专利名称：一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法
技术领域：
本发明涉及细胞内活性氧与还原型谷胱甘肽的检测，具体地说是一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法。
背景技术：
活性氧(ROS)与还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞内信号转导过程中的两类重要信号分子，与细胞内氧化还原状态密切相关。活性氧主要是指由外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的一类具有很高生物活性的氧分子，如O2-，NO，H2O2，OH等。当机体处于应激状态、细胞缺氧、受损或细胞凋亡时，细胞内活性氧过量生成。还原型谷胱甘肽是细胞内含量最多的一种强还原剂，主要功能在于可清除体内过量的活性氧类物质，防止蛋白巯基氧化，并维持细胞内的氧化-还原平衡。对细胞活性氧和还原型谷胱甘肽进行测定是研究氧自由基与应激反应、及与人类疾病相关性的重要指标。
目前用于活性氧和还原型谷胱甘肽的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)，荧光法，酶学法以及流式细胞仪等。这些方法虽各有所长，但总体而言，所需样品用量大，灵敏度不高，且不能对两种物质进行同时检测。微流控芯片(又称芯片实验室)是近几年发展起来的一项崭新的分析技术，它能将生化反应过程中的不同操作单元基本集成在一块只有几平方厘米大小的芯片上完成，具有分析速度快、样品用量小、易于集成等特点，被称为21世纪最为重要的前沿技术之一。原则上它适用于对核酸、蛋白和小分子等的分离分析，并有可能用于对细胞内复杂组分如活性氧和还原型谷胱甘肽的分析测定。利用微流控芯片对细胞活性氧和还原型谷胱甘肽进行同时测定，目前国内外未见报导。
发明内容
本发明目的在于提供一种样品用量少、检测灵敏度较高、可同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，本发明在微流控芯片上实现了对两种物质的同时测定，分析时间仅用27秒，样品用量非常少(3-4uL)，且检测灵敏度较高(amol-zmol)。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，采用微流控芯片对细胞活性氧和还原型谷胱甘肽同时测定，微流控芯片电泳采用的缓冲液浓度为20-50mM，缓冲液pH值为8.0-10.1，分离电压为200-450V/cm，检测点距进样通道和分离通道交叉处为1.0-3.0cm。
具体操作内容包括微流控芯片设计，细胞内活性氧与谷胱甘肽荧光标记和提取方法，微流控芯片电泳分离条件和微流控芯片激光诱导荧光检测方法。
本发明以微流控芯片为技术平台，以微流控芯片-激光诱导荧光为检测手段，所选激光激发波长为473nm，检测波长520nm；采用探针DHR-123和NDA分别来标记细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽，采用有机溶剂(高氯酸和乙晴混合液)来提取细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽；所述高氯酸和乙晴混合液的重量浓度为3.3％高氯酸与乙腈按体积比1∶1混合，其中高氯酸与乙晴的体积比为1∶1微流控芯片的芯片材料可采用玻璃、石英或其它芯片材料；芯片设计最好采用双T型结构，样品进样采用夹切方式来确保进样容积的准确性；缓冲液可为磷酸缓冲液、硼砂缓冲液等，最好为硼砂缓冲液；本发明的优点为1.本发明的检测方法样品用量非常少(3-4uL)，在微流控芯片上实现了对两种物质(细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽)的同时测定，分析时间仅用27秒，且检测灵敏度较高(amol-zmol)，所优化的微流控芯片电泳条件适用范围较宽(主要包括缓冲液浓度，pH值，电泳进样和分离电压等条件)。
2.本发明提供了一通用型的细胞活性氧和还原型谷胱甘肽的芯片检测方法，适用于引起机体氧化应激时细胞氧化还原状态变化的监测，并可适用于不同类型细胞如肿瘤细胞、红细胞、神经元及胚胎等的检测，实验操作方便易行，具有可操作性。
图1为本发明所采用微流控芯片结构示意图；图2为本发明微流控芯片激光诱导荧光光路设计图；图3为NB4细胞中活性氧和还原型谷胱甘肽的微流控芯片电泳图；图4为K562细胞中活性氧和还原型谷胱甘肽的微流控芯片电泳图，其中坐标分别代表相对荧光强度(mV)和迁移时间(s)。
具体实施例方式
实施例
1.微流控芯片设计本发明实施所采用微流控芯片设计如下图1所示，所采用玻璃芯片为双T型结构，图中四个圆孔分别代表不同溶液池，其中2为缓冲液进样池，4为缓冲液废液池，1为样品池，3为样品废液池，5为检测点。芯片的分离通道长8.5cm(从缓冲液池至十字交叉处为0.5cm，从十字交叉处至分离废液池为8.0cm)，进样通道长为1.0cm(从样品池至十字交叉处和从十字交叉处至样品废液池均为0.5cm)，通道的横截面近似为半椭圆形，上宽为50μm，检测点距十字交叉处为1.0cm。
2.微流控芯片激光诱导荧光检测器微流控芯片-激光诱导荧光检测器所选用激光激发波长为473nm，检测波长为520nm，采用单点共聚焦检测方式，微流控芯片激光诱导荧光光路设计图见图2，其中6为物镜，7为半反半透镜，8为分光镜，9为第一带通滤光片，10为凸透镜，11为针孔，12为光电倍增管，13为芯片，14为第二带通滤光片，15为激光，16为电感耦合器件。
3.细胞样品制备以人急性早幼粒白细胞系NB4细胞为例，细胞培养于含10％新生牛血清的RPMI1640培养液中，于5％CO2培养箱37度培养。收集细胞，于1000rpm离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS溶液(pH 7.4)重悬后离心，细胞计数后待用。
4.细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽荧光标记和提取方法分别采用DHR-123和NDA对细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽进行荧光标记，针对活性氧，DHR-123标记浓度为20-30uM。由于NDA与还原型谷胱甘肽反应很快，实验中将NDA加入运行缓冲液中达终浓度0.1-0.5mM来动态标记谷胱甘肽。实验中所用细胞密度在1×105/mL左右，首先将20uM的DHR-123染料加入细胞培养液中作用20-30分钟，然后将细胞悬液用PBS洗涤三次(800转，6分钟)，弃上清，保留沉淀，然后加入与沉淀部分等体积的的高氯酸/乙晴混合液(3.3％)，经高速(12,000转)离心5分钟。后弃上清，再重复上述步骤两次，保留细胞沉淀，待检。
5.微流控片电泳分离条件每次运行前，需要将芯片通道分别用水、0.1M氢氧化钠和缓冲液进行冲洗。上样时尽量保持4个缓冲池液面处于同一水平位置，然后插入电极。见图1，在进样过程中，将样品废液池3接地，施加+200V电压于样品池1，缓冲液池2和缓冲废液池4分别施加150V和600V电压，进样时间12s。分离过程中，缓冲废液池4接地，样品池1和样品废液池3分别施加2kV电压，在缓冲池2上施加+3kV电压。首先对微流控芯片电泳分离条件如缓冲液、pH、分离电压等条件进行考察。经优化选择的电泳条件为硼砂缓冲液20-50mM，缓冲液pH值范围8.0-10.1，分离电压200-450V/cm。
6.应用实例图3和图4分别为NB4细胞和K562细胞中活性氧和还原型谷胱甘肽的微流控芯片电泳图，电泳图中峰1和峰2分别代表细胞活性氧和还原型谷胱甘肽。整个分离时间仅用27s，实际样品消耗量仅用3-4uL，且检测灵敏度较高。表1为微流控芯片检测活性氧和谷胱甘肽的主要性能指标.表中可见其检测灵敏度较高，对活性氧和谷胱甘肽检测可达pmol和amol水平。
表1.微流控芯片检测活性氧和还原型谷胱甘肽的主要性能指标(Table 1.Linearity，reproducibility，and detection limits of ROS and GSH)
权利要求
1.一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于采用微流控芯片对细胞活性氧和还原型谷胱甘肽同时测定，微流控芯片电泳采用的缓冲液浓度为20-50mM，缓冲液pH值为8.0-10.1，分离电压为200-450V/cm，检测点距进样通道和分离通道交叉处为1.0-3.0cm。
2.按照权利要求1所述同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于以微流控芯片为技术平台，以微流控芯片-激光诱导荧光为检测手段，所选激光激发波长为473nm，检测波长520nm。
3.按照权利要求1或2所述同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于所述微流控芯片为双T型结构。
4.按照权利要求1所述同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于所述缓冲液为硼砂缓冲液。
5.按照权利要求1所述同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于采用探针DHR-123和NDA分别来标记细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽，采用高氯酸和乙晴混合液来提取细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽。
6.按照权利要求5所述同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于所述高氯酸和乙晴混合液的重量浓度为3.3％高氯酸与乙腈按体积比1∶1混合，其中高氯酸与乙晴的体积比为1∶1。
全文摘要
本发明涉及细胞内活性氧与还原型谷胱甘肽的检测，具体地说是一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，采用微流控芯片对细胞活性氧和还原型谷胱甘肽同时测定，微流控芯片电泳采用的缓冲液浓度为20－50mM，缓冲液pH值为8.0－10.1，分离电压为200－450V/cm，检测点距进样通道和分离通道交叉处为1.0－3.0cm。本发明的检测方法样品用量非常少(3－4uL)，在微流控芯片上实现了对细胞内活性氧和还原型谷胱甘肽的同时测定，分析时间仅用27秒，且检测灵敏度较高(amol－zmol)。
文档编号G01N21/64GK1940550SQ20051004728
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者秦建华, 叶囡楠, 姜雷, 谢敏豪, 林炳承 申请人:中国科学院大连化学物理研究所