgcagaaagg aaaaggaaga tgacaagaga agaaagaaaa 1740atggaagcaa ttttgcaagc ttttgccaga cttgaaaaaa gagagaaaag aagagaacaa 1800gctttggaaa ggatcagcac agccaaaact gaagttaaaa ctgaatgtaa agatacacag 1860attgtcagtg atgctgaagt tattcaggaa caagcaaaag aagaaaatgc tagcaagcca 1920acccctgcca aagtaaatag aactaaacag agaaaaagtt tttctcggag taggactcac 1980attggacagc agcgtcggag acacagaact gtcagcatgt gttcagatat ccagccatct 2040tctcctgata tagaagttac ttcacaacaa aatgatattg aaaatactgt acttacaata 2100gaaccagaaa ctgaaactgc actagcagaa ataattactg aaactgaagt tccagcactt 2160aataaatgtc ctaccaagta ccccaaaaca aagaagcact tggttaatga atggttaagt 2220gagaagaatg agaagacagg aaaaccttca gatggccttt cagaaaggcc tctacgcata 2280actacagatc ctgaagtgtt agctacacaa ctcaattctt taccaggtct cacttacagc 2340ccccatgtat actccactcc taagcattat attagattta cttcaccatt cctttcagaa 2400aaaaggagaa gaaaagaacc tactgaaaac atttctggtt catgcaagaa gcgatggttg 2460
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1.用于体外评估个体HIV病毒感染的进展状态的方法，其中所述方法包括步骤(a)将所述生物样本与特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物进行孵育；和(b)测量结合至CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的所述结合的配体化合物数量预示病毒感染的进展状态。
2.体外测定收集自HIV病毒感染患者的含有血细胞的生物样本中CD4+T细胞比率的方法，其中所述方法包括步骤(a)将所述生物样本与特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的所述结合的配体化合物数量预示所述生物样本中含有的CD4+T细胞比率。
3.用于体外测定收集自HIV病毒感染患者的含有血细胞的生物样本中HIV病毒载量的方法，其中该方法包括步骤(a)将所述生物样本与特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物进行孵育；和(b)测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物的数量，由此所测量的所述结合的配体化合物数量预示所述生物样本的HIV病毒载量。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述生物样本选自(i)全血样本、(ii)自全血样本纯化的外周单核细胞和多形核细胞的悬浮液、(iii)自全血样本纯化的外周血单核细胞(PBMC)悬浮液、(iv)自全血样本纯化的T细胞悬浮液、以及(v)自全血样本纯化的CD4+T细胞悬浮液。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述配体化合物由针对SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗体或针对其胞外结构域部分的抗体组成。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述配体化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包含其胞外结构域部分的多肽组成。
7.权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述配体化合物用可检测的分子标记。
8.权利要求7所述的方法，其中所述可检测的分子选自(i)放射性分子、(ii)荧光分子、(iii)发光分子、以及(iv)配体分子选择性识别的受体分子。
9.权利要求8所述的方法，其中所述放射性分子是用选自[32P]、[3H]和[35S]的放射性同位素标记的。
10.权利要求8所述的方法，其中所述荧光分子选自绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
11.权利要求8所述的方法，其中所述发光分子由萤光素酶组成。
12.权利要求8所述的方法，其中所述受体分子由含有抗生物素蛋白或链亲和素的分子组成。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物数量的步骤(b)由细胞荧光光度分析该方法步骤(a)中已与所述配体化合物孵育的所述生物样本组成。
14.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中测量结合于CD4+T细胞的所述配体化合物数量的步骤(b)由通过显微镜包括共焦显微镜计数所述生物样本中含有的其上结合有所述配体化合物的细胞组成。
15.体外评估个体HIV病毒感染的进展状态的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物；(ii)特异结合CD4抗原的标记物分子，上述试剂盒也可以分别用于(i)体外测定收集自HIV病毒感染患者的含有血细胞的生物样本中的CD4+T细胞比率；和(ii)体外测定收集自HIV病毒感染患者的含有血细胞的生物样本中的HIV病毒载量。
16.权利要求15所述的试剂盒，其中(i)配体化合物和(ii)标记物分子用不同的荧光标记。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中配体化合物由特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的经标记单克隆抗体组成。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的试剂盒，其中经标记的标记物分子由抗CD4单克隆抗体组成。
19.体外筛选化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该方法包括步骤(a)将待检测候选化合物与液体溶剂中的筛选系统孵育，其中所述筛选系统包含(i)暴露于溶剂中的第一配偶体，为多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；(ii)暴露于溶剂中的第二配偶体，为多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；其中(iii)一方面，多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，和(iv)另一方面，多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，能够彼此结合；(b)对(iii)多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子与(iv)多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子的结合进行定量；(c)对在步骤(b)中定量的结合与缺乏所述候选化合物而实施步骤(a)时所定量的结合进行比较；(d)当所述候选化合物抑制或阻断(iii)多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子与(iv)多个SEQ IDNO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子结合时，选择出呈现阳性的候选化合物作为治疗剂。
20.体外筛选化合物的试剂盒，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该试剂盒所包含的筛选系统含有(i)暴露于溶剂中的第一配偶体，为多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；(ii)暴露于溶剂中的第二配偶体，为多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子；其中(iii)一方面，多个SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，和(iv)另一方面，多个SEQ ID NO2的NKp44受体蛋白质分子或包含其胞外结构域部分的多个多肽分子，能够彼此结合。
21.体外筛选化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该方法包括步骤(a)在待检测的候选治疗化合物存在的情况下，将由人活化NK细胞组成的第一细胞群和由表达NKp44L蛋白的人CD4+T细胞组成的第二细胞群相接触；(b)测量活化的NK细胞所导致的CD4+T细胞溶解；(c)将步骤(b)中获得的细胞溶解值与当步骤(a)中缺乏候选化合物时所得到的细胞溶解值相比较；(d)选择抑制或阻断NK介导的CD4+T细胞溶解的候选化合物。
22.权利要求21所述的方法，其中活化的NK细胞可由来自NK细胞系的细胞组成，或由正常人类的经纯化NK细胞的原代培养物组成。
23.权利要求21所述的方法，其中表达NKp44L蛋白的CD4+T细胞由用载体转染以允许所述细胞表达NKp44L蛋白的最终处于细胞系形式的CD4+T细胞组成，或由最初从HIV感染患者的血液样本纯化的CD4+T细胞组成。
24.权利要求21所述的方法，其中活化的NK细胞和CD4+T细胞是自体的并且均来源于同一HIV感染患者。
25.预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的选自(i)特异结合SEQ IDNO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异结合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中所述配体化合物由针对SEQID NO1的NKp44L蛋白的抗体或针对其胞外结构域部分的抗体组成。
27.权利要求25所述的药物组合物，其中所述配体化合物由SEQ IDNO2的NKp44蛋白或包含其胞外结构域的多肽组成。
28.权利要求25所述的药物组合物，其中所述配体化合物由针对SEQID NO2的NKp44蛋白的抗体或针对其胞外结构域的抗体组成。
29.选自(i)特异结合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物和(ii)特异结合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外结构域部分的配体化合物的用途，用于制备预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物。
30.用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的能够与编码SEQ IDNO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特异性杂交的反义多核苷酸。
31.权利要求30所述的药物组合物，其中所述反义多核苷酸由与核苷酸序列SEQ ID NO3的起始于第1位核苷酸并终止于第902位核苷酸的核酸互补的核酸组成。
32.与编码SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特异性杂交的反义多核苷酸的用途，用于制备预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物。
33.包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互独立的任一氨基酸残基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸残基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸残基。
34.根据权利要求33所述的多肽，其包含以下氨基酸序列PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
35.根据权利要求33所述的多肽，其由以下氨基酸序列组成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
36.体外筛选化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该方法包括步骤(i)将待检测候选化合物与权利要求33-35中任意一项所述的多肽孵育；(ii)分析待检测候选化合物与权利要求33-35中任意一项所述多肽的结合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(ii)由对步骤(i)最后获得的混合物进行凝胶迁移分析并对候选化合物和权利要求33-35中任意一项所述多肽之间形成的复合体进行检测组成。
38.体外筛选化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该方法包括步骤a)(i)将第一种CD4+T细胞培养物与候选化合物和HIV病毒相接触；(ii)在缺乏所述候选化合物的情况下，将第二种CD4+T细胞培养物与HIV病毒接触；和b)检测源于培养物(i)和培养物(ii)的CD4+T细胞表面NKp44L的存在。
39.根据权利要求38所述的方法，其包括额外的步骤(c)，该步骤由当源自培养物(ii)的CD4+T细胞表面NKp44L的表达水平高于源自培养物(i)的CD4+T细胞表面NKp44L的表达水平时，选择呈阳性的候选化合物作为治疗剂组成。
40.体外筛选化合物的方法，所述化合物用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病，其中该方法包括步骤(i)将候选化合物用于权利要求36或37所述的筛选方法；和(ii)将在步骤(i)中选择的呈阳性候选化合物用于权利要求38或39的筛选方法。
41.用于预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的特异结合权利要求33-35中任意一项所述多肽的配体化合物。
42.权利要求41所述的药物组合物，其中所述配体化合物由针对权利要求33-35中任意一项所述多肽的抗体组成。
43.特异结合权利要求33-35中任意一项所述多肽的配体化合物的用途，用于制备预防或治疗与个体HIV病毒感染相关的疾病的药物组合物。
44.用于治疗癌症的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂组合的有效量的权利要求33-35中任意一项所述的多肽。
全文摘要
本发明涉及个体感染属于人类免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的进展状态的体外诊断以及这种传染病治疗性治疗的领域。
文档编号G01N33/50GK1777810SQ200480009114
公开日2006年5月24日 申请日期2004年2月6日 优先权日2003年2月6日
发明者V·维埃拉德, P·德布雷 申请人:健康和医学国家研究院, 巴黎医疗事业救助局