专利名称：NT-proANP和NT-proBNP用于诊断心脏病的用途的制作方法
专利说明NT-proANP和NT-proBNP用于诊断心脏病的用途 本发明涉及生物标记(biomarker)用于诊断心脏病的用途，特别是用于诊断急性心脏事件和慢性心脏病。
在北半球，心脏病属于发病和死亡的最常见的诱因。一旦心脏病患者出现心机能不全或者甚至心脏代偿失调(decompensation)的症状时，他们通常被送到他们的普通开业医生(general practitioner)的面前或者送到医院的急诊室。
心脏代偿失调通常需要迅速而恰当的治疗。特别地，在急性心脏事件如心肌梗塞中，如果能够尽早进行治疗，如血管再形成术，其预后是最佳的。然而，虽然目前的诊断工具如心电图仪和超声波心动描记术被广泛使用，但是它们还不能提供可靠的心脏病诊断结果。因此，心脏病常常被普通开业医生误诊。(Svendstrup Nielsen，L等人，(2003)，N-末端脑利钠肽前体用于区分心源性和非心源性的呼吸困难，TheEuropean Jounal of Heart Failure)。
此外，心脏代偿失调可能由不同类型疾病引起。例如急性心脏代偿失调由急性心脏事件引起，也可由慢性心脏病的代偿失调引起。为了选择最佳的治疗方式，迅速获得心脏代偿失调诱因的相关信息是有利的。然而，急性心脏事件的临床症状与由潜在的慢性心脏病引起的急性心脏代偿失调的症状非常相似。
因此，需要简单、快速和可靠的诊断工具，对于普通的开业医生和/或内科医师来说尤其如此。
生物标记用于诊断目的的用途也是已知的。心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)是钠尿激素或心脏激素家族的两个成员。在体内，ANP和BNP是通过蛋白质水解断裂前体分子产生的，生成活性激素和(ANP或BNP)和N-末端片段(分别是NT-proANP和NT-proBNP)。
已经有人论述钠尿激素化验可作为随即会发生心力衰竭的心脏病的预后标记，而且可减少对心脏作进一步的研究(Clerico，A.，Emdin，M.(2004)心源性利钠肽测量的诊断精确度以及预后相关性的综述.Clinical Chemistry 501，33-50)。
然而，ANP、BNP、NT-proANP和NT-proBNP等不同分子的相关诊断价值还仍然存在争议。如最近的一篇综述所述，“尽管比较数据有限，但是N-ANP、BNP和N-BNP似乎能够提供性质类似的信息”。因此，“由于BNP是在心脏负荷过重较长时间后才被激活，ANP将是容量负荷(volume load)的急性血液动力学变化的好标记，而且心力衰竭是由于存储的心房ANP迅速释放而引起的。因此在心力衰竭诊断中，同时测量ANP和BNP(或者N-ANP和N-BNP)的价值是否高于单独测量ANP或BNP(N-ANP或N-BNP)的价值还没有确定。”(Ruskoaho，H.(2003)心脏激素作为心力衰竭的诊断工具.EndocrineReviews 24(3)341-356)。
一般认为，与BNP相比，特别是与NT-proANP或NT-proBNP相比，ANP可能是急性负荷过重和/或心血管血液动力学快速变化的更好标记(Clerico，A.，Emdin，M.(2004)，上文引用)。近来的一篇综述指出，BNP和NT-proBNP比A型利钠肽更加有用(在诊断方面)(McMurry，J.J.V.和Pfeffer，M.A.(2005).Heart failure.Lancet，第365卷1877-89，见第1879页)。
不同利钠肽的分子特性差异相当大，这使得情形变得更为复杂。例如，ANP是一种极其不稳定的分子(血浆半衰期为2-5分钟)。有责任心的人员需要经过专业培训和十分勤奋学习才能获得可靠的结果。因此，对于常规的临床实践来说，测量ANP似乎是毫无用处的。
一个实际试验证明，在入院时，急性心肌梗塞患者体内的BNP和ANP都升高(Morita，E.，Yasue，H.，Yoshimura，M.等人(1993)，急性心肌梗塞患者的脑利钠肽的血浆水平升高(Increased plasma levelsof brain natriuretic peptide in patients with acute myocardialinfarction).Circulation，88(1)82-91。
然而，该试验仅涉及所选择的急性心肌梗塞患者的ANP和BNP的血浆水平，而不是临床实践中不同种类的患者群体。特别地，被分析的患者是基于CK-MB水平已经升高来进行选择的，CK-MB是坏死的一种标记。坏死标记表明心肌梗塞已经造成严重且通常是不可逆的损害。
因此，在现有技术中，目前还没有一种生物标记，其特别是可以在坏死明显之前早期诊断急性心脏事件，和/或能够将急性的和慢性的心脏机能不全区分开来。
因此，本发明的一个目的在于提供用于改进心脏病的早期诊断的方法和工具，特别是用于诊断急性心脏事件。本发明的另一目的在于提供将急性心脏事件和慢性心脏病区分开来的方法和工具。
在第一个具体实施方式
中，本发明目的通过一种诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的心脏病的方法来实现，该方法包括如下步骤 a)测量来自，优选在体外测量患者的样本中的NT-proABNP或其变体的水平， b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP或其变体的水平， c)将NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的信息进行组合，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，和/或其中在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在慢性心脏病。
本发明的方法还可以将具有急性心脏代偿失调症状的患者中的急性心脏事件与慢性心脏病区分开来，特别是与慢性心脏病的代偿失调区分开来。
类似地，本发明还涉及NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的组合信息的用途，用于在具有急性心脏代偿失调症状的患者中诊断、优选早期诊断心脏病，特别是诊断急性心脏事件和/或慢性心脏病。这种用途类似地适用于本说明书和实施例中公开的所有其他特征以及优选的实施方案。
该方法还包括从患者中采集样本的步骤，例如获取体液或者组织样本。在本发明中，获取体液或者组织样本优选由非医疗行业的职员(即未接受过从事医师职业所需的教育)实施。如果样本是血液，尤其如此。
在本发明的上下文中，已经发现在急性心脏代偿失调的早期阶段，NT-proANP和NT-proBNP的血浆水平具有不同时间-进程。这些时间-进程取决于患者中潜在的心脏病的类型。如果患者患有慢性心脏病，则NT-proANP和NT-proBNP水平具有性质相似的时间-进程。如果患者发生急性心脏事件，则与慢性心脏病相比，NT-proBNP的升高更为缓慢，并且总体水平较低。相反，NT-proANP比NT-proBNP更为迅速地升高，然后降低到比慢性心脏病更低水平(见实施例1)。
本发明还提高了对心脏病患者进行诊断的安全性。如上指出，在本发明的上下文中，已经发现NT-proBNP水平仅在急性心脏事件发生后的相当长时间间隔之后才升高。因此，在发生急性心脏事件后立即进行NT-proBNP测量会产生假阴性的诊断结果，或者低估心脏功能紊乱的程度并且会延迟开始进行心脏治疗(还参见实施例1)。然而，延迟进行心脏治疗会严重影响心机能不全患者的预后。另一个方面，在本发明的上下文中，已经发现由于NT-proANP水平在达到峰值后的没几个小时内会下降，则仅测量NT-proANP会导致低估心脏机能不全或心脏病的程度。
因此，组合测量NT-proANP和NT-proBNP有助于特别是在紧急的情况下避免错误诊断或者延误诊断。
如实施例3中所示，如果仅仅是缺血而心脏功能未受到严重损害时，按照本发明的方法不太可能显示存在急性心脏事件。
本发明利用了某些“生物标记”(或仅仅是“标记”)，更特别地是生物化学标记或分子标记。术语“生物标记”、“生物化学标记”和“分子标记”是本领域技术人员已知的。特别地，生物化学标记或分子标记是基因表达产物，在存在或者不存在某些条件、疾病或者并发症时，这些标记被差别地表达(即被上调或者被下调)。通常，分子标记被定义为一种核酸(如mRNA)，而生物化学标记是一种蛋白质或肽。一定水平的合适生物标记能够指示是否存在某种状况或疾病，从而使得可以进行诊断。
本发明特别地利用了NT-proANP和NT-proBNP作为生物标记，特别是作为生物化学标记。
NT-proANP和NT-proBNP属于利钠肽(参见例如Bonow，R.O.(1996).对心源性利钠肽的新认识.Circulation 931946-1950)。如曾经提及，通过蛋白质水解裂解前体分子前原肽(pre-pro peptides)，生成活性激素(ANP或BNP)和相应的N-末端片段(分别为NT-proANP和NT-proBNP)，从而得到NT-proANP和NT-proBNP。
前原肽(pre-proBNP具有134个氨基酸)包括短的信号肽，信号肽被酶促断裂后释放前肽(proBNP具有108个氨基酸)。前肽被进一步裂解成N-末端前肽(NT-前肽，NT-proBNP具有76个氨基酸)和活性激素(BNP具有32个氨基酸，ANP具有28个氨基酸)。
不同的裂解产物具有数种不同特性。BNP主要(虽然不是专有地)在心室中生成，并且在心室壁压力增大时释放。相反，ANP专门由心房产生并释放。ANP和BNP是活性激素并且半衰期低于各自相应的无活性的配对物NT-proANP和NT-proBNP。BNP在血液中被代谢，而NT-proBNP作为一个完整分子在血液中循环，并被肾脏消除。NT-proBNP的体内半衰期比BNP长120分钟，BNP的半衰期为20分钟(Smith MW，Espiner EA，Yandle TG，Charles CJ，Richards AM.人的脑利钠肽的代谢延缓显示出对中性内肽酶的抗性.J Endocrinol.2000；167239-46)。
使用NT-proBNP的预分析十分强大，使得可以容易地将样本运送到中心实验室(Mueller T，Gegenhuber A，Dieplinger B，Poelz W，Haltmayer M.内源性B型利钠肽(BNP)和氨基末端proBNP(NT-proBNP)在冷冻血浆样本中的长期稳定性.Clin Chem Lab Med 2004；42942-4)。血液样本可以在室温下存储数天或者被邮寄或者运输，而不引起回收损失(recovery loss)。相反，BNP在室温下或4℃下存储48小时，其浓度损失至少20％(Mueller T，Gegenhuber A等人，Clin ChemLab Med 2004；42942-4，同上文；Wu AH，Packer M，Smith A，BijouR，Fink D，Mair J，Wallentin L，Johnston N，Feldcamp CS，HaverstickDM，Ahnadi CE，Grant A，Despres N，Bluestein B，Ghani F.对心力衰竭患者中进行的Bayer ADVIA Centaur自动B型利钠肽化验的分析评价和临床评价多点试验.Clin Chem 2004；50867-73)。
类似地，NT-proANP的预分析比ANP的预分析强大。ANP在血浆或血清中不稳定。ANP的血浆半衰期为约2-5分钟，而NT-proANP的血浆半衰期为约40-50分钟。
因此，本发明提供强大的可用于日常临床实践的生物标记。
术语NT-proANP或NT-proBNP的“变体”涉及与NT-proANP或NT-proBNP实质上相似的肽。本领域技术人员非常理解术语“实质上相似”的含义。特别地，变体是一种同工型或等位基因，其与人类群体中最普遍的肽同工型的氨基酸序列相比具有氨基酸替代。优选地，这样的实质上相似的肽与最普遍的肽同工型具有至少80％、优选至少85％，更优选至少90％、最优选至少95％的序列相似性。实质上相似的还有降解产物，例如蛋白质水解降解产物，其还能够被诊断工具识别或者能够被抗各自的全长肽的配体识别。
术语“变体”还涉及翻译后被修饰的肽，例如被糖基化的肽。“变体”也可以是在样本收集后被修饰的肽，例如将一种标记共价或非共价地连接到肽上，特别是放射性标记或荧光标记。测量样本收集后被修饰的肽的水平被认为是测量原始未被修饰的肽的水平。
NT-proANP和NT-proBNP的特殊变体的例子以及测量它们的方法是已知的(Ala-Kopsala，M.，Magga，J.，Peuhkurinen，K.等人，(2004)分子异质性对循环中的A型和B型利钠肽的N-末端片段的测量有重大的影响.Clinical Chemistry，50(9)，1576-1588)。
术语“诊断”是本领域技术人员知晓的。诊断被认为是意识到任何的医学状况，特别是心脏病。诊断还涉及“鉴别诊断”，即区分具有相同或相似症状的不同状况。特别地，鉴别诊断包括将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来。在那种情形下，相同或相似症状是急性心脏代偿失调。
优选地，通过本发明的工具和方法获得的诊断信息由经过培训的医师来解释。优选地，对个体受试者的进一步处理的任何决定也是由经过培训的医师作出的。如果认为适当，医师将还会决定进一步的诊断策略。
按照本发明的术语“患者”优选是指患病的个体。患者可能具有未知的心血管疾病史。优选地，术语“患者”是指具有心机能不全症状的个体，更特别地是指具有心脏代偿失调的症状的个体。心机能不全或代偿失调的症状可能由心脏病或者急性心脏事件引起。
本发明广泛地涉及心脏病的诊断。术语“心脏病”是本领域技术人员知晓的。其是指任何种类的心脏功能紊乱，更特别地是指影响抽吸能力(pumping capability)的心脏功能紊乱，更特别地是指“急性心脏事件”和“慢性心脏病”。
心脏病患者是患有稳定型心绞痛(SAP)的个体以及患有冠状动脉综合症(ACS)的个体。ACS患者具有非稳定型心绞痛(UAP)或者这些个体已经患有心肌梗塞(MI)。MI是ST段抬高的MI或者非ST段抬高的MI。MI事件后会发生左心室功能紊乱(LVD)。结果，LVD患者会发生充血性心力衰竭(CHF)，死亡率约15％。按照本发明的心脏病还包括冠心病、心瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、扩张型心肌病、肥厚性心肌病以及心率缺陷(心率失常)。
本领域技术人员熟悉术语“急性”和“慢性”的含义。这两个术语具有相反的意思，即“急性”优选是指突然出现的状况或者暂时的严重状况或者会快速进入危险期的状况，而“慢性”优选是指缓慢发展的状况或者缓慢进行的状况或者根深蒂固的或长期持续的状况。然而，慢性状况在很长一段稳定期后或者缓慢行进后也会发展成急性状况。引起急性或慢性状况的原因可能不同，或者可能是类似的并且仅在程度或严重性方面存在差别。
在本发明的上下文中，“急性心脏事件”不同于“慢性心脏病”。这两个术语是本领域技术人员熟悉的。优选地，“急性心脏事件”是指心脏的一种急性状况、疾病或者功能障碍，尤其是急性心力衰竭，例如心肌梗塞或者心率失常。取决于MI的程度，接着会发生LVD和CHF。
优选地，“慢性心脏病”是心脏功能被弱化，其原因可能是由于发生例如心脏缺血，冠心病，或者先前的特别是轻度的心肌梗塞(可能随后会发生进行性LVD)。还可能是由于炎症性疾病、心瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、扩张型心肌病、肥厚性心肌病以及心率缺陷(心率失常)，以及慢性阻塞性肺病(COPD，该病影响肺气道，使得肺泡数量下降，并接着影响心脏)而导致的弱化。因此，显然慢性心脏病还包括患有急性冠状动脉综合症如MI，但此刻未发生急性心脏事件的患者。
从症状上看，心脏病会导致“心机能不全”。术语“心机能不全”是本领域技术人员熟悉的。优选地，心机能不全涉及心脏不能充分地循环血液，特别是在对氧的需求增加的条件下，例如在进行体育锻炼的过程中。心机能不全包括不能稳定地充分喷射血液(顺流不能(forward-fiailure))以及不能稳定地将静脉回流的血液充分地吸收到心脏中(回流不能(backward-iailure))。心机能不全可以按照组约心脏协会(NYHA)制定的用于心血管疾病的功能分类体系进行分级。心功能I级的患者没有明显的心血管疾病症状。机体活动未受到限制，并且通常的机体活动不会引起不适当的疲劳、心悸或者呼吸困难(呼吸短促)。心功能II级的患者的机体活动稍微受到限制。他们在休息时未感到不适，但是通常的机体活动会导致疲劳、心悸或者呼吸困难。心功能III级的患者的机体活动显著受到限制。他们在休息时未感到不适，但是还未进行到通常的机体活动时就会感到疲劳、心悸或者呼吸困难。心功能IV级的患者进行任何的机体活动都会感到不适。他们在休息时就表现出心机能不全的症状。进行任何的机体活动都会使不适程度加重。
心机能不全的另一指标为“左室射血分数”(left ventricular ejectionfraction)(LVEF)，其也被称作为“射血分数”。心脏健康的人的LVEF未受到损坏，其LVEF通常被描述为大于50％。大部分心脏收缩机能不良的人都表现出LVEF为40％或更低的症状。
术语“心脏代偿失调”是本领域技术人员熟悉的。“心脏代偿失调”通常是指最严重的心机能不全。在发生心脏代偿失调的过程中，心脏不能充分地使血液循环达到一定水平，此时机体的压力反应不能够弥补心脏抽吸能力的不足。心脏代偿失调的症状是本领域技术人员知晓的。特别地，具有“心脏代偿失调”症状的患者具有NYHA心功能II级、III级、IV级的症状或者更加严重。甚至更特别地，患者具有NYHA心功能IV级的症状或者更加严重。最特别地，患者需要临床支持来稳定或者维持血液循环。
术语所测定水平的“信息组合”是本领域技术人员容易理解的。一旦已经测量两种或多种本发明的生物标记的水平，对所测量的水平的信息进行评价。组合是指生物标记的信息优选地不是彼此独立地被评价，而是将信息整合成单个信息，优选为诊断信息。如前面指出，本发明的上下文中已经发现组合评价NT-proANP和NT-proBNP的水平能够提供比单独地评价单个标记更多的信息，甚至比所有标记加起来的信息还多。例如，在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在心脏病，特别是急性心脏事件。可以对所测量的水平进行数学运算或布尔运算来进行信息组合，例如通过计算测量水平之间的比例。优选地，在这种数学运算中还考虑绝对水平。因此，信息组合优选地涉及评价不止一种生物标记的测量水平。术语“评价”是本领域技术人员知晓的。优选地，评价被理解为判断、评估或者解释所测量的水平，更优选地为判断、评估或者解释特定的测量水平所指的内容。
术语“未升高的”、“升高的”、“略微升高的”或者“高度升高的”水平是指在患者中测量的生物标记的水平与指示不存在心脏病的已知水平相比较，特别是与不存在急性心脏事件或者慢性心脏病的水平相比较。
本领域技术人员能够确定已知水平(或者例如比例)，参见实施例1。例如，已知水平被确定为在一群未患有心脏病的个体中所测定的水平的中间值或平均值。评价其他个体或患者的水平，例如在群组研究中，将有助于精确确定已知水平或比率。类似地，还可能定义和/或精确确定指示存在急性心脏事件或慢性心脏病的参考水平(参见，如实施例1) 。
已知水平也可以作为“参考值”。本领域技术人员熟悉生物标记的参考值(或“正常值”)的概念。特别地，术语参考值可以是一个或多个对照样本的水平的实际数值，或者是来源于一个或多个对照样本的实际水平的数值。优选地，分析至少2位，更优选地至少5位，更优选地至少50位，更优选地至少100位，最优选地至少500位受试者的样本，来确定参考值。
在最简单的情形下，参考值与对照样本中的测量水平或者多个对照样本的测量水平的平均值相同。然而，还可以从不止一个对照样本中计算参考值。例如，参考值可以是代表对照情形(例如，健康状态、特定状况或者特定疾病状态)的对照样本水平的算术平均数。优选地，参考值是指存在于大部分具有可比性的对照样本(代表相同或相似基本状态的对照样本)的数值范围，例如，平均值±标准偏差的一倍或数倍。类似地，还可以通过其他统计学参数或方法来计算参考值，例如，存在于大部分对照样本中的某一水平的特定比例，例如比例为90％、95％、97.5％或99％。根据期望的灵敏度、特异性或统计显著性来选择特定的参考值(一般是灵敏度越高特异性越低，反之亦然)。可以按照本领域技术人员知晓和认为适当的统计方法来进行计算。
术语“对照”或者“对照样本”是本领域技术人员知晓的。优选地，“对照”是指为提供一种标准而实施的试验或者测试，根据该标准对试验结果(例如，患者的测量水平)进行评价。在本发明上下文中，标准优选是指与特定健康状态或者疾病状态相关的感兴趣的生物标记的水平。因此，“对照”优选是指用于提供这种标准的样本。例如，对照样本来源于一个或多个健康受试者，或者来源于一个或多个代表特定疾病状态的患者。在本发明的上下文中，代表特定疾病状态的患者特别地包括发生急性心脏事件或患有慢性心脏病的患者，更特别是存在急性心脏代偿失调的症状的患者。对照样本还可以是在早些时候来源于同一受试者或患者。
下文将进一步给出已知水平或比例的例子。进一步再精制这种水平或比例是可能的。在本说明书中给出的特定已知水平或比例可以作为诊断的指导。如本领域已知和广为接受的，对单个受试者的实际诊断优选由医师对个体进行分析来实施，例如根据个体受试者的体重、年龄、总体健康状况以及病史。
如已经提及的内容，急性心脏代偿失调的可能原因是急性事件或者先前慢性的心脏病急性代偿失调。然而，慢性心脏病患者还可能患有急性事件，例如，心脏功能由于先前的梗塞或者缺血已经受损的患者可能会突然患有额外的心肌梗塞。应当指出，正患有慢性心脏病，即使是轻微的急性心脏事件(例如轻微的心肌梗塞)的患者可能会引起急性心脏代偿失调。
因此，本发明的方法优选用于处理三组具有急性心脏代偿失调症状的患者(1)发生急性心脏事件的患者，(2)目前还发生急性心脏事件的慢性心脏病患者，以及(3)代谢失调严重的慢性心脏病患者。
在本发明的上下文中，发现具有由急性心脏事件引起的急性代偿失调的症状的患者(上面提及的组1)在入院时，其NT-proBNP水平未升高或者仅略微升高，但是NT-proANP水平高度升高。此外，在入院后的前12个小时中，该患者的NT-proANP水平迅速降低。
此外，在本发明的上下文中，发现患有慢性疾病并且目前还发生急性心脏事件的具有急性代偿失调症状的患者(上面提及的组2)在入院时，其NT-proBNP水平未升高或者仅略微升高，但是NT-proANP水平高度升高。此外，在入院后的前12个小时中，这个患者的NT-proANP水平迅速降低。该模式与在未患有慢性心脏病的患者(组1的患者)中观察到的模式极其相似。
此外，在本发明的上下文中，发现具有由慢性心脏病引起的急性代偿失调症状的患者(上面提及的组3)在入院时，其NT-proBNP和NT-proANP的值已经高度升高。在前24个小时中，这两个生物标记的水平的时间-进程几乎平行地发展。特别地，入院时，NT-proBNP值已经升到很高。此外，在入院后的第一天内，发生慢性心脏病时的NT-proANP和NT-proBNP的水平变化不如发生急性心脏事件时变化得大(参见实施例)。
根据本发明上下文中的发现，NT-proANP的测量水平取决于心脏病的严重程度心脏病越严重，NT-proANP的水平越高。此外，急性事件的结束与NT-proANP的下降相关。相反，NT-proBNP(主要)反映慢性心脏病，并且变化缓慢。测量水平不仅指示心脏病的存在与否(特别是急性心脏事件或慢性心脏病)，而且指示该疾病的程度或严重性。因此，测量水平反映患有较轻或者更严重的心脏病的患者之间的临床连续群。例如，极高水平的NT-proANP指示存在更严重的急性心脏事件。
目前还发生急性心脏事件的慢性疾病患者(上面提及的组2患者)的NT-proANP和NT-proBNP水平与组1患者(发生急性心脏事件，但是未患有慢性疾病)的水平相似。因此，本发明似乎可以诊断急性心脏事件，而不依赖于患者先前是否患有慢性心脏病。
特别地，即便按照主观时标，本发明已经被证明能够提供临床相关数据，即，时间起点为入院时，而不需要一个客观时标，例如从症状开始的时间推移。该情形十分接近实际的临床状况，在临床中，第一次测量是在入院时进行，而不是从症状开始后的特定时间进行。该时间是可变的，通常在症状开始的30分钟到24小时内，具有急性心源性代偿失调症状的患者被送到医生的面前，特别是被送到医院。
根据本发明，术语“NT-proBNP水平未升高”优选地对应于NT-proBNP的血浆水平低于125pg/ml，特别是低于76pg/ml，更特别是低于50pg/ml。
按照本发明，术语“NT-proBNP水平略微升高”优选对应于NT-proBNP的血浆水平为125-1000pg/ml，特别是125-900pg/ml，更特另地为125-750pg/ml。
按照本发明，术语“NT-proBNP水平高度升高”优选对应于NT-proBNP的血浆水平超过3000pg/ml。
按照本发明，术语“NT-proANP水平升高”优选对应于NT-proANP的血浆水平超过3000pg/ml，更特别地超过4000pg/ml，尤其特别地超过7000pg/ml，最特别地超过10000pg/ml。更优选水平可来自实施例2中描述的参考值区间的上限。
显然，来自NT-proANP和NT-proBNP的组合信息可以被差别地表示。例如，NT-proANP和NT-proBNP之间的关系表示成“比例”。通常，在具有急性心脏代偿失调症状的患者样本中，NT-proANP与NT-proBNP的测量比例越高，患者患有急性心脏事件的可能性更高(并且属于上面提及的组1或组2患者)。特别地，比例超过35，更特别地比例超过50，最特别地比例超过70，指示存在急性心脏事件。
一般认为，所提及的NT-proANP和NT-proBNP水平给本领域的技术人员提供最初的指导。根据在临床研究的临床实践中获得的其他数据来进一步再精制这些水平是本领域技术人员能力范围内的事。例如，可以根据患者的体重、年龄和性别进一步再精制该水平。例如，明显较老的健康受试者的NT-proANP或NT-proBNP水平通常高于明显较年轻的健康受试者(还可以参见实施例2)。本领域技术人员知晓定义合适水平的方法，包括对数据进行统计学分析。显然，本领域技术人员可以毫无困难地将对应于上述所定义的水平的摩尔浓度的计算为pg/ml(还可以参见实施例2)。
此外，本领域技术人员能够定义除了血浆之外的样本的相应水平。
从实施例中可以看出，在至少另一个时间点上测量NT-proANP和/或NT-proBNP的水平，将提供额外的诊断信息。例如，与仅在入院后的12小时或更久时测量NT-proANP相比，测量NT-proBNP将有助于避免低估心脏病的程度。因此，在较为优选的实施方式中，在至少另一个样本中测量NT-proANP和/或NT-proBNP的水平，优选地，该样本是在进行第一个测量后的很短的时间间隔内获取的。合适的时间可以是例如，在获取第一个样本后的2-12小时之内，优选4-12小时之内。
为了建立NT-proANP和/或NT-proBNP水平的时间-进程，可以更为频繁地进行取样和测量。该时间-进程提供额外的诊断信息。例如，测量NT-proBNP有助于监控疾病的进程或者治疗产生的影响。因此，本发明还涉及测量NT-proANP和NT-proBNP的时间-进程。优选地，按照短的时间间隔来确定时间-进程，例如每12个小时进行取样，优选每6小时，更优选每4小时，最优选每2小时进行取样。在症状开始后或者在患者入院后的时间内，例如在前4天、前3天或者前2天内，以短的时间间隔进行测量是特别优选的。
在另一个优选实施方式中，测量心脏病的其他诊断参数，特别地选自由(a)左室射血分数(LVEF)、(b)超声心动图、(c)既往病历(病史)，特别是涉及心绞痛的病历、(d)心电图、(e)甲状腺和肾脏功能的参数、(f)血压，特别是动脉高血压、(g)铊闪烁扫描图、(h)血管造影、(i)导管插入组成的组。
可以在测量NT-proANP和NT-proBNP之前、之后或者同时，确定这些额外的诊断参数。额外的诊断参数可以初步确定存在心脏病或者可以用于进一步评价特定的测量水平或比例的诊断相关度。
应当指出，心机能不良的症状与心脏病之外的其他疾病的症状类似。例如，呼吸困难和疲劳还可能由肺内陷、贫血、肥胖症、缺乏体育锻炼或者它们的组合引起。如早先已经指出，本发明的教导有助于避免与心脏病相关的假阴性诊断结果。此外，利用自动化系统可能在1小时之内测量NT-proANP和NT-proBNP。例如，使用ElecsysTM分析仪分析NT-proBNP的时间约为18分钟(Ruskoaho，H(2003)，上文已引用)。因此，心脏病的标准诊断方法例如心电图仪、心回波描记术或侵入性方法如冠状动脉血管造影或者血液动力学监控，本发明甚至更早地提供比这些标准诊断方法可靠且有价值的诊断信息。在取样后，例如血液样本，在实施其他诊断方法的同时可以分析NT-proANP和NT-proBNP。
因此，在另一个优选实施方式中，本发明涉及用于诊断具有急性心脏代偿失调的症状的患者中的心脏病的方法，其中在初次拜访医生(特别是心脏病专家)时或者发生症状后入院时测量NT-proANP和NT-proBNP。入院时间优选是指在症状开始后的24小时之内，更优选在12小时之内，甚至更加优选在30分钟之内。
术语“在入院时进行测量”是指在入院后的4小时之内、优选在2小时之内、更优选在1小时之内获取用于测量的样本。入院优选是指初次拜访医生(优选为心脏病专家)之时或者是指症状开始之后初次被医院或门诊部接收。优选地，是指初次被医院或门诊部接收，最优选是指被所述医院或门诊部的急诊室接收。“症状开始之后”优选是指急性心脏代偿失调症状的开始。可以在入院之前简单地进行采样，例如在当场进行紧急救助的过程中或者在患者正被转送到医生、门诊部或者医院的过程中。
可以平行地或者连续地测量NT-proANP和NT-proBNP(例如，可以在NT-proANP之前测量NT-proBNP，反之亦然)。优选地，同时进行测量。术语“平行地”在本文中是指使用同时获取的样本，优选地在相隔少于2小时内进行取样，更优选在相隔少于1小时内进行取样。最优选地，本文中的“平行地”是指使用同一样本。优选地，在相同时间内测量该肽在样本中的含量和浓度。
在另一个优选实施方式中，还对至少一种坏死的生物标记进行测量。本领域技术人员知晓坏死的生物标记，特别是心源性坏死的生物标记。这种标记指示存在心肌梗塞。坏死的生物标记的例子包括肌钙蛋白T、CK(肌氨酸激酶)、CK-MB(肌酸激酶同工酶MB)以及肌血球素。例如，本发明还涉及用于诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的心脏病、特别是急性心脏事件的方法，包括如下步骤(a)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proANP或其变体的水平；(b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP或其变体的水平；(c)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的坏死的生物标记或其变体的水平；(d)组合所测量的NT-proANP和NT-proBNP的水平的信息，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高以及坏死的生物标记的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在心脏病，特别是急性心脏事件。有利地，该实施方式使得可以在即使所测量的坏死的生物标记的水平(还)没有升高时进行心脏病的早期诊断，特别是急性心脏事件的早期诊断。
显然，前述方法类似地适合于本发明的所有其他实施方式。例如，在另一个优选实施方式中，本发明还涉及优选在体外使用所测量的NT-proANP、NT-proBNP和坏死的生物标记的水平的组合信息来诊断，优选早期诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的心脏病(特别是急性心脏事件和/或慢性心脏病)。
通过测量蛋白质(肽或多肽)或相应的转录本的浓度来确定生物化学标记或分子标记的水平。在本文中，术语“测量”优选是指定量或半定量地确定其水平。
通过测量肽或多肽的含量或浓度来测量水平。优选地，该水平被确定为特定样本中的浓度。出于本发明目的，测量绝对水平不是必需的。测量与合适对照的水平相比的相对水平是足够的。可以通过测量感兴趣的肽或多肽的特异性衍生物或片段来进行测量，例如，测量在核酸或蛋白质消化产物中包含的特异性片段。
按照本领域技术人员已知和认为适当的任何方法来测量核酸，特别是mRNA。
RNA测量方法的例子包括Northern杂交、RNA酶保护分析、原位杂交以及适体，例如葡聚糖凝胶结合的RNA配体(Srisawat，C，GoldsteinIJ.和Engelke，DR.(2001).葡聚糖凝胶结合的RNA配体从复合的RNA混合物中快速亲和纯化RNA.Nucleic Acids Research，第29卷第2期e4)。
此外，RNA可以被逆转录为cDNA。因此，测量DNA的方法也可用于RNA测量以及例如Southern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)(参见例如Cao，W.(2004)连接酶介导的扩增和检测的最新进展。Trends in Biotechnology，22(1)，38-44)、RT-PCR、实时RT-PCR、定量RT-PCR以及微阵列杂交(参见例如Frey，B.，Brehm，U.以及Kübler，G.等人，(2002).基因表达阵列用改进的感兴趣的扩增工具高灵敏度检测表达模式.Biochemica，第2卷，第27-29页)。
例如使用分子信标、肽核酸(PNA)或者锁定核酸(LNA)(参见例如Demidov，V.V.(2003).PNA和LNA有助于说明DNA(PNA and LNAthrow light on DNA).Trends in Biotechnology，21(1)，4-6)，可以在溶液中测量DNA和RNA。
用任何已知的用于测量目的肽或多肽的方法来测量蛋白质或蛋白质片段。本领域技术人员能够选择一种合适的方法。
本领域技术人员熟悉不同的测量肽或多肽的方法。术语“水平”是指样本中肽或多肽的含量或浓度。
可以直接或间接地进行测量。直接测量包括对分子应答、结合配体、标记或者酶促反应产物进行的测量。
可以按照任何本领域的已知方法进行测量，例如分子分析、酶促分析或者基于配体结合的分析。典型方法在下文中描述。
在一个实施方式中，测量感兴趣的肽或多肽的方法包括如下步骤 (a)将肽或多肽与合适的底物接触足够长的一段时间，(b)测量产物的含量。
在另一个实施方式中，测量感兴趣的肽或多肽的方法包括如下步骤(a)将肽或多肽与特异性结合配体接触，(b)(任选地)去除未被结合的配体，(c)测量被结合的配体的含量。
在另一个实施方式中，测量感兴趣的肽或多肽的方法包括如下步骤(a)(任选地)将样本的肽或多肽片断化，(b)(任选地)根据一种或多种生物化学特性或生物物理特性(例如根据与固体表面的结合程度或者在层析装置上的运行时间)分离肽或多肽或其片段，(c)确定所述肽、多肽或片段中的一种或多种的含量，(d)通过质谱分析确定步骤(c)中的肽、多肽或片段中的一种或多种的身份。质谱分析方法的综述见例如Richard D.Smith(2002).用于蛋白质组学的质谱分析仪器的趋势.Trends in Biotechnology，第20卷，第12期(Suppl.)，S3-S7)。
其他典型的测量方法包括测量特异性地结合目的肽或多肽的配体的含量。本发明中的结合包括共价结合以及非共价结合。
本发明的配体可以是结合目的肽或多肽的任何肽、多肽、核酸或其他物质。可以通过例如糖基化对从人或动物体获得或纯化的肽或多肽进行修饰，这是已知的。根据本发明的合适体还可以经由这种位点来结合肽或多肽。
优选地，配体应该特异性地结合将要测量的肽或多肽。本发明的“特异性的结合”是指该配体实质上不结合(“交叉反应”)所研究样本中存在的另一种肽、多肽或物质。优选地，被特异性结合的蛋白质或同工型应该以比任何其他相关肽或多肽高至少3倍、更优选至少1 0倍和甚至更优选至少50倍的亲和力被结合。
特别地，如果例如通过基于大小的分离(例如通过电泳)，或者基于其在样本中相对高的丰度，所研究的肽或多肽仍可以被明确地区分和测量，非特异性结合是容许的。
通过任何本领域的已知方法来测量配体的结合。优选地，该方法为半定量的或定量的。下文将描述合适的方法。
第一，可以直接测量配体的结合，例如通过NMR或表面等离子共振。
第二，如果该配体还作为目的肽或多肽的酶促活性底物，则测量酶促反应产物(例如通过测量被裂解底物的含量来测量蛋白酶的含量，例如通过Western印迹进行)。为了测量酶促反应产物，优选底物达到饱和的含量。反应前，还可以用可检测标记对底物进行标记。优选地，记样本与底物接触足够长的一段时间。足够长的一段时间是指生成可被检测的含量、优选可被测量的含量的产物所需的时间。测量出现特定(例如可检测的)含量的产物所需的时间，而不是对产物的含量进行测量。
第三，配体共价地或非共价地与标记结合，使得可以对配体进行检测和测量。通过直接或间接方法来进行标记。直接标记涉及将标记直接(共价地或非共价地)与配体结合。间接标记涉及将第二配体与第一个配体结合(共价地或非共价地)。第二配体应特异性地结合第一个配体。所述第二配体与合适的标记结合和/或所述第二配体是结合第二配体的第三配体的靶点(受体)。使用第二、第三或更高次序的配体通常是用于增加信号。合适的第二配体或更高次序的配体包括抗体、第二抗体以及熟知的链霉抗生物素-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。
还用一种或多种本领域已知的标记给配体或底物加“标签”。然后，这种标记作为更高次序的配体的靶点。合适的标记包括生物素、地高辛配基、His-Tag、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、A型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等等。当是一种肽或多肽时，该标记优选地位于N-末端和/或C-末端。
合适的标记是任何可以通过适当的检测方法检测的标记。典型的标记包括金颗粒、乳胶珠、吖啶酯、鲁米诺(luminol)、钌、酶促活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如磁珠”，包括顺磁性标记和超顺磁性标记)，以及荧光标记。
酶促活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶及其衍生物。适于检测的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基蓝四氮唑以及5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，作为从Roche Diagnostics获得的制成母液)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)、ECFTM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物结合会生成有色反应产物荧光的和化学发光的产物，可以用本领域的已知方法测量(例如使用感光底片或者合适的照相系统)。至于测量酶促反应，类似地应用上面给出的标准。
典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红(Texas Red)、荧光素以及亚力克斯染料(Alexa dye)(例如Alexa 568)。其他的荧光标记可以从例如Molcular Probes(俄勒冈州)获得。还包括使用量子点(quantum dot)作为荧光标记。
典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等等。放射性标记可以用任何已知和适当的方法检测，例如采用感光底片或者磷光成像仪检测。
本发明的合适测量方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发光)、RIA(放射性免疫沉淀)、ELISA(酶联免疫吸收分析)、夹心式酶免疫测试、电化学发光夹心式免疫测量(ECLIA)、解离增强的镧氟免疫测量(DELFIA)、闪烁亲近测定法(SPA)、比浊滴定、浊度分析、乳胶强化的比浊滴定或浊度分析、固相免疫测试，以及质谱分析，例如SELDI-TOF、MALDI-TOF或者毛细管电泳质谱分析(CE-MS)。可以单独使用本领域已知的其他方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹)，或者与进行标记或上述其他检测方法相组合。
此外，合适的方法包括基于微板ELISA的方法、全自动的或机器人免疫测量(可以在如ElecsysTM分析仪上实现)、CBA(酶促的钴结合分析，可以在如Roche-HitachiTM分析仪上实现)、以及乳胶胶结分析(可以在如Roche-HitachiTM分析仪上实现)。
优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽以及适体，例如核酸的或肽的适体。获得这种配体的方法是本领域熟知的。例如，可以由供应商鉴定和生产合适当的抗体或适体。本领域技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的这些配体的衍生物的方法。例如，往核酸、肽或多肽中引入随机突变。然后按照本领域知晓的筛选程序，例如噬菌体文库展示，来检测这些衍生物的结合能力。
用于此处的术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，例如Fv、Fab和F(ab)2片段，它们能够结合抗原或半抗原。
在另一个优选的实施方式中，配体被置于阵列上，这些配体优选选自由核酸、肽、多肽组成的组，更优选自由核酸、抗体或适体组成的组。
所述阵列含有至少一种额外的配体，该配体可以被指向一种感兴趣的肽、多肽或核酸。在本发明中，所述额外的配体还被指向不特别感兴趣的肽、多肽或核酸。优选地，至少3种、优选地至少5种，更优选地至少8种本发明上下文中的感兴趣的肽或多肽的配体被包含在阵列中。
配体在阵列上的结合可以通过任何已知的读出器或检测方法来检测，例如涉及光学的(例如荧光的)、电气化学的或者磁的信号或者表面等离子共振的方法。
按照本发明，术语“阵列”是指固相的或凝胶样的载体，在一维、二维或三维排列上，该载体上连接或结合了至少两种化合物。这种阵列(包括“基因芯片”、“蛋白质芯片”、抗体阵列等)通常是本领域技术人员知晓的，并且通常是在玻璃显微载物片上，特别是在被覆盖的玻璃片上，盖玻片和膜，所述玻璃片如覆盖了聚阳离子、硝化纤维或者生物素的载物片，所述膜如硝化纤维膜或尼龙膜制备的。阵列包括一种被结合的配体或者至少两种各自表达至少一种配体的细胞。
按照本发明，还考虑使用“悬浮阵列”作为阵列(Nolan JP，Sklar LA.(2002)。悬浮阵列技术平面阵列模式的演变.Trends Biotechnol.20(1)9-12)。在这种悬浮阵列中，载体存在于悬浮液中，所述载体如微珠或者微球体。该阵列由携带有不同配体的各种微珠或者微球体组成，这些微珠或者微球体可能被标记了。
本发明还涉及制备如上定义的阵列的方法，其中除了其他配体外，至少还有一个配体被结合到载体上。
制备这种阵列的方法是公知的(US 5,744,305)，例如基于固相化学或者光不稳定保护基团的方法。这种阵列还与物质或者物质的文库接触，并检测它们的相互作用，例如检测结合的程度或者构象的变化。因此，包含如上定义的肽或多肽的阵列可用于鉴定特异性地结合所述肽或多肽的配体。
可以在组织、细胞和体液样本中测量肽和多肽(蛋白质)，即优选地在体外进行测量。优选地，在体液样本中测量感兴趣的肽或多肽。
本发明的组织样本是指从死亡或者活的人体或动物体中获得的任何种类的组织。可用任何本领域技术人员知晓的方法，例如通过活组织检查或者刮除术来获取组织样本。
本发明的体液包括血液、血清、血浆、淋巴、脑液、唾液、玻璃状液和尿。特别地，体液包括血液、血清、血浆和尿。体液样本通过任何本领域知晓的方法来获得。
一些样本，如尿液，可能仅含有感兴趣的肽或多肽的降解产物，特别是片段。然而，如上指出，只要该片段对于感兴趣的肽或多肽来说是特异性的，在测量水平还是有可能的。
如果需要，在测量前对样本作进一步的处理。例如，按照本领域知晓的方法，包括过滤、离心或者提取方法，如氯仿/酚提取，来从样本中纯化核酸、肽或多肽。
此外，还考虑使用被称作为床边检测装置或者芯片上的实验室装置来获取样本，并测量感兴趣的肽或多肽。这种装置可以被设计成与血糖测量所用的装置类似。因此，患者能够获得样本并测量感兴趣的肽或多肽，而不需要经过培训的医生或护士的直接帮助。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及一种试剂盒，其包括(a)用于测量来自患者的样本中的NT-proANP水平的工具或装置，和(b)用于测量来自患者的样本中的NT-proBNP水平的工具或装置。优选地，(a)的工具是特异性地结合NT-proANP的配体，和/或(b)的工具是特异性地结合NT-proBNP的配体。此外，试剂盒包括一种用于测量患者样本中的坏死的生物标记的水平的工具或装置，特别是一种特异性结合的配体。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及这种试剂盒用于体外诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的急性心脏事件的用途，特别是用于将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及特异性地结合NT-proANP的配体和/或特异性地结合NT-proBNP的配体用于加工诊断试剂盒的用途，特别是早期诊断，该试剂盒用于诊断具有急性心脏代偿失调的症状的患者中的心脏病(例如急性心脏事件或慢性心脏病)，特别是用于将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来。此外，特异性地结合坏死的生物标记的配体可用于加工这种试剂盒。
本发明还涉及治疗心脏病的方法。一旦患者被确诊，就会对后续的治疗产生影响。如果本发明的方法指示患者患有心脏病，那么就会开始治疗或者对治疗作出调整。在一定时间间隔内，对受试者的NT-proANP和NT-proBNP的水平和/或比例进行监控。在该监控期内，本发明还能够检测心脏病，特别是急性心脏事件。此外，通过熟练的心脏病专家知晓的方法作进一步诊断来加强对受试者的研究，这些方法如本说明书前面所述，例如心电图仪或心回波描记术。治疗包括任何通常与改进或恢复心脏功能相关的措施。例如，停止使用非类固醇类的抗炎药(例如Cox-2抑制剂或者选择性的Cox-2抑制剂例如塞来昔布(celecoxib)或罗非昔布(rofecoxib)的治疗或者降低这种药物的给药剂量。其他的可能措施是限制食盐的摄取、定期的适度锻炼、进行流感免疫和肺炎球菌的免疫、外科手术治疗(例如血管再形成术、气囊扩张术、安装支架、搭桥外科手术)，给予药物例如利尿剂(包括共同给予不止一种利尿剂)、ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂、β-肾上腺素阻断剂、醛固酮拮抗剂、钙离子拮抗剂(例如钙离子通道阻断剂)、血管紧张素受体阻断剂、洋地黄以及任何本领域技术人员知晓和认为是适当的其他措施。
急性心脏事件的治疗区别于慢性心脏病的治疗。如果本发明的方法指示存在急性心脏事件，那么治疗集中在施用环状利尿剂(例如利尿磺胺、速尿(turosemide)或利尿酸)、儿茶酚胺以及及早实施血管再形成术。
如果本发明的方法指示存在慢性心脏病，而没有发生额外的急性心脏事件，那么治疗更适合集中在辅助循环，例如心肺机或者气囊导管插入术。
在McMurray，J.J.V.和Pfeffer，M.A.(2005).Heart failure.Lancet第365卷，1877-89，特别参见1879-1885)中描述了本领域技术人员可以获得的其他治疗选择。
更特别地，在另一个实施方式中，本发明涉及用于决定患者心脏病的可能治疗方案的方法，其中患者具有急性心脏代偿失调的症状，该方法包括如下步骤(a)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proANP或其变体的水平，(b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP或其变体的水平，(c)将NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的信息进行组合，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，或者其中在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在慢性心脏病，(d)任选地由心脏病专家开始对患者进行检查，(e)推荐开始治疗或者避免进行治疗，任选地考虑心脏病专家对患者的诊断结果。
优选地，如果该方法指示存在心脏病，则推荐开始由心脏病专家开始检查和/或开始进行治疗。该方法涉及本说明书前面提及的所有疾病和状况，特别是开始处理急性心脏事件或慢性心脏病。优选地，如果步骤(c)中的评价指示存在急性心脏事件或心脏病，则开始或推荐对急性心脏事件或慢性心脏病进行治疗。显然，这些方法可以根据本说明书中提及的本发明的所有实施方式或优选方面进行调整。
实施例 实施例1 本实验的研究群体由在前24小时内由缺血和非缺血引起的急性代偿失调性心力衰竭的患者组成。根据下文描述的欧洲心脏病专家协会指南对代偿失调性心力衰竭和心源性休克进行诊断，由不知晓生物标记的血浆水平的专家进行评价。所有患者具有由缺血或非缺血引起的心力衰竭迹象。在随机分组之前，所有患者接受利尿剂或者减轻心绞痛的治疗。本实验的关键终点是在随后的30天内的死亡率。地方道德委员会允许进行该实验，并且从所有的参加受试者或其亲属获得书面同意意见。
生物化学分析 在114位参与该实验的患者中，用于确定心源性标记的血浆样本是在基线(n＝117)、12小时(n＝105)、24小时(n＝103)和48小时(n＝102)时收集的。在Elecsys 2010分析仪(测量范围为5-35000pg/mL；在474pg/mL的平均值时的内部分析变异系数为0.9％，在8005pg/mL的平均值时为1.1％，和在13682pg/mL的平均值时为0.9％)上，用化学发光免疫测量试剂盒(Roche Diagnostics)测量NT-proBNP。分析前，将所有样本在-80℃下储存，在仅经过单个解冻循环的样本中进行生物标记的测量。
生物化学分析按如下进行解冻后，用磁性固相技术通过竞争性结合放射性免疫测量分析血浆中的NT-proANP，该固相技术是对Sundsfjord等人(Sundsfjord，J.A.，Thibault，G.，Larochelle，P.和Cantin，M.(1988)人体内的前心房钠尿因子N-末端片段的鉴定和血浆浓度.J.Clin Endocrinol Metab 1988，第66卷，(605-610)的方法的改进，使用相同的购自半岛实验室(Bachem，St.Helene，UK)的抗大鼠proANP多克隆血清、人proANP(1-30)作为标准，使HPLC纯化的proANP(1-30)碘化，作为放射性标记。为了达到高灵敏度和精确度，用携带绵羊抗兔IgG的Dynabeads M280(Dynal Biotech，奥斯陆，挪威)作为固相，并使用第二抗体。内部分析的变异系数≤7.5％。
结果 下面的表2-5给出了属于一组上述患者的数据。
表2在急性心脏事件患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。数据对应于入院时获得的样本以及入院后的1/2天和1天时获得的样本。
缩写Adm.，入院时间；n，未检测到 患者的其他数据 第005号和第019号患者的NT-proBNP数值要么相当正常(第019号患者)，要么低于125pg/ml的截断值。在入院时，这两名患者的肌钙蛋白T水平也是正常的。这些数值表明这两名患者未患心脏病。事实上，这两名患者都患有严重的急性心脏事件，对于第019号患者来说，甚至会引起死亡。然而，这两名患者在入院时的NT-proANP水平都升高了，根据本发明的教导，这已经指示存在急性心脏事件。
表2a在患有急性心脏事件的其他患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。数据对应于入院时获得的样本以及入院后的1/2天和1天时获得的样本。
缩写Adm.，入院时间；n，未检测到 表3在目前患有额外的急性心脏事件的慢性心脏病患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。
患者的其他数据 表3a在目前患有额外的急性心脏事件的其他慢性心脏病患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。
表4在患有慢性心脏病患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。
缩写COPD，慢性阻塞性肺病；PCI，经皮的冠状动脉内介入 患者的其他数据 表4a在患有慢性心脏病的其他患者中观察到的NT-proANP、NT-proBNP和肌钙蛋白T的水平。
为了更好地进行全面评述，确定表2、3和4中的患者的测量水平的算术平均数，并列于下面的表5中。
表5表2、3和4中的测量水平的算术平均数。
adm.入院时间 实施例2 用RIA方法测量NT-proBNP使用磁性固相技术的竞争性结合放射性免疫测量(前文引用的Sundsfjord等人的方法的改进)。
测量范围，未稀释的60-10000pmol/L 功能性灵敏度100pmol/L(等于350pg/ml) 1pmol/L NT-proANP对应于3.506pg/ml NT-proANP 表6NT-proANP的参考区间的上限 表6中的数值描述了在97.5％的表观正常的受试者中观察到的NT-proANP值的上限。然而，根据经验，该范围中还包括一些患有心脏病的患者。
实施例3 让疑似患有冠心病的患者经受物理压力或者由药物(双嘧达莫(dipyridamole)，一种血管扩张剂)引发的人工心脏压力。在冠心病患者中，压力会导致疼痛和/或使心电图发生变化。在本研究中，还通过铊闪烁扫描图对患者进行分析。铊闪烁扫描图能够识别疼痛是否引起缺血。按照检测不到缺血、持久的缺血或者可逆的缺血对结果进行分组。如表8所示，未发生缺血的受试者的NT-proBNP和NT-proANP水平显著较低。
表8经受上述心脏压力的患者中的NT-proBNP和NT-proANP以及肌钙蛋白T的水平(和比例)。在施加张力之前以及施加张力的20分钟和4小时后获取样本。
此外，未发生缺血的患者中的NT-proANP的水平与NT-proBNP的水平的比例显著高于发生缺血的患者。
在上述测试中，发生缺血的患者由于早期心脏受损而损害了其心脏功能。在铊闪烁扫描图中未发生缺血的患者不具有显著的动脉硬化，因此其心脏功能通常未显著地受损。
特别地，上述数据表明，与具有急性心脏代偿失调症状的患者由于急性心脏事件或慢性心脏病而观察到NT-proANP和NT-proBNP升高相比(例如与急性心肌梗塞和严重的心率缺陷相比)，缺血不足以引起NT-proANP和NT-proBNP快速而急剧地升高。
实旋例4 如下数据显示慢性心力衰竭患者和急性心肌梗塞患者中的NT-proANP和NT-proBNP的时间-进程。数据表明，在急性心肌梗塞患者中，观察到NT-proBNP与NT-proANP的值具有明显的逆向时间-进程。
表9 实施例5 急性冠状动脉综合症(ACS) 总共研究了19位患有急性冠状动脉综合症并且最近发生急性心脏事件的患者，在零时(在胸部疼痛开始后的2小时内)、4小时和有时在晚些时候采集血液样本。起初所有患者中的肌钙蛋白T值是阴性的。4小时的时候，有12位患者具有可检测水平的肌钙蛋白T(参见表11)。
基于他们的症状以及ECG的形状，对所有患者实施血管造影。大部分患者不得不被植入支架(参见表11)。
在零时和3-4小时后，测量NT-proBNP(在某些患者中，还在1小时和2小时时进行测量)。在一组患者中，无论是肌钙蛋白T阴性或肌钙蛋白T阳性组，其NT-proANP都升高了。
NT-proANP升高与NT-proBNP升高相关。相反，如果NT-proANP水平下降或者保持不变，那么NT-proBNP水平保持不变或者仅略微升高(参见表10)。
可以得出如下结论当发生ACS时，NT-proANP水平发生显著变化，而NT-proBNP的变化是相当地较不明显的。此外，NT-proANP和NT-proBNP的水平很大程度上与肌钙蛋白T的水平无关。显然，不仅肌钙蛋白T阳性患者需要治疗性干涉，而且肌钙蛋白T阴性的患者也需要。后一事实说明了或者是独立地测量或者除了测量肌钙蛋白T水平之外，还进行NT-proANP和/或NT-proBNP测量的优点。
表10 在入院时进行的临床观察过程中，还没有出现能够明确地诊断急性冠状动脉综合症的ECG变化或者症状的确切信号。随后进行最终诊断并列在如下表中。
表11文中提及的19位患者的数据，样本号中的第一个数字指示患者的编号。在列“裂解”、“PCTA”、“支架”中，数字0、1和2表示血栓是否必须被裂解，是否必须进行PTCA(经皮透腔冠状动脉血管成形术)或者随后是否需要植入支架，以及需要多少次。
Neg，阴性；Pos，阳性；PCTA，经皮透腔冠状动脉血管成形术；LDL，较低的检测限定，NSTEMI，ST段未抬高的心肌梗塞，STEMI，ST段抬高的心肌梗塞；UAP，非稳定性心绞痛。
诊断结果和随后的介入治疗表明即使肌钙蛋白T的起始水平为阴性的患者也患有需要治疗的心脏异常。特别地，至少在某些后来被诊断为患有非稳定性心绞痛(UAP)的患者已经存在血栓，即使该血栓还不能被检测到。
权利要求
1.用于诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的心脏病的方法，包括如下步骤
a)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proANP或其变体的水平，
b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP或其变体的水平，
c)将NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的信息进行组合，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，或者其中在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在慢性心脏病。
2.根据权利要求1的方法，其中该方法用于将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来。
3.根据权利要求1-2中任意一项的方法，其中根据步骤c)，在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，并且在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在慢性心脏病。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中平行地进行NT-proANP和NT-proBNP的测量。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中样本是血液样本，优选为血浆或血清。
6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中测量是在入院后的4小时内或者在急性心脏代偿失调症状开始后24小时内进行的。
7.根据权利要求1-6中任何一项的方法，其中NT-proANP的水平升高对应于血浆水平超过3000pg/ml，特别是超过4000pg/ml，更特另超过7000pg/ml。
8.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其中NT-proBNP水平略微升高对应于血浆水平低于1000pg/ml。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中NT-proBNP的水平未升高对应于血浆水平低于125pg/ml。
10.根据权利要求1-9中任何一项的方法，其中NT-proBNP水平高度升高对应于水平超过3000pg/ml。
11.根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中在至少另外一个样本中测量NT-proANP和/或NT-proBNP的水平。
12.根据权利要求11的方法，其中建立NT-proANP和/或NT-proBNP的时间-进程。
13.根据权利要求1-12中任何一项的方法，其中NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的组合信息被表示成比例。
14.根据权利要求1-13中任何一项的方法，其中额外地测量至少一个坏死的生物标记，该生物标记优选地选自由肌钙蛋白T、CK、CK-MB和肌球素组成的组。
15.根据权利要求1-14中任何一项的方法，其中测量心脏病的另外的诊断参数，该诊断参数特别地选自由如下组成的组
a)左室射血分数，
b)超声心动图，
c)既往病历，特别是涉及心绞痛，
d)心电图，
e)甲状腺和肾脏功能的参数，
f)血压，特别是动脉高血压，
g)铊闪烁扫描图，
h)血管造影，
i)导管插入。
16.试剂盒用于体外诊断心脏病，特别是用于将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来的用途，该试剂盒包括(a)用于测量来自患者样本中的NT-proANP或其变体的水平的工具或装置，和(b)用于测量来自患者样本中的NT-proBNP或其变体的水平的工具或装置。
17.特异性地结合NT-proANP或其变体的配体和特异性地结合NT-proBNP或其变体的配体在生产诊断试剂盒中的用途，该试剂盒用于诊断具有急性心脏代偿失调症状的患者中的心脏病，特别是用于将急性心脏事件与慢性心脏病区分开来。
18.用于决定患者心脏病的可能治疗方案的方法，其中该患者具有急性心脏代偿失调症状，该方法包括如下步骤
a)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proANP或其变体的水平，
b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP或其变体的水平，
c)将NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的信息进行组合，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，或者其中在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP水平升高指示存在慢性心脏病，
d)任选地由心脏病专家开始对患者进行检查，
e)如果根据步骤c)的评价表明存在心脏病，则推荐开始治疗。
全文摘要
本发明涉及在具有急性心脏代偿失调症状的患者中诊断心脏病，特别是急性心脏事件的方法，包括如下步骤(a)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proBNP(N-末端脑利钠肽)或其变体的水平，(b)测量，优选在体外测量来自患者的样本中的NT-proANP(N-末端心房利钠肽)或其变体的水平，(c)将NT-proANP和NT-proBNP的测量水平的信息进行组合，其中在NT-proBNP的水平未升高或者略微升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在急性心脏事件，或者在NT-proBNP的水平高度升高的情况下，NT-proANP的水平升高指示存在慢性心脏病。本发明还可以将急性心脏事件与慢性心脏病的代偿失调区分开。本发明还涉及相应试剂盒的用途以及治疗心脏病的方法。
文档编号G01N33/68GK101194167SQ200680020460
公开日2008年6月4日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者G·赫斯, A·霍施 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司