在类风湿性关节炎的诊断中的抗ccp和抗核抗体的制作方法

专利名称：在类风湿性关节炎的诊断中的抗ccp和抗核抗体的制作方法
在类风湿性关节炎的诊断中的抗CCP和抗核抗体本发明涉及帮助评估类风湿性关节炎的方法。该方法特别地用于体 外的类风湿性关节炎的差异诊断。例如，该方法通过分析生物化学标记物来实践，包括测量样品中抗CCP的浓度和抗核抗体(ANA)的浓度、 将测定的浓度与类风湿性关节炎的诊断相关联。为了进一步改善本发明 的方法中RA的评估，可以与抗CCP和ANA—同测定一种或多种其4也 标记物的水平，并与RA的不存在或存在相关联。本发明还涉及包含抗 CCP和ANA的标记物组(panel)在类风湿性关节炎的诊断中的用途， 它教导了用于进行本发明的方法的试剂盒。类风湿性关节炎("RA")是慢性的、炎症性的、系统性疾病，它 在受影响的关节中、特别是手和脚的关节中产生其最显著的表现。类风 湿性关节炎的发作可以緩慢地发生，从数周到数月，或者状况可以以急 性的方式快速地表现。RA具有世界范围的分布，并涉及所有的人种群体。虽然该疾病可 以在任何年龄发生，发病率随着年龄而提高，顶峰发生率在四十和六十 岁之间。北美洲群体的发病率估计从0.3%到1.5%。今天，仅在美国有 超过2,500,000名个体被诊断患有类风湿性关节炎， 一些统计表明650 到800万人潜在地受到该疾病的困扰。女性通常受影响比男性大2-3倍。类风湿性关节炎的早期症状主要是关节特异性的，例如关节肿胀或 触痛的疼痛关节，但也可以包括稍微非特异性的表现，如僵硬、发烧、 皮下结节和疲劳。非常特征性的是关节的对称性牵连。手、足、膝盖和 腕部的关节是最常受影响的，最后牵连髋部、肘部和肩。随着疾病的进 展，任何类型的动作变得非常疼痛和困难，最终引起所涉及的关节的功 能丧失。类风湿性关节炎的更严重的病情可以引起强烈的疼痛和关节破 坏。每年进行了约300,000例骨和关节置换以努力减轻关节炎相关的关 节破坏产生的疼痛和活动能力丧失。分类RA的最广泛使用的系统是关于RA分类法的American College of Rheumatology 1987修正的指标(Arnett, F.C., et al., Arthritis Rheum. 31 (1988 ) 315-324 )。根据这些指标(称为ARA指标)，如果患者满足 以下七个指标中的至少四个，患者被称为患有RA,其中指标1-4必需存在至少六周l)早晨僵硬至少一小时，2)三个或更多关节区域的关节炎，3)手关节的关节炎，4)对称性的关节炎，5)类风湿结节，6) 血清类风湿因子("RF"),和7)放射照相的改变。这些指标具有大 约90%的敏感性和特异性。公认的(参见产生ARA指标)和帮助RA诊断的唯一的生物化学 标记物是血清中检测的类风湿因子(RF)。RA中的组织学改变不是疾病特异性的，而主要取决于所涉及的器 官。初始的炎症性关节病变涉及滑膜。最早期的改变是滑液微脉管系统 的损伤，具有腔的闭塞、内皮细胞的肿胀、内皮细胞间的缺口，如通过 电子显微镜检查所记录的。这个阶段通常与浅表内衬细胞层的轻微增殖 相关。两种细胞类型构成了滑液内衬骨髓衍生的A型滑膜细胞，其具 有巨噬细胞特征，以及间质B型滑膜细胞。两种细胞类型都促进滑液增 生，暗示了这两种细胞类型之间旁泌性相互作用。炎症的这个阶段与充 血、水肿和血纤蛋白渗出相关。在早期疾病中发生细胞浸润，起初主要 由T淋巴细胞构成。作为炎症的结果，滑膜变得过度生长，来自血管和 滑液成纤维细胞的增殖以及来自滑液内衬层的增殖和扩大。肉芽组织延伸到软骨， 一皮称为血管翳。该组织主动地4曼入和石皮坏滑 膜和骨之间的边缘处的骨和软骨，称为侵蚀性RA。RA的关节表现可以分为两种类别涉及炎症性滑膜炎的可逆的体 征和症状，以及由滑膜炎引起的不可逆的结构损坏。这个概念不仅对于 疾病分期和确定预后是有用的，而且对于选择医学或外科治疗是有用 的。典型的患者中的结构损坏通常在疾病的笫 一 和第二年之间的某个 时间开始(Van der Heijde, D. M., Br. J. Rheumatol. 34 ( 1995 ) 74-78 )。虽然滑膜炎倾向于跟随涨落模式，结构损坏作为先前的滑膜炎的数量的 线性函数发展。RA中的早期事件的病因学仍然是不确定的。自体免疫组成是当今 广泛接受的，但其他因素仍有争论。已经大力地探求了细菌或病毒感染 的可能性。通过分离、电子显微镜检查或分子生物学来将传染原与RA 关联的所有努力都失败了。可能的是，不存在单个的RA的主要原因， 不同的机制可能引起初始的组织损伤并促成滑膜炎症。滑膜炎的临床病征可能是微妙的，通常是主观的。温热、肿胀、明显发炎的关节通常仅在炎症性滑膜炎的最为活动的阶段见到。软骨损失 和关节周骨骼的侵蚀是结构损坏的特征。与结构损坏相关的临床特征由 功能上和解剖学上渐进性的退化标记。关节的结构损坏是不可逆的和累 加性的。对类风湿性关节炎的有效治疗一般包括药物医疗、运动、休息和适 当的关节保护治疗的组合。对特定患者的治疗取决于疾病的严重度和所 涉及的关节。非甾族抗炎药物、皮质类固醇、金盐、氨曱蝶呤和全身性 免疫抑制剂被广泛使用来降低炎症和关节破坏。然而，就毒性和对潜在 致命状况的易感性而言，类固醇和免疫抑制剂的使用具有显著的风险和 副作用。近来，基于"生物制剂"的治疗剂已经用于RA治疗。这些治疗剂，例如，是显著降低炎症的针对TNF-a的可溶受体或抗体。虽然 非常有前景，生物制剂由于高成本仍然处于有限的使用中。来自纵向的临床和流行病学研究的数据提供了治疗的指导原则。这 些研究强调1 )早期诊断的必要性，2)预后因素的鉴定，和3)早期的 进取性治疗。较早的诊断和治疗，优选的在症状发作后前几个月内，可 以帮助防止不可逆的关节损伤。然而， 一个大的问题是类风湿性关节炎和其他风湿疾病，如系统性 红斑狼疮(SLE)和混合的结締组织病(MCTD)不容易相互区分。必 需进行疾病史、临床症状、X-射线和其他医学4全查与生物标志物的测量 一起的冗长的评估以确定明确的诊断结论，例如RA的诊断结论。最后， 医师将会把诊断结论建立在他得到的所有指标的组合之上。对于任何生 物标记物或生物标记物的任何组合，总是临床医师来最后确定诊断结 论。但是生物标记物;故认为在确定例如RA诊断结论的过程中具有重要 的帮助。因此，对于帮助评估类风湿性关节炎的方法、特别是基于生化参数 的方法，存在着需求。本发明提供了这样的方法和试剂，用于体外评估 类风湿性关节炎的不存在或存在。本发明涉及通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎的方法， 包括测量样品中抗CCP和抗核抗体的浓度、并将测定的浓度与类风湿性 关节炎的不存在或存在相关联。本发明还涉及至少包含抗CCP和抗核抗体的标记物组在RA的诊断 中的用途。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，它至少包含 分别特异性地测量抗CCP和抗核抗体所需的试剂，以及进行所述测量所 需的辅助试剂。在第一优选的实施方式中，本发明涉及通过生物化学标记物体外评 估类风湿性关节炎的方法，包括测量样品中抗CCP和抗核抗体的浓度， 并将测定的浓度与类风湿性关节炎的诊断结论相关联。优选地，这种标记物组合被用于确定RA的存在。如在此使用的，在本节中，以下每一个术语具有与之相关的含义。 在此使用的冠词"一个"和"一种"是指冠词的一个或超过一个(即， 至少一个)语法上的目标。举例来说，"一个标记物"是指一个标记物 或超过一个标记物。在此使用的术语"标记物"或"生物化学标记物"是指用作目标用 于分析患者测试样品的分子。这些分子目标的实例是样品中存在的蛋白 或多肽本身以及抗体。用作本发明中的标记物的蛋白或多肽预期包括所 述蛋白的任何变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学可检 测的片段。本领域的技术人员将认识到，例如，在炎症期间由细胞释放 或存在于变得损坏的细胞外基质中的蛋白质可以被降解或裂解成这样 的片段。某些标记物以无活性的形式合成，其随后可以通过蛋白水解作 用活化。熟练技术人员将理解，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分 存在。这种复合物也可以用作本发明意义上的标记物。标记物多肽的变体由相同的基因编码，但在它们的PI或MW,或两者上(例如，作为 选择性mRNA或前mRNA加工的结果，例如选择性剪接或限制的蛋白 水解)不同，此外地或可选^^地，可以来自不同的翻译后修饰(例如， 糖基化、酰化和/或-粦酸化)。根据本发明如上指出的术语标记物还涉及样品中存在的抗体。在 RA的情况下，这些抗体是自体抗体，即，在患者样品中、结合患者自 己的细胞中存在的抗原或患者自己的细胞产生的抗原的抗体。在此使用的术语"样品"是指为了体外评估的目的获得的生物样品。 在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包含任何体液。优选的 测试样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液和滑液。优选的样品是全 血、血清、血浆或滑液，血浆或血清是最优选的。熟练技术人员将理解，任何这样的诊断结论是在体外进行的。患者样品后来被丟弃。患者样品仅仅用于本发明的体外诊断方法，患者样品 的材料不转移回患者体内。
一般地，样品是液体样品。术语"评估类风湿性关节炎"被用于表明，根据本发明的方法将(与其他变量一同，例如，ARA(参见上文)阐述的指标)帮助医师确定他 的RA诊断结论。熟练的技术人员将理解，对于给定疾病，没有生物化 学标记物是具有100%特异性并同时100%敏感性的诊断性的，而生物化 学标记物被用于以一定可能性或预测价值来评估疾病的存在或不存在。 优选地，根据本发明的方法帮助评估RA的存在。熟练的技术人员将理解，将标记物水平与RA的存在或不存在相关 联的步骤可以以不同的途径进行和实现。 一般地，选择参考群体，确定 正常的范围。这仅仅是常规实验，使用合适的参考群体来确定抗CCP 以及抗核抗体的正常范围。普遍接受的是，达到某些但有限程度的正常 范围取决于建立该范围的参考群体。理想的参考群体在数量上是高的， 例如，数百到数千，并且对于年龄、性别和任选地其他感兴趣的变量是 匹配的。对于绝对值如给定的浓度而言的正常范围还取决于所采用的分 析和在进行该分析中使用的标准。抗CCP和抗核抗体的水平可以使用实施例小节中给出的分析步骤 来测量和确定。要理解的是，不同的分析可以产生不同的截止值。瓜氨酸化的肽是在患有RA的患者的血清中发现的相当重要的自体 抗体的抗原。过去几年间几组研究人员密集地研究了它们(参见，例如， WO 98/08946、 WO 98/22503、 WO 99/28344、 WO 99/35167、 WO 01/46222 和WO 03/050542 )。近来，Schellekens和同事(Schellekens, G. A. et al., Arthritis Rheum. 43 ( 2000 ) 155-163 )报道了，与使用线性肽的相同分 析相比，对于RA的诊断准确性，基于特定的环形瓜氨酸化肽(CCP) 的ELISA测试显示了优越的性能特征。针对CCP的自体抗体，即，最可能与患者血清中循环的瓜氨酸化多 肽反应的、以及在体外分析中结合CCP的抗体被称为"抗CCP" 。 van Venrqji等的专利申请(WO 98/22503 )描述了某些瓜氨酸化肽，显示了 环化导致相应肽的改善的反应性。在特定的实例中，显示了，如果其中 X代表瓜氨酸的通式HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS ( SEQ ID NO: 1 ) 的肽通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键被环化，则与相应线性肽的 36%相比，敏感性提高到63%。由于患者血清中的自体抗体对不同的环肽具有稍微不同的反应性，在WO 98/22503中建议了肽的组合来进一步 改善分析。在优选的实施方式中，如van Venroij等在WO 03/050542中描述的 方式测量抗CCP。简言之，含有通式X-G和X-非G的表位位点的肽的 组合被用于评估样品中抗CCP抗体(抗CCP )的水平，其中X代表瓜 氨酸，G代表甘氨酸，非G代表任何氨基酸H、 I、 W、 S、 R、 K、 Y、 M、 F、 V、 P、 Cit或其类似物。在WO 03/050542中7^开了在这样的评 估中有用的特定的肽。熟练的技术人员将容易理解，关于在测量抗CCP 的分析中使用的环状瓜氨酸化肽的进一步完善和改进是可能的，例如， 其将产生环状瓜氨酸化肽序列的改变的序列。然而，这些修饰将不背离 本发明的精神。在血清学分析中测量与CCP结合的抗体，即，抗CCP。优选地， 这种分析通过使用 一种或多种CCP作为抗原、通过适当手段检测包含在 样品中的抗CCP抗体与CCP抗原的结合来建立。优选的检测手段是特异性结合分析，特別是免疫分析。免疫分析是 熟练的技术人员公知的。进行这样的分析的方法以及实际应用和操作被概述在相关的教科书中。相关教科书的实例有Tijssen, P., In: Practice and theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds. ), Elsevier, Amsterdam( 1990 ), pp. 221-278, and various volumes of Colowick, S.P. and Caplan, N.O.( eds. )， Methods in Enzymology, Academic Press,关于免疫学检测方法，特别是第70、 73、 74、 84、 92和121巻。抗CCP抗体可以通过同质的分析形式，例如，通过包被CCP的胶 乳粒子的凝集来检测。优选地，使用异质的免疫分析来测量抗CCP。这种异质的测量基于 直接或间接地包被CCP到固相上、在允许抗CCP抗体与CCP结合的条 件下孵育所述固相与已知或怀疑包含抗CCP抗体的样品、以及直接或间 接地检测结合的抗CCP抗体。进一步的分析形式是所谓的双抗原桥分 析，其中，在抗CCP测量的情况下，在这种免疫分析的固相一侧面以及 检测一侧都使用CCP,患者样品中的自体抗体在这些"双"抗原之间形成桥。在必要或适合时，当进行异质分析时包括了洗涤步骤。正如术语"抗核抗体"(=ANA)所指示的，ANA是针对各种核抗 原的，并且在患有许多风湿和非风湿疾病的患者的血清中以及没有可确定的临床综合症的患者中被检测到。对于检测ANA的免疫学分析的用 途，有证据的指导原则是可获得的 (Solomon D.H., Arthritis and Rheumatism 47 ( 2002 ) 434-444 )。ANA可以通过各种方法来测量，例如使用啮齿动物肾脏或肝细胞、 人上皮-2 (HEp-2)细胞的免疫组织化学方法，或通过异质的免疫分析 方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)或基于荧光的异质免疫分析。在优选的实施方式中，AN A通过免疫组织化学方法来测量。在最近几年，在通过异质的免疫分析方法检测ANA方面取得了显 著的进展。例如，现在可能的是对于不同特异性的各种抗核抗体来包括 单个的高度纯化的抗原，因而特异性地检测相应的ANA。例如，现在可 以特异性地;险测4十对乂又链DNA、或针对一皮称为SSA、 SSB、 Sm/RNP、 着丝粒(centromer)的抗原等等的抗体。在本发明的进一步优选的实施方式中，通过异质的免疫分析方法来 进行ANA测试。优选地，用于这种测试的ANA抗原至少包括用于测量 针对SSA60、 SSA52、 SSB、 Jo画l、 Scl70、 Sm/RNP、双链DNA和着丝 粒B肽的自体抗体的抗原。在RA的差异诊断中，自身抗原SSA60、 SSA52、 SSB、 Jo-l、 Scl70、 Sm/RNP、双4连DNA和着丝粒B肽中的至 少 一种的阳性值被认为是ANA阳性的。以下较详细地描述了上述自身抗原的几种SSA或Ro ( SSA)抗原针对Ro ( SSA )抗原的自体抗体是风湿疾病中自体免疫的最常见血 清学标记物之一 (Tan, E.M., Adv. Immunol. 44 ( 1989 ) 93-151; McCauliffe, D.P. and Sonth函er, R.D., J. Inv. Dermatol. 100 ( 1993 ) 73S-79S )。它们在50-80%的患有Sjogren's综合症(SS )的患者、30-40% 的患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者和3-5%的患有类风湿性关节炎 (RA)的患者的血清中存在(Harley， J.B. et al., Arthritis Rheum. 29 (1986 ) 196-206; Reichlm, M., J. Clm. Immunol. 6 ( 1986 ) 339-348 )。 Ro (SSA) ^1/沐,巴向与称为hY-RNA的小RNA》-子纟审7含、的'蛋白4元原。 这些蛋白-RNA复合物被称为Ro-核糖核蛋白(Ro-RNP),它们的生物 学功能还未被阐明。抗Ro (SSA)阳性血清可能含有两种不同类型的自体抗体针对 60 kDa多肽组件的那些和针对52 kDa多肽组件的那些(分别称为R06O和Ro52,或SSA60和SA52 ) ( Chan, E.K丄.and Buyon, J.P., Man. Biol. Markers Dis. ( Kluwer Acad. Publ. ) ( 1994 ) B4.1/1-18 )。虽然绝大多 数Ro(SSA)阳性血清与这两种组件反应，已经报道了抗Ro60抗体仅 在SLE血清中出现而没有抗Ro52抗体(Ben画Chetrit， E. et al., Arthritis Rheum. 33 ( 1990 ) 349-355; Slobbe, R丄.et al., Clin. Exp. Immunol. 86(1991 ) 99-105 ),而已经报道了抗Ro52抗体在突发性炎症性肌病、 皮肌炎和硬皮症中出现而缺乏抗Ro60抗体(Frank, M.B. et al., J. Autoimmun. 12 ( 1999) 137-142; Peene， I. et al., Ann. Rheum. Dis. 61(2002 ) 1090-1094) 。 Ro52是蛋白的三联基序(TRIM)家族的成员。 TRIM基序包括三个锌结合结构域、RING指、B-盒l型和B-盒2型、 以及中心巻曲螺旋区域(亮氨酸拉链结构)。TRIM蛋白被认为通过均 多聚化的过程鉴定特定的细胞小室(Reymond, A. et al., EMBO J. 20(2001 ) 2140-2151 )。SSB或La (SSB)抗原针对La (SSB)抗原的自体抗体可以在患有初级或二级SS的至多 87%的患者的血清中检测到。抗-La(SSB)自体抗体的存在通常与抗-Ro (SSA)自体抗体的存在重叠，然而抗Ro自体抗体在其他风湿性状况 如系统性红斑3良痴(SLE)和混合结締组织病(MCTD)中远远更为常 见的事实表明，与抗-Ro相比，抗-La对于初级和二级SS是更为特异性 的(St. Clair, E.W., Rheum. Dis. Clin. N. America 18 ( 1992 ) 359-376; Harley, J.B., J. Autoimmun. 2 ( 1989 ) 383-394 ) 。 La ( SSB )抗原与新 生RNA聚合酶III转录产物的寡聚(U ) 3'末端结合，并通过这个酶促进 转录终止和再起始(Stefano, J.E., Cell 36 ( 1984 ) 145-154; Gottlieb, E. and Steitz, J.A., EMBO J. 8 ( 1989 ) 841-850 )。还报道了它起到能够融 化RNA-DNA杂交物的ATP依赖性解旋酶的作用(Bachmann, M. et al., Cell 60 ( 1990) 85-93 )。Jol抗原在多发性肌炎和皮肌炎中最常见的自体抗体是抗-Jo-l,在15-20% 的所有肌炎患者中和约30%的成年多发性肌炎患者中出现(Nishikai， M. and Reichlm, M., Arthritis Rheum. 23 ( 1980) 881-888; Targoff, I.N.,Rheum. Dis. Clm. North Am. 18 ( 1992 ) 455-482 ) 。 1983年，Mathews 和Bernstein (Mathews, M.B. and Bernstem， R.M., Nature 304 ( 1983 ) 177-179)报道了 Jo-1抗原是组氨酰tRNA合成酶(HRS ),该酶催化组 氨酸与其特定tRNA的结合，之后转运到核糖体，随后在蛋白质合成期 间掺入多肽链。RNP/Sm抗原针对被称为RNP和Sm的snRNP(小的核内核糖核蛋白)自身抗原 的自体抗体最初在系统性红斑狼痴(SLE)患者的血清中浮皮;险测到(Tan, E.M. and Kunkel, H.G., J. Immunol. 96 ( 1966 ) 464-471; Mattioli, M. and Reichlm, M.， J. Immunol. 107 ( 1971 ) 1281-1290 )。随后在混合结締组 织病(MCTD )患者的血清中发现抗RNP抗体 (Sharp, G.C. et al., Am. J. Med. 52 ( 1972 ) 148-159)。snRNP是由与小的核RNA分子締合的 一些多肽组成的一组核颗粒。 在前mRNA剪接中涉及最丰富的snRNP ( Luehrmann, R. et al., Biochim. Biophys. Acta 1087 ( 1990 ) 265-292 )。Scl70抗原大约20-28%的硬皮症患者具有针对^^称为Scl-70的核内蛋白的自 体抗体(Douvas， A.S. et al., J. Biol. Chem. 254 ( 1979 ) 10514-10522 )。 在1986年，Shero等人鉴定了 Scl-70抗原是超螺旋DNA解旋酶拓朴异 构酶I ( Shero, J.H. et al., Science 231 ( 1986 ) 737-740 )。双链DNA ( dsDNA ):针对双链DNA的抗体在健康个体中4艮少见到，被认为是系统性红 斑狼疮(SLE)的标志。通常通过基于短膜虫法DNA的含DNA细胞器 的荧光分析、通过放射免疫分析(RIA)或ELISA来测定它们。已经报 道了 50到90%之间的未治疗的SLE患者一皮测试了抗dsDNA抗体阳性 (Griesmacher, A. and Peichl P., Clin. Chem. Lab. Med. 39 ( 2001 ) 189-208)。在患有SLE的患者中的临床改善通常与抗dsDNA抗体的降 低或完全消失相关。用于抗着丝点抗体的检测的着丝点B-肽抗着丝点抗体(ACA)在80-90%的患有系统性硬化的有限皮肤性 (CREST )变体的患者中被发现。它们针对染色体的限制性区域(Barland P. and Lipstem, E., Am. J. Med. 100 ( 1996 ) 16S-23S )。报道了与免疫 荧光分析相比，基于重组CENP-B肽的ELISA方法在鉴定ACA中更为 敏感(Parveen, S., et al., J. Gasteroenterol. Hepatol. 10 ( 1995 ) 438-445 )。由于以上讨论的大多数单独的自体抗体是自体免疫患者的特定亚 群的某些扩展指标， 一种或多种特定ANA的值将优选地:陂包括在评估 算法中，以表明这些样品将可能属于除了 RA以外的哪些风湿疾病亚群。在根据本发明的进一步优选的实施方式中，通过采用蛋白芯片在一 个单独的分析步骤中对同一样品进行抗CCP抗体的测试和ANA的测 试。在这种蛋白芯片中，用于测量抗CCP的抗原以及用于测量ANA的 各种抗原在单独的区域中包被在固相支持物上，样品中的自体抗体结合 到它们相应的自身抗原，如US 6,815,217中描述的检测所有结合的自体 抗体。诊断的理想情况是其中单 一 的事件或过程将引起相应的疾病，例 如，在传染性疾病中的情况。在所有其他情况中，正确的诊断可能是非 常困难的，特别是当疾病的病因没有完全一皮理解，如RA的情况。因而， 一般地，为了 RA的诊断一起地考虑各种临床症状和生物学标记物。标 记物可以独立地测定，或在本发明的优选的实施方式中，可以-使用芯片 或基于珠子的阵列技术同时地测定它们。然后为每个标记物使用单独的 截止值来独立地解释生物标记物的浓度，或者将它们组合来解释。在根据本发明的方法中，至少分别测定生物标记物抗CCP和ANA 的浓度，标记物组合与RA的存在或不存在相关联，其中在关联抗CCP 和ANA的测量值的优选的方式中，抗CCP阳性和ANA阴性的样品^皮 认为是RA的指示。满足测试抗CCP阳性和ANA阴性的要求的样品非 常可能来自患有RA的患者。因而，仅仅两种标记物抗CCP和ANA的 组合显著地改善了 RA的阳性预测值。这个发现可以用于改善RA的差异诊断。熟练的技术人员知道，十 分难以区分各种风湿疾病，例如SLE、 MCTD和RA。对于临床症状以 及对于生物标记物，患者可能具有一定量的重叠。本发明可以帮助医师 将怀疑患有自体免疫疾病的患者分类到可能患有RA的一个组中，即，具有抗CCP但没有ANA的那些患者，以及分类到需要经历进一步的诊 断测量以确定明确的诊断结-i仑的那些患者中，即，对于抗CCP和ANA 都是测试阳性的那些患者。熟练的技术人员将理解，存在许多途径来使用两种或多种标记物的 测量值以改进所研究的诊断问题。在十分简单的但仍然常常是有效的手 段中，如果样品对于所调查的至少一种标记物是阳性的，则假定阳性的 结果。例如，当诊断传染性疾病如AIDS时这是可能的。然而经常地， 评估标记物的组合。优选地，对标记物组的标记物，例如对抗CCP和 ANA测量的值被算术地组合，组合的值与基础的诊断问题相关联。可以 通过任何适合的现有技术数学方法来组合标记物值。用于将标记物组合 与疾病相关联的公知的数学方法采用了一些方法，如，判别分析(DA) (即，线性的、四方的、规则化的DA)、核方法(即，SVM)、非参 数方法(即，k-最近邻分类器)、PLS (部分最小二乘方)、基于树型 的方法(即，逻辑回归、CART随才几森^木方法、助推/袋翻方法)、广义 的线性模型(即逻辑回归)、基于主分量的方法(即，SIMCA)、广义 的加成模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。 熟练的技术人员在选择合适的方法来评估本发明的标记物组合方面将 没有问题。优选地，用于将本发明的标记物组合与例如RA的存在或不 存在相关联的方法选自DA(即，线性的、四方的、规则化的判别分析)、 核方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类器)、PLS (部分最 小二乘方)、基于树型的方法(即，逻辑回归、CART、随机森林方法、 助推方法)或广义的线性模型(即，逻辑回归)。关于这些统计方法的 细节在以下参考文献中找到 Ruczinski, I., et al., Logic regression, J. of Computational and Graphical Statistics 12( 2003 ) 475-511; Friedman, J.H., Regularized Discriminant Analysis, J. of the American Statistical Association 84 ( 1989 ) 165-175; Hastie, T., et al., The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics( 2001 ); Breiman, L., et al.， Classification and regression trees, California, Wadsworth( 1984 ); Breiman, L., Random Forests, Machine Learning 45 ( 2001 ) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003 );以及Duda, R.O., et al., Pattern Classification, Wiley Interscience， 2nd edition ( 2001 )。本发明的优选的实施方式是对基础的生物学标记物的组合〗吏用优 化的多元截止值，以及区分状态A和状态B,例如疾病和健康。在这种 分析中，标记物不再是独立的，而是来自标记物组。可以确定的是，与 同样评估的健康对照相比、或与患有其他风湿性疾病的患者相比，组合抗CCP和ANA的测量值确实显著地改善了诊断准确性，特别是对于RA 的阳性预测价值。特别地，后一发现具有很大的重要性，因为患有除 R A以外的风湿性疾病的患者可能需要相当不 一 样的治疗方法。诊断方法的准确性由它的接收者操作特性(ROC)最好地描述(特 别参见Zweig, M. H., and Campbell, G., Clm. Chem. 39( 1993 ) 561-577 )。 ROC图是在观察的数据的整个范围上连续地改变判定阔值而产生的所 有敏感性/特异性配对的曲线。实验室测试的临床性能取决于它的诊断准确性，或正确地将受试者 分类到临床上相关的亚群中的能力。诊断准确性衡量了所述测试的正确 辨别研究对象的两种不同状况的能力。这些状况例如1*康状况和疾病、 或良性的与恶性的疾病。在每种情况下，通过在判定阈值的整个范围上标绘敏感性对1-特异 性，ROC曲线描绘了两种分布之间的重叠。y轴是敏感性，或真阳性分 数[定义为(真阳性测试结果的数量)/ (真阳性的数量+错误阴性测试 结果的数量]。这也^皮称为存在疾病或状况的确定性。它单独地从受影 响的亚群来计算。x轴是假阳性分数，或l-特异性[定义为(假阳性结 果的数量)/ (正确的阴性的数量+假阳性结果的数量)]。它是特异性 的指数，并完全从不受影响的亚群来计算。因为通过使用来自两个不同 亚群的测试结果完全独立地计算真阳性分数和假阳性分数，ROC曲线与 样品中疾病的发病率无关。在ROC曲线上的每个点代表相应于特定判 定阈值的敏感性/l-特异性配对。具有理想辨别力的测试(在结果的两个 分布中没有重叠)具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是l.O 或100% (理想的敏感性)，假阳性分数是0 (理想的特异性)。没有辨 别力的测试的理论曲线(两个组的相同的结果分布)是从左下角到右上 角的45。对角线。大多数曲线落入这两个极端之间。(如果ROC曲线 完全处在45°对角线之下，通过将"阳性"的指标从"大于"反转成"小 于"来容易地补救，反之亦然)。定性地，曲线越靠近左上角，试验的 总精度越高。确定实验室测试的诊断准确性的一个方便的目标是通过单个数字 表示它的性能。最常见的全局测量是在ROC曲线之下的面积。按照惯例，这个面积总是> 0.5(如果不是，人们可以反转判定规则来使它〉0.5 )。 数值处在1.0 (两个组的测试值的理想的分离)和0.5 (在两组测试值之 间没有明显的分布差异)之间。这个面积不仅取决于曲线的特定部分， 例如最靠近对角线的点或90%特异性下的敏感性，还取决于整个曲线。 这是ROC曲线多么接近理想曲线(面积=1.0)的定量的、描述性的表述。在优选的实施方式中，本发明涉及改善类风湿性关节炎对健康对照 和/或患有其他风湿性疾病的患者的诊断准确性、特别是阳性预测值的方 法，通过测量样品中至少抗CCP和抗核抗体的浓度，并将测定的浓度与 类风湿性关节炎的存在或不存在相关联，与基于单独的抗CCP的分类法 相比，所述改善使得更多患者被正确地分类为RA对健康对照和/或患有 其他风湿性疾病的患者。包含抗CCP和ANA的RA标记物组也可以用 于评估患有R A的患者的疾病严重度。熟练的技术人员将理解， 一种或多种其他的生物标记物可以用于进 一步改善所述RA的评估。为了说明《吏用抗CCP和ANA作为评估RA 的标记物组的关键标记物的这种额外的潜力，在附随的权利要求中使用 了术语"至少"。换句话说，在RA的评估中，对一种或多种其他标记 物测量的水平可以与抗CCP和ANA的测量值组合。与抗CCP和ANA —起4吏用的一种或多种其他标记物可以,皮^人为是 RA标记物组的部分，即，适合于进一步改善RA评估的一系列标记物。 在RA标记物组中标记物的总数优选地低于20种标记物，更优选的低于 15种标记物，再优选地j氐于IO种标记物，8种或更少是更为优选的。 优选的是RA标记物组包含总共3、 4、 5或6种标记物。在优选的实施方式中，本发明因而涉及通过生物化学标记物体外评 估类风湿性关节炎的不存在或存在的方法，包括测量样品中抗CCP、抗 核抗体的浓度和此外一种或多种其他标记物的浓度，并将抗CCP、 ANA 和所述一种或多种其他标记物的浓度与类风湿性关节炎的不存在或存 在相关联。抗CCP和ANA的测量优选地将是更大的自体免疫测试板块的部 分。这种板块测试优先地将包括测量抗CCP、 ANA和至少一种选自由 CRP、 SAA、 IL-6、 S100、骨桥蛋白、RF、 MMP-1、 MMP-3、透明质酸、SCDM、血管生成标记物、以及骨骼、软骨或滑膜新陈代谢的产物构成 的组的其他标记物。优选地，所述的一种或多种其他标记物选自由血清淀粉样蛋白A (SAA) 、 C-反应蛋白(=CRP)、白细胞介素6 ( = IL-6) 、 S100、骨 桥蛋白、RF、基质金属蛋白酶1 (= MMP-1)、基质金属蛋白酶3 (= MMP-3)、透明质酸、sCD14、血管生成标记物、以及骨骼、软骨或滑 膜新陈代谢的产物构成的组。血清淀粉样蛋白A (SSA)是11.7kDa的低分子量的急性期蛋白。 它主要由肝脏响应于IL-1、 IL-6或TNF-cx刺激而合成，涉及T细胞依 赖性免疫反应的调节。在急性事件时，SAA的浓度提高1000倍达到每 毫升一毫克。它被用于监视疾病中的炎症，例如嚢性纤维化、肾脏移植 排斥、外伤或感染 (Mozes,G.，etal.，J. Trauma 29 ( 1989) 71-74)。 在类风湿性关节炎中，它在某些情况下被用作CRP的替代物，但是SAA 还不是广泛认可的(Chambers, R.E., et al., Ann. Rheum. Dis. 42 ( 1983 ) 665-667)。C-反应蛋白(CRP)是具有21 kDa亚单位的均五聚结合Ca^的急性 期蛋白，其涉及宿主防卫。CRP合成由IL-6诱导，间接地由IL-1诱导， 因为IL-1可以通过肝窦状隙中的肝巨噬细胞触发IL-6的合成。在90% 的健康群体中CRP的正常血浆浓度是<3 m g/ml ( 30 nM ),在99%的健 康个体中是<10 yg/ml (100 nM)。血浆CRP浓度可以，例如，通过 同质的分析形式或ELISA来测量。C-反应蛋白是基础的系统性炎症的标 i己物。白细胞介素-6 (IL-6 )是21 kDa分泌蛋白，其具有4艮多生物学活性， 所述活性可以被分为涉及血细胞生成的那些和涉及先天免疫反应的激 活的那些。IL-6是急性期反应物，并刺激多种蛋白质，包括粘附分子的 合成。它的主要功能是介导肝脏蛋白的急性期产生，它的合成由细胞因 子IL-1和TNF-ai秀导。IL-6通常由巨噬细l包和T'淋巴细胞产生。IL-6 的正常血清浓度是< 5pg/ml。骨桥蛋白(=OPN)是一种分泌的、强酸性的、结合钙的、裤酸化 的糖蛋白。来自选择性剪接的三种同种型是已知的，其是游离的或结合 到细胞外基质。通过32kDa肽主链的RDG基序，OPN可以结合整联蛋 白例如avP3。虽然它最初/人骨基质中纯化，^旦是它在许多体液和组织中^皮表达，包括奶、尿液、活化的T细胞、巨噬细月包、成纤维细胞、平 滑肌细胞、肾脏组织和某些肺瘤细胞。响应于几种细胞因子、生长因子 或炎症性介体，它的表达被刺激。提高的OPN浓度已经与败血症、转 移性癌症、大脑局部缺血、动脉粥样硬化性斑块、肺结核中的肉芽瘤形成和自体免疫疾病如多发性硬化(Chabas,D.,etal., Science 294 ( 2001 ) 1731-1735 ) 或RA相关联(Petrow, P. K., et al.， Arthritis Rheum. 43(2000) 1597-1605 )。类风湿因子(=RF)是针对免疫球蛋白G分子的恒定Fc区域的自 体抗体(Waaler, E., Acta Pathol. Microbiol. Scand. 17 ( 1940 ) 172-188; Moore, T. L., and Dorner, R. N., Clm Biochem. 26 ( 1993 ) 75-84 )。虽然 RF具有某些局限性，当前它是包括在ARA指标中的唯一的类风湿性关 节炎的免疫学标记物。除了RA之外，它还在其他炎症性风湿性疾病、 非风湿性疾病甚至在年龄超过60岁的健康人中纟皮发现(Bartfeld, H., Ann. NY Acad. Sci. 168 ( 1969) 30-40) 。 RF自体抗体属于所有免疫球蛋白 类型，当今使用的大多数分析不能区分同种型IgM、 IgG和IgA。这些 RF分析，也称为总RF分析，主要测定了 IgM,但还覆盖了 IgG或IgA, 一定程度上取决于分析形式和供应商(Bas, S., et al.， Ann. Rheum. Dis. 61(2002 ) 505-510)。更近一些，RF同种型IgG和Ig成为RA诊断的焦 点。当所有三种RF同种型提高时，可以改善RF分析的诊断价值(Swedler, W., et al., J. Rheumatol. 24 ( 1997 ) 1037-1044 )。另外，某 些预后值已经归因于这些RF同种型的某一些。特别是，发现高浓度的 IgA型RF是严重的疾病进展的指标(Jorgensen, C., et al., Clm. Exp. Rheum. 14 ( 1996) 301-304)。在才艮据本发明的标记物组合中，标记物 RF可以是任何形式的RF测定，包括总的RF、单个特异性的RF同种型 或RF同种型的任何组合。基质金属蛋白酶(=MMP )的家族降解几乎所有的细胞外基质成分。 因此MMP已经与各种类型的癌症、还与RA中的炎性过程相关联。 MMP-1和MMP-3由成纤维细胞、成骨细胞和内皮细胞在被前炎症性细 月包因子如IL-1或TNF-a刺激时产生。一4殳地，MMP在循环中作为无活 性的前体形式存在，在此使用的标记物MMP-1和MMP-3分别也涉及这 种无活性的前体形式。MMP-1和MMP-3已经在RA患者的滑液中被检 测到，其水平响应于TNF-oc治疗。才艮据本发明的RA标记物组中使用的最优选的金属蛋白酶是MMP-1 。除了上述的金属蛋白酶，还可能使用它们相应的抑制物，总称基质金属蛋白酶的组织抑制物(=TIMP ),例如，MMP-1和MMP-3通过TIMP隱1 被体内钝化，这是与MMP形成1: l化学当量复合物的29.5kD唾液酸 糖蛋白。已经研究了在RA中TIMP-1和TIMP-2与软骨破坏的关系 (Ishiguro, N., et al., Arthritis Rheum. 44 ( 2001 ) 2503-2511 )。S100蛋白形成了不断增加的结合Ca^的蛋白家族，今天包括超过 20个成员。S100蛋白的生理学相关结构是同二聚体，但一些也可以互 相形成异二聚体，例如S100A8和S100A9。细胞内功能从蛋白磷酸化的 调节、酶活性的调节、涉及细胞增殖和分化的细胞骨架的动力学的调节。 由于某些S100蛋白也从细胞释放，也已经描述了细胞外功能，例如， 神经元存活、星形细胞增殖、细胞凋亡的诱导和炎性过程的调节。 S100A8、 S100A9、异二聚体S100A8/A9和S100A12已经在炎症中一皮发 现，S100A8相应于慢性炎症，而S100A9、 S100A8/A9和S100A12在急 性炎症中增高。S100A8、 S100A9、 S100A8/A9和S100A12已经与具有 炎症性部分的不同疾病相联系，包括某些癌症、肾脏同种异体移植排斥、 结肠炎以及最重要地与RA相联系(Burmeister, G., and Gallacchi, G.， Inflammopharmacology 3( 1995 ) 221-230; Foell, D.， et al., Rheumathology 42 ( 2003 ) 1383-1389 )。在才艮据本发明的RA标记物组中4吏用的优选 的S100标记物是S100A8、 S100A9、 S100A8/A9异二聚体和S100A12。 CD14是前单核细胞、单核细胞、巨噬细胞和活化的粒细胞的膜蛋 白，其中它充当脂多糖的受体。它诱导细胞毒性和免疫调节性因子如反 应性氧(02)、肺瘤坏死因子(TNF-a )、白细胞介素(IL-1、 IL-6和 IL-8)以及血小板活化因子(PAF)的分泌。响应于活化或分化因子如 IFNy或TNF-a,膜结合的CD14脱落得到可溶的CD14 ( = sCD14 )。 sCD14的生理功能还不是完全清楚。因为在RA和其他自体免疫疾病中 涉及炎症和免疫过程，也在这些疾病中研究了 sCD14。当抗CD14治疗 被评估为RA中新的治疗选择时，早先提高的sCD14浓度快速地降低， 滑膜炎,皮降低(Horneff, G., et al., Clm. Exp. Immunol. 91 ( 1993 ) 207-213 )。氨基多糖透明质酸是关节的功能必需的大分子之一。它由成纤维细 胞和其他专门化的结締组织细胞合成。透明质酸与细胞外基质的形成以及细胞与细胞的接触有牵连。在滑液中发现了高的浓度，其中它对水的 滞留负责，从而促进关节的润滑。在RA中，透明质酸的合成被前炎症性介体IL-1和TNF-cx刺激，产生提高的血清/血浆水平(Sawai, T., and Uzuki， M., Connective Tissue 33 ( 2001 ) 253-259 )。类风湿性关节炎的特征是也称为血管翳的增殖性滑液组织对关节 的侵入。血管翳的有效部分由血管构成，其向生长的组织提供营养物。 因而，在RA中也研究了血管生成中相关的分子，作为RA标记物、也 作为治疗目标 (Brenchley, P.E.C., Clm. Exp. Immunol. 121 ( 2000 ) 426-429)。在这些中，已经更详细地评估了血管内皮生长因子(VEGF)。 VEGF是被剪接成四种不同的同种型的分泌糖蛋白。这些同种型中的两 种是容易扩散的，而其余的同种型与肝素紧密地结合，主要与含肝素的 蛋白多糖締合地存在。VEGF作为内皮细胞、单核细胞和成骨细胞上的 趋化因子，最终引起新血管形成和提高的微血管透过性。已经在RA患 者的滑液和血清中才全测到VEGF ( Lee, S. S., et al., Clm. Exp. Rheumathology 19( 2001 ) 321-324; Ballara, S., Arthritis Rheum. 44( 2001 ) 2055-2064)。优选地，血管生成的标记物是VEGF。最重要的关节组织是骨骼、软骨和滑膜。由于类风湿性关节炎是破 坏性的疾病，这些组织将最受影响。它们是RA领域中潜在生物学标记 物的可能的来源。原则上，这些标记物可能不4又来自相应组织的破坏， 还来自失调的和/或无效的修复过程。有经验的技术人员将理解，骨骼、 软骨或滑膜新陈代谢的标记物可以来自合成或来自这些组织的破坏。骨 骼、软骨和/或滑膜新陈代谢的各种标记物可以从两个不同组的蛋白中描绘出来。它们来自多种胶原蛋白，或来自非胶原样蛋白。非胶原样蛋白通常涉及细胞外基质的形成。这些标记物中的某些可能以改变的数量在所有三种组织中存在。骨骼和/或软骨新陈代谢的标记物和产物包括骨骼和/或软骨降解的标记物以及骨骼和/或软骨形成的标记物。来自胶原蛋白新陈代谢的优选的才示i己物是才示i己物^口 1. 吡咬啉(=PYD)、脱氧-他咬啉(=DPD)和Glc画Gal-PYD: 吡啶啉(PYD )通过交联胶原蛋白三螺旋的链来稳定胶原蛋白。PYD的化学结构是非常稳定的，可以在血清和尿液中作为胶原蛋白降解的终产物被发现 (Knott, L.,andBailey, A.J.,Bone 22 ( 1998) 181-187)。它已经与关节炎相联系(Kaufmann,丄，et al., Rheumatology 42 ( 2003 ) 314-320 ) 。 PYD监视关节破坏的软骨牵连，因为它从软骨释放，从骨 骼的释放仅达到一定程度，而它的近亲脱氧-吡啶啉(=DPD)主要来自 骨骼。所有三种标记物已经与关节炎相联系(Kaufmann,上文)。糖基 化形式Glc-Gal-PYD主要在滑液组织中存在 (Gmeyts, E., et al., Rheumatology 40 ( 2001 ) 315-323 )。2. 交联的端肽作为分別来自I型和II型胶原蛋白的C-末端或N-末端的交联的端肽的CTX-I、 CTX-II、 NTX-I和LQ表位，其中6-CTX-I 也一皮称为6隱交耳关Laps(Bonde, M., et al, Clin. Chem. 40 ( 1994) 2022-2025 ) 。 I型胶原蛋白羧基末端端肽(=ICTP )是指I型胶原蛋白 的片段和标记物，其最初通过溴蓝裂解来自I型胶原蛋白。3. 来自胶原蛋白的线性肽称为Cartilaps⑧的分析测量来自II型 胶原蛋白的C-末端区域的线性肽。4. 修饰的氨基酸胶原蛋白包含修饰的氨基酸如羟脯氨酸和半乳 糖羟基赖氨酸，其可以用作胶原蛋白^^坏的标记物(Al-Dehaimi, A. W., et al., Clm. Chem. 45 ( 1999 ) 676-681 )。5. 胶原蛋白新表位Col2-3/4和CIIN是由胶原酶对胶原蛋白II 的初始裂解而产生的新表位(Billmghurst, R. C. et al., J. Clm. Invest. 99(1997) 1534-1545 )。6. 考虑的胶原蛋白标记物反映骨形成I型胶原蛋白的N-末端及 C-末端前肽(PINP和PICP)分别在合成期间和之后从前体多肽(前胶 原)上剪下，认为是骨骼形成的标记物。PIICP是来自II型胶原蛋白的 相应前肽，而PIIINP来自胶原蛋白III。优选地，骨骼和/或软骨新陈代谢的标记物也可以是非胶原样标记 物，如CS846,其是在聚集蛋白聚糖合成期间创建的硫酸软骨素；具 有软骨中的桥功能的软骨寡聚基质蛋白(=COMP) (Saxne, T., and Hemegard, D., Br. J. Rheumatol. 31 ( 1992 ) 583-591 );软骨中间层蛋白 (=CILP),其是软骨的基质蛋白(Lorenzo，P.，etal.,J.Biol. Chem. 273 (1998 ) 23463-23468 );也称为基质蛋白的软骨基质蛋白1-3;作为 软骨中的信号分子的软骨调节蛋白(Suzuki, F., Connect. Tissue Res. 35 (1996 ) 303-307 );软骨衍生的视黄酸敏感蛋白(=CD-RAP )或MIA, 其具有在软骨细胞调节中待定义的功能(Mueller-Ladner, U., et al.,Rheumatology 38 ( 1999 ) 148-154);骨钙蛋白，其由成骨细胞合成， 属于骨骼的主要非胶原蛋白基质蛋白，被用于监一见骨折(Gundberg, C. M. et al., J. Clm. Ligand Assay 21 ( 1998 ) 128-138 );以及骨骼唾液蛋白，其是骨骼的主要非胶原蛋白基质蛋白，例如骨骼唾液蛋白n,现在称为骨骼唾液蛋白，其浮皮评估为骨4斤的标记物 (Saxne, T., et al., Arthritis Rheum. 38 ( 1995 ) 82-90 )。可以在评估RA中用作标记物的滑膜内的代i射产物包括CTX-III, 其是来自III型胶原蛋白的端肽，YKL40,后者是细胞外基质的壳多糖 酶3样蛋白()，以及aggrecan,其是蛋白多糖的构建块以及它的降解 产生硫酸角质素。优选的，RA标记物组包含至少三种标记物，其中含有抗CCP、 ANA 和选自由CRP、 IL-6、 S100、骨桥蛋白、RF、 MMP-1、 MMP-3、透明质 酸和胶原蛋白新陈代谢产物的第三种标记物。在RA的评估中，包含抗CCP、 ANA和S100，特别是S100A12的 标记物组是优选的。RA标记物的进一步优选的组包含抗CCP、 ANA和透明质酸。如上进一步提及的(参见ARA指标)，尽管有严重的局限性，类 风湿因子(RF)当前是公认帮助确定RA的诊断的唯一的生物化学标记 物。明显地预计的是，本发明的标记物组合将显著地改善RA的i貪断， 并将补充或甚至可以最后替换RF分析。在RA的诊断中至少包含抗CCP 和ANA的标记物组的用途代表了本发明的进一步优选的实施方式。熟练的技术人员将理解， 一种或多种其他标记物可以用来进一步改 善诊断准确性，或，在需要时花费特异性来提高诊断敏感性，反之亦然。 在某些诊断领域，例如，在HIV感染的检测中，敏感性是极度重要的。 所需的高敏感性可以以特异性为代价来实现，导致提高数量的假阳性情 况。在其它情况下，例如，作为筒单的实例，当评估血型抗原时，特异 性是最重要的。进一步优选的实施方式涉及在RA的it断中4吏用标记物组，所述组 包含抗CCP、抗核抗体和选自由SAA、 CRP、 IL-6、 S100、骨桥蛋白、 RF、 MMP-1、 MMP-3、透明质酸、sCD14、血管生成标记物、以及骨骼、 软骨或滑膜新陈代谢的产物构成的组的至少 一种其他的标记物。本发明的方法也可以帮助监一见病程。这可以通过在各个时点测量患者样品抗CCP和ANA以及任选的其他标记物，并比较在这些不同的时 点标记物的绝对和/或相对水平。因而进一步优选的是使用根据本发明的方法来监视患有RA的患者中的病程。还认识到的是本发明可以帮助评估对RA的任何治疗的效力。治疗 的效力将通过标记物水平的改变来反映。如果治疗具有期望的效果，则 抗CCP或ANA的两种标记物水平中的至少一个将降低。因而根据本发 明的方法优选地被用于评估治疗的效力。相同的现象，即，抗CCP或 ANN中的至少 一种的标记物水平的降低可以容易地应用于在RA中选择 正确的药物以及最适合的药物剂量。本发明的方法在选择正确药物和/ 或最合适的剂量方面的用途也是优选的。本发明的方法还可以允"i牛在RA领域中选4奪和鉴定新药。这种应用 代表了进 一 步优选的实施方式。还有很大益处的是，对于临床研究和在临床研究中现在可以鉴定在 抗CCP和ANA水平方面不同的患者的亚群，并将标记物水平中的这种 差异与被研究的药物的效力相关联。本发明还涉及用于进行本发明的方法的试剂盒，包含分别特异性地 测量抗CCP和抗核抗体所需的试剂。所述试剂盒任选地可以包含用于进 行抗CCP和ANA测量的辅助剂试剂。提供以下的实施例来帮助理解本发明，它们的真实范围在附随的权 利要求中阐述。所引用的文件的完整公开内容通过引用来包括。要理解 的是，可以在所列的步骤中进行修改而不背离本发明的精神。实施例1免疫学的多参数芯片技术IMPACT-—般步骤将具有约2.5 x 6 mm表面积的黑色聚苯乙烯芯片用链霉抗生物素蛋 白层完全包被。向这个链霉抗生物素蛋白表面上，我们使用喷墨技术施 加了相同试剂点样的线(每条线和试剂约20个点)。每个点样直径约 150 ym,含有能够特异性地结合样品中的被分析物(例如，抗原或抗 体)的生物素化的结合试剂。使用样品稀释緩沖液以1: IO稀释每个样品，将40 jul稀释的样品 施加到每个芯片上并孵育。在自动化的前原型仪器上进行分析。将稀释的样品在37。C孵育6分钟。在这个孵育期间，样品中含有的 每种被分析物结合到它的特异性结合试剂上。然后吸出样品，使用洗涤緩冲液洗涤芯片。之后将芯片在37。C与抗体-缀合物孵育3分钟，所述抗体-缀合物是地高辛化的(digoxigenylated ),并且其特异性地结合一皮 分析物，所述被分析物经由生物素化的结合试剂结合到所述点样。在进 一步的洗涤步骤之后，在37。C将芯片与同地高辛的抗体-结合物孵育3 分钟，用荧光标记来标记所述结合物。在进一步的洗涤步骤和吸出剩余 的试剂之后，激发萸光标记，通过CCD照相机检测光线，将光强度转 化为被分析物的浓度。实施例2抗CCP和ANA的测量的特异性分析对于抗CCP的测量，在WO 03/050542中公开的CCP肽;故生物素化^ 并使用。对于ANA的测量，使用单独生物素化的抗原，即，天然ANA抗原， 例如SSA60、 SSA52、 SSB、 Jo画l、 Scl70、 RNP、 Sm;双链DNA、着丝粒B肽。如果这些自身抗原中的至少一个种测试阳性，则样品;陂记录为 ANA阳性的。在样品稀释緩冲液中以l: IO稀释样品，将40jul稀释的样品在37 。C孵育6分钟。来自样品的自体抗体结合到它们的特定抗原。吸出样品， 使用洗涤緩冲液洗涤芯片。之后将芯片在37。C与抗体-缀合物孵育3分 钟，所述抗体-缀合物是地高辛化的，并且其特异性地结合样品中的人类 IgG抗体，所述抗体与位于点样中的抗原结合。在进一步的洗涤步骤之 后，在37。C将芯片与同地高辛的抗体-缀合物孵育3分钟，用荧光标记 来标记所述缀合物。在进一步的洗涤步骤和吸出剩余的试剂之后，激发 荧光标记，通过CCD照相机检测光线，将光强度转化为一皮分析物的浓 度。样品稀释緩沖液 50mMTris, pH 7.6, 150 mM NaCl,0.1%洗涤剂(聚多卡醇)， 0.6%牛血清白蛋白(BSA),0.2%防腐剂(氧吡啶^J同十甲基异噻唑盐酸盐(MIT) 1:1)洗涤緩冲液10mMTrispH8.2, 0.01%聚多卡醇，0.001%氧吡啶 石克酮，0.001% MIT结果取决于研究的患者组，对于抗CCP是阳性的样品的百分比以及对于 抗CCP和ANA都是阳性的百分比会变化。与不考虑他们的ANA状态、 对于抗CCP是测试阳性的所有患者的PPV相比，对于具有阳性抗CCP 和阴性ANA的患者的亚群，RA的阳性预测值(PPV)可以一皮改善。
权利要求
1.一种通过生物化学标记物帮助类风湿性关节炎的体外诊断的方法，包括a)测量样品中的抗CCP和抗核抗体(ANA)，和b)将在步骤a)中测定的浓度与类风湿性关节炎的诊断相关联。
2. 权利要求l的方法，其中在步骤a)中测量的浓度被用于鉴定对 于抗CCP是阳性的并且对于ANA是阴性的那些样品。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述诊断是针对RA的差异诊断。
4. 根据4又利要求1的方法，进一步包括测量选自由CRP、SAA、IL-6、 SIOO、骨桥蛋白、RF、 MMP-1、 MMP-3、透明质酸、sCD14、血管生成 标记物、以及骨骼、软骨或滑膜新陈代谢的产物构成的组的至少一种其 ^也的才示"i己物。
5. 至少包含抗CCP和ANA的标记物组在RA的诊断中的用途。
6. —种用于进行根据权利要求1的方法的试剂盒，包含分别特异性 地测量抗CCP和ANA所需的试剂以及用于进行所述测量的任选的辅助 试剂。
全文摘要
本发明涉及帮助评估类风湿性关节炎的方法。该方法特别地用于体外的类风湿性关节炎的差异诊断。例如，该方法通过分析生物化学标记物来实践，包括测量样品中抗CCP的浓度和抗核抗体(ANA)的浓度、将测定的浓度与类风湿性关节炎的诊断相关联。为了进一步改善本发明的方法中RA的评估，可以与抗CCP和ANA一同测定一种或多种其他标记物的水平，并与RA的缺乏或存在相关联。本发明还涉及包含抗CCP和ANA的标记物组在类风湿性关节炎的诊断中的用途，它教导了用于进行本发明的方法的试剂盒。
文档编号G01N33/564GK101283278SQ200680037249
公开日2008年10月8日 申请日期2006年10月4日 优先权日2005年10月6日
发明者H·-P·莱曼, S·斯莫尔克, U·克劳斯, W·佐尔格 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司