专利名称：一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组抗原蛋白，尤其涉及一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的不同疾病的总称，该复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。牛结核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病，可通过病畜传染给人类或其他动物。牛结核病在世界各国均有发生，在我国依然是最常见的多发性疾病，牛结核病有众多的宿主谱，几乎可以感染所有的温血脊椎动物。牛结核病的传染流行不仅严重地影响到畜牧业的持续健康发展，更严重威胁着人类的身心健康。
由于奶牛和人的关系比较密切，并且奶牛结核病的患病率颇高，因此，奶牛是传播结核病给人类的最危险的动物，与病牛长期接触或不慎食用含结核菌牛奶的人都有可能感染结核病。国外的一项报告表明，在100个结核病患者中，有26例是由动物感染的。其中，15岁以下的竟占了20例，他们都与不慎饮用含结核杆菌的牛奶或与动物密切接触有关。由此可以看出，牛结核病是其他动物结核病最大的传染源。有报道说已经发现牛分枝杆菌能感染人并导致肺炎和肺外感染。但牛结核病感染一般发生在不太发达的国家和发达国家的特殊人群(即那些食用未经巴氏消毒的奶制品)。在圣地亚哥的1931个结核病例中，7％的分离菌株被确定为牛分枝杆菌。这些感染病例与食入了未消毒的粗制的奶产品有关系。这些患者中的53％是肺外感染，从儿童中分离的33％的菌株是牛分枝杆菌。人感染牛结核病的另一种来源是与感染动物的接触，如屠宰场工人、兽医和动物训练员。在发生该病的这些工人当中，以飞沫形式传播已被确认为是最可能的感染途径。
在那些还流行牛结核病的国家中，人类始终受到该病的威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。因此，1993年世界卫生组织(WHO)宣布结核病正处于全球紧急状态。所以，要从根本上控制牛结核病的发生与流行，必须加强对本病的诊断学和综合防治措施的研究，从而为控制和消灭牛结核病提供技术支持。
牛结核病的诊断方法有细菌学方法、分子生物学方法和免疫学方法等。诊断标准目前仍是依赖于患者的临床症状及细菌培养和涂片镜检。但结核分枝杆菌的培养时间较长，约需5～8周，且培养成功率亦只有80％左右。而分子生物学方法虽然特异性和敏感性较高，但只适于实验室操作而不适于临床推广应用。免疫学诊断方法包括结核菌素皮肤试验(TST)即变态反应诊断方法、ELISA方法和补体结合试验等。早期结核菌素是由甘油或综合苏通液中培养，取其除菌滤液浓缩而成，此即旧结核菌素(OT)。1932年人们在旧结素的基础上发现了纯结核菌素即纯化蛋白衍生物(PPD)，以此作为皮肤反应试剂在一定程度上提高了此反应的敏感性。
PPD虽称为纯化蛋白衍生物，但其实际上是一种相当复杂的混合物，包含有多种抗原成分。目前，许多学者正在致力于寻找一种或几种结核分枝杆菌特异性抗原作为结核病有效的诊断试剂。目前已用于结核杆菌诊断的抗原主要有ESAT-6、MPT32、Ag85、MPB70、MPB83、MPT51、MTC28、MPT64、19KD抗原、MPT63、38KD抗原、KatG、GroES和35KD抗原。
研究人员由结核杆菌培养滤液中鉴定并分离出了一种分子量为6KD的蛋白，将其命名为ESAT-6。1997年Pollock和Andersen证实ESAT-6是牛分枝杆菌感染后的一种重要的T细胞靶抗原，也是刺激IFN～γ应答的主要抗原。并证实此种低分子量抗原不存在于环境分枝杆菌中。进一步的研究证明EAST-6仅存在于结核分枝杆菌群及少数几种致病性分枝杆菌中。编码此蛋白的基因在90％以上的非致病性分枝杆菌中缺失(除堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌外)，此外该基因在所有BCG中也均缺如。Mortenharboe等利用ESAT-6的单抗HYB76-8对11个不同样品进行SDS-PAGE和免疫印迹检测，发现只有结核分枝杆菌H37RV珠、牛分枝杆菌AN5和Ravenel株3个样品在6KD处出现目的条带，对其它8个不同来源的BCG菌株及其它一些环境分枝杆菌不同菌株进行了Souther blotting和PCR分析，结果均证明ESAT-6抗原是区别结核杆菌和非结核分枝杆菌的最佳候选抗原。这些研究结果极大的推动了ESAT-6作为结核杆菌诊断试剂的研究进展。
ESAT-6是免疫记忆效应性T细胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期，诱导其迅速增值和释放高水平的IFN～γ，有效的激活巨噬细胞，控制结核病感染。近期的研究表明，结核病患牛对ESAT-6有高度的免疫应答，而禽型结核杆菌致敏的动物血液中只有本底浓度的IFN～γ。ESAT-6的应用明显的提高了IFN～γ试验的特异性，而敏感性却有所降低。与PPD-IFN～γ相比，其敏感性约为84～88％，而其特异性则很高，可达到99％～100％。IFN～γ对PPD的应答在结核病人及健康的BCG免疫接种者之间无明显差异，而未接种过BCG的健康者其IFN～γ对PPD的应答明显低于前两者(P＜0.01)。除ESAT-6外，研究者们在结核杆菌滤液中又发现了一种结核杆菌特异性抗原，其分子量为10KD，命名为CFP10，ESAT-6基因位于RD1区，CFP10基因亦属于ESAT-6基因家族成员，CFP10基因与ESAT-6基因具有相同的操纵子。
PPD不能鉴别TB感染、鸟型分枝杆菌致敏及BCG免疫产生的DTH应答，而ESAT-6和CFP10则可以，但与ESAT-6相比，有少数动物在鸟型分枝杆菌致敏及BCG免疫时会对CFP10产生轻微的非特异性阳性DTH反应。Laurens.A.H.Van Pinxteren等的研究表明在用PPD刺激下IFN～γ的应答率为95％，而ESAT-6和CFP10均为60％，ESAT-6-CFP10重组体为70％；在牛则为75％，ESAT-6和CFP10分别为70％和40％，ESAT-6-CFP10重组体则为75％，与PPD相近。IFN～γ对ESAT-6-CFP10重组蛋白的应答在结核病患者与健康者之间差异显著(P＜0.01)。在TB患者中，IFN～γ对PPD和重组ESAT-6C-FP10的应答之间差异不显著，但在健康者中，对两者的应答差异极为显著(P＜0.0001)。
以抗原刺激下IFN～γ的分泌量大于300pg/ml为标准，PPD的敏感性为91％，但特异性为0。ESAT-6-CFP10重组抗原的特异性和敏感性分别为73％和71％，若以IFN～γ的分泌量大于100pg/ml为标准则敏感性和特异性分别为82％和7％，ESAT-6-CFP10则为73％和93％，由此PPD与重组抗原之间的敏感性差异并不显著，而特异性间的差异则极为显著(P＜0.0001)。可见结核杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP10具有其它诊断试剂如PPD等无法比拟的优点。
除ESAT-6和CFP10外，结核杆菌培养滤液中提纯的抗原还有MPB59、MPB64、MPB70、MPB80、MPB83、Ag85等，其中研究较为广泛的是MPB70和Ag85。
MPB70是由结核杆菌培养滤液中分离出来的一种高度菌种特异性蛋白，其分子量为22KD。PPD中的其中一种成份即为MPB70，此外它也是牛分枝杆菌BCG株中的一种主要的抗原蛋白。牛分枝杆菌皮肤试验刺激感染动物的免疫系统，在一定条件下，可以使血清中抗MPB70抗体水平在短期内迅速升高。在皮肤试验中发现MPB70是一种严格的牛分枝杆菌BCG特异性抗原，在牛分枝杆菌BCG致敏的豚鼠体内MPB70可诱导DTH反应，而在H37RV和堪萨斯分枝杆菌致敏的豚鼠体内则不能诱导此反应。这说明MPB70具有菌种特异性。Morten Harboe等对比感染了牛分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌和假结核棒状杆菌的动物机体产生的针对MPB70的抗体ELISA试验，发现MPB70抗体群对于感染牛分枝杆菌的动物是高度特异的。P.R.Wood等的试验结果表明MPB70--ELISA试验的特异性为96.1％，但其敏感性较低，只有18.1％。而以MPB70进行的IFN～γ的特异性和敏感性可分别达到99.1％和81.8％。
目前，人们对结核杆菌多种抗原的研究主要集中于对其抗原“鸡尾酒”的分析。经过大量研究证实鸡尾酒皮肤试验比任何单一抗原都要强，而且随着抗原数量的增多而增强。以豚鼠为实验动物进行的分析表明，应用“鸡尾酒”式的多种抗原作为结核杆菌诊断试剂是可行的。对“鸡尾酒”抗原应答的T细胞数量显著比其中一种抗原应答的量多。结核杆菌“鸡尾酒”式的特异性抗原在牛型分枝杆菌BCG免疫鼠体内可诱导DTH反应，但在禽型分枝杆菌免疫实验动物体内却不存在此反应。
此外，在结核杆菌诊断的血清学方法中，“鸡尾酒”式的多种抗原应用也有助于此方法特异性和敏感性的提高。血清学试验不像细菌学方法需鉴定其中致病菌的存在，只需检测机体对结核杆菌的免疫应答即可。血清学方法简便、迅速、所需花费较少，而且此方法可鉴别显性感染和隐性感染。人们对结核分枝杆菌抗体应答的认识均来自于血清学试验，在此过程中发现单一抗原无法产生令人满意的血清学诊断结果。如免疫优势抗原38KD的血清学试验在痰涂片阳性肺结核杆菌中的敏感性为80％，而在阴性病例中仅为15％。Maria Laura Gennaro以不同的单一抗原及多种抗原混合物作为包被抗原进行ELISA试验，结果表明以单一抗原进行的ELISA试验只有少数几种抗原如38KD、14KD、ESAT-6和MPT32具有相对较高的敏感性，而以多种抗原混合物进行的ELISA试验均具有较高的敏感性，其中以6种抗原混合的结果最好。进一步证明了以多种抗原鸡尾酒作为诊断试剂的优势所在，这就迫使人们把研究的重点转移到多种抗原上。
到目前为止，世界动物卫生组织(OIE)推荐牛结核病的诊断方法只有结核菌素(PPD)变态反应。该方法在牛结核病的诊断和防制过程中起到了重要的作用，美国和欧共体的许多国家利用该方法消灭和控制了牛结核病，以至于现在世界动物卫生组织(OIE)仍以该方法作为牛结核病法定的检疫方法。但该诊断方法存在许多弊端，除物理的和化学的因素之外，更多的是非典型分枝杆菌的干扰，常造成非特异反应的发生。随着该方法的严格性、非特异反应越来越重，以至于该方法的特异性大为降低。因此，寻求特异敏感的诊断抗原已成为牛结核病诊断技术研究的重要方面。
在结核杆菌血清学试验中，ELISA作为IT(传统结核杆菌试验)的补充试验对于鉴别IT阴性和假阴性反应具有重要作用。在西方一些国家，ELISA诊断方法在结核杆菌流行病学检测中的应用大大缩减了对牛结核病控制与消灭计划的开支，但同时有报道称ELISA试验在结核杆菌诊断上的敏感性只有47.5％。以多种抗原“鸡尾酒”进行ELISA试验有望提高其反应的敏感性。
以“鸡尾酒”多种抗原进行牛结核病诊断有望提高其反应的敏感性和特异性。应用多抗原进行诊断试剂的研究，需要将多种抗原分别进行表达和纯化(或分别进行提纯)，不仅费时、费力，而且还存在配合比例不均的问题，这有可能影响诊断方法的敏感性和特异性的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种敏感性和特异性高的牛结核病诊断抗原蛋白。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白，它是由牛分枝杆菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白依次连接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT-6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
所述的重组抗原蛋白其特征是MPB70抗原蛋白和MPB83抗原蛋白之间以及MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白之间具有连接肽序列(-SPGS-)。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种制备所述的诊断牛结核病的重组抗原蛋白的方法。
本发明所要解决的另一技术问题是通过以下技术途径来实现的一种制备诊断牛结核病的重组抗原蛋白的方法，步骤如下1)利用序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的核苷酸序列为引物，扩增出MPB70基因；利用序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的核苷酸序列为引物，扩增出MPB83基因；利用序列表SEQ ID NO9和SEQ IDNO10所示的核苷酸序列为引物，扩增出ESAT-6基因，2)以SEQ ID NO5和SEQ ID NO8核苷酸序列为引物，以MPB70基因和MPB83基因为模板，进行PCR扩增，3)回收步骤2)的PCR扩增产物，将回收的PCR扩增产物用限制性内切酶进行双酶切，然后与经过同样酶切处理的表达载体进行连接，转化到受体菌中，获得含有MPB70-MPB83串连基因的重组表达载体。
4)将含有MPB70-MPB83串连基因的重组质粒双酶切后与经过同样酶切处理的ESAT-6基因进行连接、转化和表达，将所表达重组蛋白收集、纯化即得。
上述制备方法中，其中步骤1)中扩增MPB70基因、MPB83基因和ESAT-6基因所用的模板是牛分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA；步骤3)中将回收的MPB70-MPB83基因分别用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，然后与经过同样酶切处理的表达载体pET32a进行连接，转化到DE3受体菌中；步骤4)中将含有MPB70-MPB83串连基因的重组质粒用BamHI和EcoRI进行双酶切后与经过同样酶切处理的ESAT-6基因进行连接。
上述制备方法将多种抗原置于同一个表达载体中进行串连表达，这不仅解决了多抗原分别表达和纯化费时、费力等问题，而且还解决了配比不均的问题，有利于提高诊断方法的敏感性和特异性。同时，在每个抗原基因之间加入了连接肽，能够使每个抗原蛋白独立发挥各自的功能而不相互影响，所以由本发明方法所制备的牛结核病诊断重组抗原蛋白与现有牛结核病诊断抗原蛋白相比具有敏感性和特异性高等优点，在牛结核病诊断方面具有广泛的应用前景。本发明重组蛋白抗原可用于牛结核病ELISA和皮试变态反应的诊断抗原。
图1MPB70-MPB83串连基因的PCR扩增结果AMPB70-MPB83二基因串连的PCR扩增产物，BDL2000marker。
图2MPB70-MPB83串连二基因重组质粒的酶切鉴定ADL2000marker，BMPB70-MPB83串连二基因重组质粒的酶切。
图3MPB70-MPB83-ESAT-6三基因串连重组质粒的酶切鉴定ADL2000marker，BMPB70-MPB83-ESAT-6三基因串连重组质粒的酶切。
图4三基因串连重组质粒的表达A蛋白质中分子量marker，B和C细菌裂解上清，D和E全菌裂解液，FpET32a载体对照。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式本发明牛结核病诊断重组抗原蛋白的制备MPB70基因的PCR扩增牛分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA(中国生物药品检定所)1ul，引物MPB70-F和MPB70-R各1ul(MPB70-FAGGGTACCATGGAATACGCGGCAGCCAAT，SEQ ID NO5，MPB70-RGGAACCTGGAGACGCCGGAGGCATTAG，SEQ ID NO6)，引物浓度为20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfu TagDNA聚合酶0.5ul，以水补足，反应体系为50ul，然后进行PCR扩增。扩增的PCR产物为483bp。PCR反应的条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。在1.5％的琼脂搪凝胶上进行电泳，100V电压20分钟后观察结果。然后用胶回收试剂盒进行MPB70基因的回收。
MPB83基因的PCR扩增牛分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA 1ul，引物MPB83-F和MPB83-R各1ul(MPB83-FTCTCCAGGTTCCATCAACGTTCAGGCCAAAC，SEQ IDNO7，MPB83-RTGTGGATCCCGGAGACACCGTATCGATCAT，SEQ IDNO8)，引物浓度为20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfu TagDNA聚合酶0.5ul，以水补足，反应体系为50ul，然后进行PCR扩增。扩增的PCR产物为669bp。PCR反应的条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。在1.5％的琼脂搪凝胶上进行电泳，100V电压20分钟后观察结果。然后应用胶回收试剂盒进行MPB83基因回收。
ESAT-6基因的PCR扩增牛分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA 1ul，引物ESAT-6-F和ESAT-6-R各1ul(ESAT-6-FACGGGATCCGAGCAGCAGTGGAATTTC，SEQ ID NO9，ESAT-6-RGCCGAATTCCTATGCGAACATCCCAGTG，SEQ ID NO10)，引物浓度为20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfuTagDNA聚合酶0.5ul，以水补足，反应体系为50ul，然后进行PCR扩增。扩增的PCR产物为288bp。PCR反应的条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，63℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。在1.5％的琼脂搪凝胶上进行电泳，100V电压20分钟后观察结果。然后应用胶回收试剂盒进行ESAT-6基因回收。
MPB70基因和MPB83基因的串连回收的MPB70PCR产物和MPB83PCR产物各1ul，引物MPB70-FAGGGTACCATGGAATACGCGGCAGCCAAT，MPB83-RTGTGGATCCCGGAGACACCGTATCGATCAT，引物各1ul，10×TagDNA聚合酶Buffer 5ul、2.5mM dNTP 3ul、Ex TagDNA聚合酶0.5ul，以水补足，反应体系为50ul，然后进行PCR扩增。扩增的PCR产物为1152bp。PCR反应的条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。在1.5％的琼脂搪凝胶上进行电泳，100V电压20分钟后观察结果。然后应用胶回收试剂盒进行MPB70-MPB83基因回收。结果PCR扩增出1152bp的DNA片断(见图1)，与实际设计的大小相符。
MPB70-MPB83串连二基因的分子克隆将回收的MPB70-MPB83基因分别用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，然后与经过同样处理的表达载体pET32a进行连接，转化到DE3受体菌中，经过质粒提取及重组质粒的鉴定，获得含有MPB70-MPB83串连基因的重组表达载体。结果经过酶切鉴定(见图2)和序列测定，表明已经构建成功含有二基因串联的重组表达载体。
所述的MPB70基因、MPB83基因和ESAT-6基因的串连三基因的分子克隆将含有MPB70-MPB83串连基因的重组质粒用BamHI和EcoRI进行酶切后与经过同样处理的ESAT-6基因进行连接、转化和表达。
结果经过酶切鉴定(如图3所示)和序列测定(SEQ ID NO4所示的核苷酸序列)，表明已经构建成功含有三基因串联的重组表达载体，经过IPTG诱导进行了表达(如图4所示)，表达的重组蛋白与实际设计的大小相符。将IPTG诱导后的菌液经过离心、洗涤后进行超声波裂解，高速离心后收集上清液，应用亲和层析柱进行纯化，测定纯化后的蛋白浓度，测定的蛋白浓度为0.2mg/ml。纯化后的蛋白置于-70℃保存。
本发明重组抗原蛋白的诊断效果试验将本发明实施例所表达的重组蛋白纯化后，所纯化的重组蛋白可以作为ELISA的诊断抗原，用于临床样品的检测，能够达到“鸡尾酒”式的多种抗原的诊断效果。
ELISA检测程序1、将纯化后的重组抗原用pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释后进行包被ELISA板(Nunco公司)，50μl/孔，4℃过夜；2、次日甩掉液体，加3％明胶(Sigma)进行封闭，100μl/孔37℃湿盒1h；3、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤3次，200μl/孔每次3min；4、加用PBST稀释后的待检血清，50μl/孔37℃湿盒1h，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照；5、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤3次，200μl/孔每次3min；6、加用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛的二抗(Sigma公司)，50μl/孔，37℃湿盒1h；7、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤3次，200μl/孔每次3min；8、加底物50μl/孔，避光室温放置10min显色；9、加50μl/孔2M H2SO4终止反应，495nm测定OD值。
10、结果判定OD＞0.5为阳性，OD＜0.5为阴性试验结果见表1。
表1 本发明重组抗原蛋白的ELISA诊断效果试验
说明供试样品的数值结果大于等于0.5为阳性结果表明采用本发明重组表达的蛋白质作为抗原，可用间接ELISA试验方法检测牛结核病，检测结果准确率高，说明本发明重组蛋白抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于牛结核病的血清学诊断。此外，该重组抗原还可作为用于牛结核病皮试变态反应的诊断抗原。
SEQUENCE LISTING<110>中国农科院哈尔滨兽医研究所<120>一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法<130>20050127<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>156<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>1Gly Thr Glu Tyr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gln1 5 10 15Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu20 25 30Leu Thr Thr Leu Thr Ala Leu Ser Ala Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val35 40 45Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Arg50 55 60Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu65 70 75 80Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Val85 90 95Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu100 105 110Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val115 120 125Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala Thr130 135 140Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu Met Pro Pro Ala
145150 155<210>2<211>213<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>2Ile Asn Val Gln Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala Ile1 5 10 15Ala Ile Ala Phe Leu Ala Gly Cys Ser Ser Thr Lys Pro Val Ser Gln20 25 30Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ser Pro Ala Ala Pro Val Thr Thr35 40 45Ala Ala Met Ala Asp Pro Ala Ala Asp Leu Ile Gly Arg Gly Cys Ala50 55 60Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Pro Thr Gly Pro Gly Ser Val Ala Gly Met65 70 75 80Ala Gln Asp Pro Val Ala Thr Ala Ala Ser Asn Asn Pro Met Leu Ser85 90 95Thr Leu Thr Ser Ala Leu Ser Gly Lys Leu Asn Pro Asp Val Asn Leu100 105 110Val Asp Thr Leu Asn Gly Gly Glu Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn115 120 125Ala Ala Phe Asp Lys Leu Pro Ala Ala Thr Ile Asp Gln Leu Lys Thr130 135 140Asp Ala Lys Leu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Ile Ala Gly145 150 155 160Gln Ala Ser Pro Ser Arg Ile Asp Gly Thr His Gln Thr Leu Gln Gly165 170 175Ala Asp Leu Thr Val Ile Gly Ala Arg Asp Asp Leu Met Val Asn Asn180 185 190
Ala Gly Leu Val Cys Gly Gly Val His Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr195 200 205Met Ile Asp Thr Val210<210>3<211>93<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>3Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile1 5 10 15Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln20 25 30Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala35 40 45Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn50 55 60Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala65 70 75 80Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala85 90<210>4<211>1419<212>DNA<213>Mycobacterium bovis<400>4ggtaccgaat acgcggcagc caatcccact gggccggcct cggtgcaggg aatgtcgcag60gacccggtcg cggtggcggc ctcgaacaat ccggagttga caacgctgac ggctgcactg120tcgggccagc tcaatccgca agtaaacctg gtggacaccc tcaacagcgg tcagtacacg180gtgttcgcac ggaccaacgc ggcatttagc aagctgccgg catccacgat cgacgagctc240aagaccaatt cgtcactgct gaccagcatc ctgacctacc acgtagtggc cggccaaacc300
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权利要求
1.一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白，它是由牛分枝杆菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白依次连接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT-6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述的重组抗原蛋白，其特征是MPB70抗原蛋白和MPB83抗原蛋白之间以及MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白之间具有连接肽序列。
3.按照权利要求1所述的重组抗原蛋白，其特征是MPB70抗原蛋白位于该重组抗原蛋白的氨基端，ESAT-6抗原蛋白位于该重组抗原蛋白的羧基端。
4.编码权利要求1～3中任意一项所述的重组抗原蛋白基因。
5.按照权利要求4所述的基因，其特征是选自如下的任一核苷酸序列1)具有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列；2)由在严紧的杂交条件下与SEQ ID NO4所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
6.按照权利要求5所述的基因，其特征是具有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
7.制备权利要求1～4中任意一项所述的重组抗原蛋白的方法，步骤如下1)利用序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的核苷酸序列为引物，扩增出MPB70基因；利用序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的核苷酸序列为引物，扩增出MPB83基因；利用序列表SEQ ID NO9和SEQ IDNO10所示的核苷酸序列为引物，扩增出ESAT-6基因，2)以SEQ ID NO5和SEQ ID NO8核苷酸序列为引物，以MPB70基因和MPB83基因为模板，进行PCR扩增，3)回收步骤2)的PCR扩增产物，将回收的PCR扩增产物用限制性内切酶进行双酶切，然后与经过同样酶切处理的表达载体进行连接，转化到受体菌中，获得含有MPB70-MPB83串连基因的重组表达载体。4)将含有MPB70-MPB83串连基因的重组质粒双酶切后与经过同样酶切处理的ESAT-6基因进行连接、转化和表达，将所表达重组蛋白收集、纯化即得。
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征是步骤3)中将回收的MPB70-MPB83基因分别用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，然后与经过同样酶切处理的表达载体pET32a进行连接，转化到DE3受体菌中。
9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征是步骤4)中将含有MPB70-MPB83串连基因的重组质粒用BamHI和EcoRI进行双酶切后与经过同样酶切处理的ESAT-6基因进行连接。
10.权利要求1～4所述的重组抗原蛋白在制备检测、诊断牛结核病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种新的诊断牛结核病的重组抗原蛋白，该重组抗原蛋白是由牛分枝杆菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT－6抗原蛋白依次连接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT－6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。试验证实，本发明的重组抗原蛋白对于牛结核病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，在牛结核病诊断方面具有广泛的应用前景。
文档编号G01N33/68GK1810838SQ20051000500
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者刘思国, 郭设平, 王春来, 张秀华, 郭洋, 邵美丽 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所