脉冲噪音传感器的制作方法

专利名称：：脉冲噪音传感器的制作方法脉冲噪音传感器
技术领域：
广泛而言，本发明涉及化学和生物化学传感器领域，具体而言，本发明涉及免疫传感器和生物传感器、包括这些传感器的装置以及制备这些传感器的方法的领域。
背景技术：
：己知的传感技术基于夹心式测定法用于感知样品中的分析物，其中第一感受器与底物结合，所述分析物与所述感受器结合，然后使带有信号增强部件的第二感受器与所述分析物结合(参见例如Taussig等，Targets,(2003):2(4),169，Seong等，Proteomics(2003)，3，2176;Wu等，ClinicaChimicaActa,369,(2006)，119及其中的参考文献)。这些夹心测定法也可用于竞争性测定形式中，其中含有信号增强部件的分析物模拟物已经与所述第一感受器相结合，但被测试样品中含有的分析物所置换。通常，使用光学方法作为这些传感器的读出机制。由于光学系统需要精密仪器，因此光学系统具有相对昂贵的缺点。对于要求高灵敏度的测定尤其如此。因此，需要提高夹心测定法的灵敏度而不要求精密或昂贵的传感装置的方法。
发明内容本发明的发明人发明了一种新的传感器换能方法，使用由于连接于第二感受器或分析物模拟物的触发元件与暴露于触发脉冲如簇发电磁辐射的底物的相互作用所产生的脉冲噪音以检测第二感受器的结合或分析物模拟物的置换。其具有可通过与一些光学或其他检测装置相比灵敏度增强的简单低成本的微音噪音检测系统来检测的优点。本发明的发明人进一步发现当被触发时产生脉冲噪音的触发元件的使用能够比上述夹心测定法更广泛地应用于分析物传感领域。因此，第一方面，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，其中所述分析物的存在由当被触发时产生脉冲噪音的一种或多种触发元件的存在与否来指示，所述方法包括以下步骤(a)将所述一种或多种触发元件暴露于触发脉冲；和(b)检测由所述一种或多种触发元件产生的脉冲噪音。第二方面，本发明提供一种用于实施所述第一方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包括实施所述第一方面的方法所需要的一种或多种组分。第三方面，本发明提供一种能够与分析物结合的感受器，其中所述感受器用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。第四方面，本发明提供一种能够与分析物的感受器结合的分析物模拟物，其中所述分析物模拟物用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。附图简述图1显示通过本发明实施的夹心测定法的示意图。第一感受器结合在反应性底物上。然后将其暴露于含有分析物的溶液中，所述分析物与所述第一感受器结合。被触发元件(例如纳米颗粒)功能化的第二感受器也与所述分析物结合。己被触发元件功能化的第二感受器最初可以以脱水形式存在于底物上，或者可以在所述分析物与所述第一感受器结合后作为第二步添加。因此，第一感受器、分析物以及触发元件与其结合的第二感受器之间的夹心结构在反应性底物上形成。当该结构暴露于簇发辐射后，触发元件至少吸收一部分辐射能量，产生局部热点，从而引起底物至少部分快速分解。快速分解反应产生气体产物，该气体产物产生脉冲噪音。然后通过微音器和放大器系统测定该脉冲噪音。产生的脉冲噪音的水平与底物附近的触发元件的数目相关，后者进一步与测试溶液中分析物分子的数目相关。图2显示根据实施例4产生的脉冲噪音的代表性实例。其中，图2a显示对于吸附在硝化纤维素膜上的lxl(TAul6纳米颗粒，微音器测定的脉冲噪音。图2b显示脉冲噪音的标准化平方值，将其进行积分(图2c)以获得用于本^f究的实施例3中的数值。应当注意的是分析脉冲噪音的大量其他方法均可以有效地使用。图3显示根据实施例4产生的脉冲噪音的代表性实例，其中无Aul6纳米颗粒吸附于硝化纤维素膜上。该脉冲噪音水平显著低于纳米颗粒吸附于硝化纤维素膜上的情况。图4显示实施例3中获得的对于在相对高的纳米颗粒负载下吸附于硝化纤维素膜上的不同数量的Aul6纳米颗粒的滴定曲线。图5显示实施例3中获得的对于在非常低的纳米颗粒负载下吸附于硝化纤维素膜上的不同数量的Aul6纳米颗粒的滴定曲线。具体实施例方式第一方面，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，其中所述分析物的存在由当被触发时产生脉冲噪音的一种或多种触发元件的存在与否来指示，所述方法包括以下步骤(a)将所述一种或多种触发元件暴露于触发脉冲；和(b)检测由所述一种或多种触发元件产生的脉冲噪音。如本文所用，术语"分析物"指对于其存在天然特异性结合成员(感受器)或对于其可制备特异性结合成员(感受器)的任何物质。所述分析物可以是例如蛋白质、肽、抗原、细菌性抗原、糖脂、病毒或病毒片段(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、疟疾、肺结核、人免疫缺陷病毒)、半抗原、(单克隆或多克隆)抗体、核酸序列、酶、激素、维生素、类固醇、药物(治疗药或滥用药)、碳水化合物、爆炸物、毒素类(蓖麻毒蛋白、神经毒气剂)、污染物质(杀虫剂、内分泌激素干扰物质)、癌症标记物等。脉冲噪音提供样品中分析物存在的指示。优选地，所述脉冲噪音提供样品中存在的分析物的量的指示。在更优选的形式中，所述脉冲噪音的强度直接与样品中分析物的量相关。噪音的强度和分析物的量之间的关系可以成正比或成反比。例如，在竞争性结合测定法中，如果样品中存在的分析物的量越大，则触发元件存在的量越少，因此，脉冲噪音的强度将越低。优选地，所述触发脉冲为辐射。优选地，所述辐射选自紫外线、可见光、红外线和微波辐射及其组合。优选地，所述辐射为小于100毫秒持续时间但高于1纳秒持续时间的脉冲的形式。更优选地，持续时间为小于5毫秒。辐射源可以来自脉冲激光、闪光灯、高功率发光二极管(LED)、脉冲氙灯或脉冲汞灯。更优选地，所述辐射源来自闪光灯。用于产生辐射脉冲的方法可以是通过快速开关辐射源或者通过另外装置例如机械快门装置进行。所述触发脉冲不必是辐射。其可以包括其他合适的方法，例如使用电流。触发元件可以是当暴露于特定条件(即特定的触发脉冲)下时能够自身或与临近的反应性底物相互作用而产生脉冲噪音的任何分子或基团。因此，在优选的形式中，所述触发元件与反应性底物相互作用产生脉冲噪音。所述反应性底物优选由在触发元件不存在下对触发脉冲稳定但当该触发元件暴露于触发脉冲时至少部分快速分解的材料制成。在优选的实施方案中，所述反应性底物的至少一部分为硝化纤维素、硝化淀粉、硝化碳水化合物如硝基甘露糖醇、3-硝基-l,2,4-三唑-5-酮、2,4,6-三硝基苯甲醛、2,4，6-三硝基甲苯、2,4，6-三硝基苯甲醚、2,4,6-三硝基间甲酚、N-甲基-N,2,4,6-四硝基苯胺、2,4-二硝基甲苯、2，4，6-三硝基-间二甲苯、1，3，6,8-四硝基萘、六硝酸二季戊四醇酯、2,2'，4，4'6，6'-六硝基联苯、四硝基季戊四醇酉旨、九硝基三联苯、八硝基三联苯、铵-2,4，5-三硝基咪唑、六氢-1，3，5-三硝基-l，3,5-三嗪、八氢-l，3，5,7-四硝基-l,2,5，7-四嗪、1，2，4-三硝基苯、1,3,5-三硝基苯、1，3-二氨基-2，4,6-三硝基苯。优选所述反应性底物包含由部分硝化的聚合物物质即有机硝基基团功能化的有机聚合物产生的氧化聚合物。进一步优选所述反应性底物含有硝化纤维素、硝化淀粉、硝化碳水化合物如硝基甘露糖醇。在优选的实施方案中，至少部分的反应性底物为惰性材料。在本发明中，惰性材料为在脉冲元件存在或不存在下，暴露于触发脉冲期间或暴露于触发脉冲后均不产生脉冲噪音的材料。进一步优选所述反应性底物包含至少部分包以薄膜物质的惰性材料，所述薄膜物质在触发元件存在下暴露于触发脉冲时产生脉冲噪音。进一步优选所述反应性底物包含硝化纤维素材料，例如用作滤膜的硝化纤维素。进一步优选所述反应性底物包含含有一定比例的乙酸纤维素的硝化纤维素材料。所述乙酸纤维素的比例优选为相对于硝化纤维素而言5至20%w/w。进一步优选所述反应性底物为多孔底物的形式。所述反应性底物优选位于与触发元件极接近。例如，其可以构成包封触发元件的壳。反之，所述底物可以为直径为1至10000nm的颗粒形式，其中所述颗粒至少部分地被所述触发元件功能化。在另一个优选的形式中，所述底物构成其中样品被分析的区域的一部分。例如，所述区域的表面可以包含所述底物。在优选的形式中，所述触发元件为有色不溶物或沉淀物。本发明的发明人发现，某些有色物质或沉淀物例如由酶与酶底物相互作用产生的有色物质或沉淀物可以作为触发元件发挥作用。能够产生这些有色不溶物的酶对于本领域技术人员而言是熟知的，包括过氧化物酶、磷酸酶、酯酶、氧化酶类如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶。这些酶催化该酶极近的生色底物沉淀。色原可以包括氮蓝四唑(NBT/BCIP)、3,3，-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。优选地，所述有色不溶物由过氧化物酶与3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐反应产生，生成棕红色沉淀。优选地，所述有色不溶物由过氧化物酶与3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐在镍离子存在下反应产生，生成蓝灰色沉淀。在另一个优选的实施方案中，酶可用于在反应性底物上产生金属沉淀物，所述金属沉淀物作为触发元件起作用。这些酶催化的金属沉淀对于本领域技术人员而言是熟知的，描述于US2005/0100976Al中，该文献以其全部内容引入本文作为参考。在优选的形式中，所述触发元件为纳米颗粒。本发明的发明人已发现当暴露于特定条件(即特定的触发脉冲)时，纳米颗粒能够从附近的反应性底物产生脉冲噪音。优选地，所述纳米颗粒直径为1至100nm。优选地，所述纳米颗粒由金属例如金、银、钯、铜、铂、镍、钴、铬、铁、钌、铑或这些金属的合金；金属氧化物例如氧化钛、氧化铁、氧化锌、氧化镍、氧化铜、氧化钴和氧化铟；金属硫化物；金属硒化物；碳纳米颗粒、碳黑、碳纳米管、碳富勒烯；磁性纳米颗粒；染料分子簇；或其中纳米颗粒核被另一材料包衣形成壳的核-壳纳米颗粒。在纳米颗粒为核-壳纳米颗粒的情况下，所述核-壳纳米颗粒可以是活性金属核与惰性壳的颗粒，例如铝核-氧化铝壳纳米颗粒。所述纳米颗粒可以是球形、扁球形、盘状、立方体形、棒状、半球形或其他形状，其取决于所需的吸收特征。本领域公知，取决于纳米颗粒的形状可能改变其吸收特性，因此棒状金纳米颗粒在比球形纳米颗粒长的长波下吸收，而中空的半球形金纳米颗粒在近红外光谱区具有显著的吸收特征。在一个实施方案中，所述触发元件包括直径为5-60nm的金纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述触发元件包括碳黑纳米颗粒。纳米颗粒能够吸收部分的簇发辐射，产生高能态，其中纳米颗粒与反应性底物特异性作用，这样使得底物通过快速化学降解反应产生脉冲噪音。尽管不希望被科学理论所束缚，但是认为纳米颗粒当吸收辐射能后处于高能态时能够催化反应性底物的局部化学降解，该压力波产生大量的气体产物。该化学反应的快速特点在周围介质中产生压力波，其本身表现为脉冲噪音。可使用微音器系统或其他对于气体、液体或固体介质中压力变化敏感的方法进行脉冲噪音的检测和分析。该方法的灵敏度可通过本领域已知的技术提高。例如，当所述触发元件为金纳米颗粒时，可通过添加LI银增强剂溶液增加存在的纳米颗粒的量。所述LI银增强剂溶液由两部分无电镀溶液组成，所述两部分无电镀溶液自动催化银镀至金纳米颗粒上，从而增加纳米颗粒的大小和光密度。因此，进一步提供根据所述第一方面的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤将所述一种或多种触发元件暴露于无电镀金属溶液，其中所述无电镀金属溶液使金属沉积于触发元件上。用于检测脉冲噪音的装置优选为微音器、压电系统或其他检测气体、固体或液体介质中压力变化的装置。在一个实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将第一感受器固定在其中所述第一感受器能够与所述分析物结合的区域中；(ii)将所述样品加入所述区域中，从而当所述样品中存在分析物时，所述分析物与所述第一感受器结合；(iii)向所述区域中加入第二感受器，其中所述第二感受器与所述分析物结合，并且其中所述第二感受器包含所述一种或多种触发元件；和(iv)从所述区域中去除未结合的第二感受器。步骤(ii)和(iv)可以依次或同时进行。例如，所述第二感受器可以或许以脱水的形式在加入样品前存在于所述区域中。或者，所述第二感受器可以与样品一起或在加入样品之后加入所述区域中。在另一实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将第一感受器固定在其中所述第一感受器能够与所述分析物结合的区域中；(ii)向所述区域中加入分析物模拟物，其中所述分析物模拟物与所述第一感受器结合，并且其中所述分析物模拟物包含当被触发时产生脉冲噪音的触发元件；(iii)向所述区域中加入样品，从而当所述样品中存在分析物时，所述分析物与所述第一感受器结合并置换所述分析物模拟物；和(iv)从所述区域中去除未结合的分析物模拟物。步骤(ii)和(iv)可以依次或同时进行。所述分析物模拟物可以在加入样品前存在于所述区域中并与第一感受器结合。或者，所述分析物模拟物可以与样品一起或在加入样品之后加入所述区域中。在本发明中，优选所述感受器为抗体例如能够与分析物结合的单克隆或多克隆抗体或其片段，例如Fab或Fv片段、链霉抗生物素、抗生物素蛋白、生物素、蛋白A、蛋白A及其与抗体的复合物、蛋白(天然或重组)、蛋白骨架、蛋白G、蛋白G及其与抗体的复合物、凝集素、DNA、RNA、核酸适体、酶、G蛋白偶联受体、G蛋白、抗运载蛋白(anticalin)、trinectin、亲和体(affibody)分子、基于分子印迹聚合物的感受器。特别优选所述感受器为抗体例如能够与分析物结合的单克隆或多克隆抗体或其片段，例如Fab或Fv片段。本发明的分析物模拟物优选为功能化的分析物或半抗原分子，其被修饰以与触发元件结合从而能够与所述第一感受器结合。所述分析物模拟物的要求是所述第一感受器/分析物模拟物结合特点为使得所述分析物模拟物能够被目的分析物所置换。优选地，所述第一感受器通过物理吸附或者经特定的化学相互作用而被固定。类似地，优选所述第二感受器和分析物模拟物也通过物理吸附或经特定的化学相互作用与触发元件结合。在所述触发元件为金属纳米颗粒例如金、铂、钯或银纳米颗粒情况下，优选感受器/分析物模拟物经非特异性结合吸附在金属表面上，或者使用特异性化学偶联技术例如本领域技术人员己知的特异性化学偶联技术。这些特异性偶联化学方法包括但不限于使用金属-硫相互作用，其中感受器/分析物模拟物含有可及表面的硫醇、二硫化物，硫化物或其他已知结合金、钯、铂或银的硫基团。在另一个优选的实施方案中，将与感受器/分析物模拟物结合的触发元件进一步功能化，使得要分析的样品中其他基团的非特异性结合最小化。这可以通过用感受器功能化后将蛋白如牛血清白蛋白或酪蛋白吸附到触发元件上来实现。也可以通过用含有寡乙二醇和聚乙二醇基团的化合物功能化触发元件来使与所述触发元件的非特异性结合最小化。在另一实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将所述样品暴露于分析物特异性底物，其中所述分析物特异性底物在分析物存在下产生所述一种或多种触发元件。优选地，所述分析物特异性底物为能够在分析物存在下产生一种或多种触发元件的酶，包括过氧化物酶、磷酸酶、酯酶、氧化酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、葡萄糖氧化酶。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤.(i)将所述样品暴露于分析物特异性底物，其中所述分析物特异性底物吸附或结合于所述分析物，并且其中所述分析物特异性底物包含一种或多种触发元件；和(ii)去除未吸附或未结合的分析物特异性底物。优选地，所述分析物为蛋白质，且所述分析物特异性底物为纳米颗粒，例如金纳米颗粒。本发明的发明人发现，蛋白质样品将与存在的蛋白质的量成比例地吸附金纳米颗粒。进一步优选所述分析物为已经过蛋白印迹分析的蛋白或蛋白混合物，其中将含有一种或多种蛋白的样品进行凝胶电泳，然后将分离的蛋白转移至硝化纤维素膜上。蛋白印迹方法例如蛋白印迹技术对于本领域普通技术人员而言是熟知的。关于蛋白印迹的综述参见BJ.Kurien,R.HScoffield，"Proteinblotting:areview";J.Immunol.Methods,274(2003)pg1-15,该文献以其全部内容引入本文作为参考。进一步优选本发明的实施方案是萨慎(DNA)或诺慎(RNA)印迹分析。第二方面，本发明提供用于实施所述第一方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包括实施所述第一方面的方法所需要的一种或多种组分。本发明进一步提供可用于本发明的方法中的试剂(reagent)例如感受器和分析物模拟物。因此，第三方面，本发明提供能够与分析物结合的感受器，其中所述感受器用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。此外，第四方面，本发明提供能够与分析物的感受器结合的分析物模拟物，其中所述分析物模拟物用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。为更清楚地理解本发明的本质，参照以下非限制性实施例描述本发明的优选形式。实施例1.纳米颗粒的合成使用标准合成方法合成用于纳米颗粒的合成。通常的方法可以在出版物例如ClustersandColloids,fromTheorytoApplications,GSchmid(Ed.),1994，VCHPublishersNewYork,USA;NanoparticlesandNanostructuredFilms,J.H.Fendler(Ed.),1998,Wiely-VCH中找到。除非特指的水溶性，根据Schmitt.J等，Adv.Mater.,1997，9,61的方法合成柠檬酸钠包衣的直径约为16nm的金纳米颗粒(此后称作Aul6金纳米颗粒)。就颗粒数目而言，Aul6纳米颗粒的终浓度为2nM。实施例2.与生物素结合的Aul6金纳米颗粒的合成用N-[6-(生物素酰氨基)己基]-3，-(2，-吡啶二硫代)丙酰胺(1^，10mM，在二甲亚砜中)处理Aul6金纳米颗粒的样品溶液(20ml)。将Aul6金纳米颗粒放置30分钟，使得Aul6纳米颗粒被生物素功能化(Aul6-生物素溶液)。Aul6-生物素溶液在4"C下数天内稳定，并用做测试分析物溶液，其中生物素表示要测定的与作为触发元件的Aul6金纳米颗粒结合的分析物。实施例3.脉冲噪音产生与硝化纤维素膜底物上的Aul6金纳米颗粒检测用盐酸胱胺(IOO0.1M水溶液)处理Aul6金纳米颗粒溶液(10ml)。发生纳米颗粒的快速交联，由颜色从葡萄红变为蓝黑的快速改变所证实。将该溶液的等分试样用水稀释至1ml，然后通过MilliporeGSWP04700膜过滤。这些膜来自硝化纤维素，标称孔径为0.22pm。使用的过滤面积约为0.28cm2。过滤后，交联的纳米颗粒在膜孔上和孔中形成薄膜。干燥膜，并置于闪光灯附近。所用的闪光灯为Canon550装置，使用1/8至1/2功率操作。不同厂家的其他闪光灯装置也进行了试验，均可以容易地使用。将微音器放置在膜附近，并与数控稳压器和数据采集系统(Adlnstruments,PowerlabDataAcquisitionSystemandPotentiostat)连接。给微音器施加电压(0.5V),监测微音器对不同噪音水平响应时的电流变化。然后触发闪光灯，产生短暂的簇发辐射，并监测吸附有Aul6纳米颗粒的底物产生的脉冲噪音。将得到的信号标准化至0微安的预闪起始电流值，平方并积分以得到^f产生的脉冲噪音水平的值(此后称为积分噪音水平)。图2a显示测量的通常噪音响应，图2b显示标准化、平方的信号，图2c显示积分的响应。图3显示根据实施例4产生的脉冲噪音的代表性实例，其中没有Aul6纳米颗粒吸附至硝化纤维素膜上。所述脉冲噪音水平显著低于纳米颗粒吸附至硝化纤维素膜上的情况。图4显示积分噪音水平比于1ml溶液中的沉积在硝化纤维素膜上的纳米颗粒数目变化的图。积分在25毫秒内的噪音水平。图5显示积分的噪音水平比于1ml溶液中的沉积在硝化纤维素滤膜上的纳米颗粒数目变化的图，其中仅测量在时间=0至0.2毫秒时出现的噪音峰。实施例4.传感方法的证实-检测与Aul6金纳米颗粒触发元件结合的生物素MilliporeTMGSWP04700硝化纤维素膜(0.28cm"用蛋白感受器链霉抗生物素(10pl，1mg/ml)功能化3分钟。在此期间链霉抗生物素非特异性地与硝化纤维素膜表面结合。然后将该膜置于多孔吸附膜垫上，该多孔吸附膜垫作为用于从施用的样品吸附液体的e存器起作用。然后将膜复合物置于支架上，在膜上形成孔。然后将Aul6-生物素(1ml)溶液置于孔内，并使得通过毛细力流入膜下的吸附垫中。在此期间Aul6-生物素纳米颗粒分析物与表面上的链霉抗生物素结合。之后去除膜，干燥并置于闪光灯和如实施例3中所连接的微音器上。积分噪音水平为0.16。以类似的方式还进行其中开始MilliporeGSWP04700硝化纤维素膜未被链霉抗生物素功能化的对照试验。积分噪音水平为0.01，这清楚地表明生物素分析物的检测需要与底物结合的链霉抗生物素感受器。实施例5.不同膜区域的硝化纤维素膜底物上Aul6金纳米颗粒的脉冲噪音产生的比较用盐酸胱胺(100nl，0.1M水溶液)处理Aul6金纳米颗粒溶液(IOml)。发生纳米颗粒的快速交联，由颜色从葡萄红变为蓝黑的快速改变所证实。将该溶液的等分试样用水按需稀释，然后通过MilliporeGSWP04700膜过滤。这些膜来自硝化纤维素，标称孔径为0.22^1!11。制备各纳米颗粒等分试样的两个样品，通过膜的两个不同区域过滤。对于样品A，所用的过滤面积约为0.28cm2，对于样品B，过滤面积约为0.027cm2。过滤后交联的纳米颗粒在膜孔上或孔中形成一层薄膜。干燥膜，并置于闪光灯附近。所用的闪光灯为CanonEX-550装置，以全功率操作。将微音器系统(OptimaN26)放置在膜附近，并使用微音器系统的前置放大器使微音器系统与数控稳压15器禾口"数据采—集系统(Adlnstruments,PowerlabDataAcquisition-SystemandPotentiostat)连接。微音器系统产生电流，该电流通过Powerlab数据采集系统和稳压器系统测量。闪光灯激活后在第一个4毫秒内测定输出信号的绝对积分，为方便将其乘以10M咅。该绝对积分值此后称为积分噪音信号(INS)。表1中显示结果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>可见，纳米颗粒膜的大小和形状影响INS的量。例如，通过减少过滤面积可以实现纳米颗粒数目的检测限的灵敏度的有效增加(即，与对于0.28cn^膜6xl0"内米颗粒相比，对于0.027cm2面积膜1.2x109纳米颗粒有效降低的检测限)。或者，通过增加面积可能有效地区分较高浓度的纳米颗粒。实施例6.硝化纤维素膜底物和惰性PVDF膜上的Aul6金纳米颗粒的脉冲噪音产生的比较用盐酸胱胺(IOOpl，0.1M水溶液)处理Aul6金纳米颗粒溶液(IOml)。发生纳米颗粒的快速交联，由颜色从葡萄红变为蓝黑的快速改变所证实。将该溶液的等分试样用水按需稀释，然后通过MilliporeTMGSWP04700膜或MilliporeTMDuraporeGVWP04700膜过滤。这些膜分别来自硝化纤维素和聚偏氟乙烯(PVDF)聚合物，标称孔径为0.22pm。使用的过滤面积约为0.28cm2。过滤后交联的纳米颗粒在膜孔上或孔中形成一层薄膜。干燥膜，并置于闪光灯附近。然后如实施例5所述获得INS。下表2中显示两种类型膜的INS结果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>可见，含有硝化纤维素的膜产生了比惰性PVDF膜大的INS。实施例7.检测硝化纤维素膜上蛋白的一般方法将MilliporeTMGSWP04700硝化纤维素膜置于3mm厚的吸附纸垫上。将直径6mm的特富龙孔放置在硝化纤维素膜的顶上。经大约IO秒钟的时间使小牛血清白蛋白(BSA)溶液的等分试样(50微升)通过硝化纤维素膜通过毛细作用吸入较低的吸附垫中。BSA等分试样含有于pH7.4的磷酸盐缓冲液(PB)中的10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml禾口0.001mg/mlBSA。然后，将膜用50微升去离子水洗涤。该步骤有效地使不同量的蛋白(BSA)吸附到硝化纤维素膜上。然后所吸附的蛋白的量通过使两等分试样的Aul6纳米颗粒(50微刑通过硝化纤维素膜然后去离子7jC(50微升沐进行测定。Aul6纳米颗粒吸附在蛋白上但并不吸附在硝化纤维素膜上。将膜干燥，并置于闪光灯附近。然后如实施例5所述获得INS，只是每个膜用闪光灯照3次，每次闪光灯的积分时间为6毫秒。报告的INS值为三次INS值的和。表3中显示具有不同量的吸附的BSA膜的合计INS值。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>可见，不同浓度的蛋白可以容易地区分。实施例8.基于脉冲噪音产生的酶传感器由MilliporeGSWP04700硝化纤维素膜冲压硝化纤维素膜盘(直径6mm)。将盘置于蛋白过氧化物酶结合物的溶液(山羊抗兔过氧化物酶结合物产品号0545，2ml,用PB500:1稀释，Sigma化学公司)中，并在室温下轻轻混合30分钟。将盘从蛋白过氧化物酶结合物溶液中取出，并用PB洗涤2次，3分钟。在该实施例中所述分析物为3，3，-二氨基联苯胺，其通过酶的作用形成褐色沉淀。分析物溶液通过用去离子水稀释3,3'-二氨基联苯胺储备液(0.7mg/ml)来制备。所述分析物储备液还含有过氧化氢脲(0.2mg/ml)。然后将单独的盘置于含有不同数量的分析物的溶液中5分钟。然后5分钟后将盘置于水中终止进一步酶反应。干燥盘，并置于闪光灯附近，然后如实施例7所述获得INS。在表4中显示具有不同量的3，3'-二氨基联苯胺的盘的合计INS值。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例9.使用基于酶联免疫测定(ELISA)的脉冲噪音产生进行分析物检测和分析物浓度测定由MilliporeGSWP04700硝化纤维素膜冲压硝化纤维素膜盘(直径6mm)。将盘置于山羊抗兔抗体溶液(O.lmg/ml;2ml，在PB中，Sigma化学公司，产品号R2004)中，并在室温下轻轻混合30分钟。将盘用PB洗涤一次，然后用酪蛋白溶液(0.5Wwt/vo1，在PB中，2ml)封闭非特异性结合90分钟。作为模型分析物，将兔抗BSA抗体(Sigma化学公司，产品编号1520)用PB制成不同的浓度，浓度范围为2-200ng/ml。将单独的盘用兔抗BSA抗体在室温下温育30分钟。用PB洗涤盘2分钟。然后用山羊抗兔抗体过氧化物酶结合物(PB稀释500:1，Sigma化学公司产品编号0545)温育10分钟，同时轻轻混合。然后将盘用PB洗涤3分钟。再重复洗涤2次。然后在每个盘中加入3，3'-二氨基联苯胺(0.7mg/ml)、过氧化氢脲(0.2mg/ml)在TRIS缓冲液(0.O6M)中的溶液(O.7ml)，并将盘温育2分钟。然后将盘放入去离子水中2分钟，然后将盘干燥，并置于闪光灯附近。然后如实施例5所述获得INS，只是全积分时间为闪光灯激活后6毫秒。表5中显示具有不同数量的分析物(兔抗BSA抗体)的盘的INS的结果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例10.与抗兔IgG结合的Aul6金纳米颗粒的合成Aul6-山羊抗兔抗体结合物根据Wang等，J.VirologicalMethods,132(2006)212-215的方法制备。向Aul6金纳米颗粒的溶液(2ml)中加入碳酸钾缓冲液(2%wt/vol)以增加溶液的pH至8.6。然后向Aul6金纳米颗粒的溶液中加入山羊抗兔抗体溶液(ICN弁55602，30500pg/ml)，并允许溶液在室温下静置60分钟以形成Aul6-山羊抗兔抗体结合物。然后，通过离心(14000rpm，20分钟)之后将Aul6-山羊抗兔抗体结合物沉淀重悬于含1%wt/volBSA的PB溶液中来从过量的抗体中纯化溶液。实施例11.使用基于Aul6/抗兔IgG结合物的脉冲噪音产生进行分析物检测和分析物浓度的测定由MilliporeGSWP04700硝化纤维素膜冲压硝化纤维素膜盘(直径6mm)。将盘置于山羊抗兔抗体溶液(O.lmg/ml，2ml，在PB中，Sigma化学公司，产品号R2004)中，并在室温下轻轻混合30分钟。将盘用PB洗涤一次，然后用酪蛋白溶液(0.5%wt/vol，在PB中，2ml)封闭非特异性结合90分钟。作为模型分析物，将兔抗BSA抗体(Sigma化学公司，产品编号1520)用PB制成不同的浓度，浓度范围为2-200ng/ml。将单独的盘用兔抗BSA抗体在室温下温育30分钟。用PB洗涤盘2分钟。然后用根据实施例10制备的Aul6-山羊抗兔抗体结合物溶液(100微升)温育过夜。然后用去离子水洗涤。然后将盘干燥，并置于闪光灯附近。然后如实施例5所述获得INS，只是全积分时间为闪光灯激活后6毫秒。表5中显示具有不同量的分析物(兔抗BSA抗体)的盘的INS的结果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例12.通过Aul6金纳米颗粒上的自动催化银沉积提高测定灵敏度用盐酸胱胺(IOO^，0.1M水溶液)处理Aul6金纳米颗粒溶液(IOml)。发生纳米颗粒的快速交联，由颜色从葡萄红变为蓝黑的快速改变所证实。将该溶液的等分试样用水按需稀释，然后通过MilliporeGSWP04700膜过滤。这些膜来自硝化纤维素，标称孔径为0.22卞m。使用的过滤面积约为0.28cm2。过滤后交联的纳米颗粒在膜孔上或孔中形成一层薄膜。然后将含有交联纳米颗粒的膜片段置于来自NanoprobesInc，NY的LI银增强溶液中15分钟。所述LI银增强溶液由两部分无电镀溶液组成，所述两部分无电镀溶液自动催化银镀至金纳米颗粒上，从而增加纳米颗粒的大小和光密度。将膜片段用去离子水洗涤。然后将膜片段干燥，并置于闪光灯附近。如实施例5所述获得INS。将根据本实施例用银增强溶液处理的膜片段的INS结果与根据实施例5未用银增强溶液处理的结果进行比较，结果见表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>清楚可见，用银增强溶液处理的硝化纤维素膜上的纳米颗粒的INS显著增加。在整个说明书中，术语"包掛'或其变体例如"包含"、"含有"应当理解为暗指包含所示要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤组，但并不排除任何其他的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤组。本说明书中提到的所有出版物引入本文作为参考。本说明书中包含的任何关于文件、条例、材料、装置、物品等的讨论仅用于构成本
发明内容的目的。不认为因为这些内容的任何或全部在本申请的各权利要求的优先权日期之前存在而承认它们构成现有技术基础的一部分或是本发明的相关领域的公知常识。本领域技术人员应当理解，在不偏离本发明广泛描述的精神或范围的前提下可以对特定实施方案中所示的本发明进行多种改变和修饰。因此，在各个方面应将本发明的实施方案看作是例示性的而不对限制性的。权利要求1.一种用于测定样品中分析物存在的方法，其中所述分析物的存在由当被触发时产生脉冲噪音的一种或多种触发元件的存在与否来指示，所述方法包括以下步骤(a)将所述一种或多种触发元件暴露于触发脉冲；和(b)检测由所述一种或多种触发元件产生的脉冲噪音。2.根据权利要求1的方法，其中所述触发脉冲为辐射。3.根据权利要求2的方法，其中辐射源来自闪光灯。4.根据权利要求1-3之任一项的方法，其中所述触发元件与反应性底物相互作用产生脉冲噪音。5.根据权利要求4的方法，其中所述反应性底物包含有机硝基基团功能化的有机聚合物。6.根据权利要求5的方法，其中所述反应性底物含有硝化纤维素、硝化淀粉、硝化碳水化合物例如硝基甘露糖醇。7.根据权利要求5的方法，其中所述反应性底物包含含有一定比例的乙酸纤维素的硝化纤维素材料。8.根据权利要求l-8之任一项的方法，其中所述触发元件为纳米颗粒。9.根据权利要求1-8之任一项的方法，其中所述触发元件包括直径为5-60nm的金纳米颗粒。10.根据权利要求l-9之任一项的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤-(i)将第一感受器固定在其中所述第一感受器能够与所述分析物结合的区域中；(ii)将所述样品加入所述区域中，从而当所述样品中存在分析物时，所述分析物与所述第一感受器结合；(Hi)向所述区域中加入第二感受器，其中所述第二感受器与所述分析物结合，并且其中所述第二感受器包含所述一种或多种触发元件；和(iv)从所述区域中去除未结合的第二感受器。11.根据权利要求l-9之任一项的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将第一感受器固定在其中所述第一感受器能够与所述分析物结合的区域中；(ii)向所述区域中加入分析物模拟物，其中所述分析物模拟物与所述第一感受器结合，并且其中所述分析物模拟物包含当被触发时产生脉冲噪音的触发元件；(iii)向所述区域中加入样品，从而当所述样品中存在分析物时，所述分析物与所述第一感受器结合并置换所述分析物模拟物；和(iv)从所述区域中除去未结合的分析物模拟物。12.根据权利要求l-9之任一项的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将所述样品暴露于分析物特异性底物，其中所述分析物特异性底物在分析物存在下产生所述一种或多种触发元件。13.根据权利要求l-9之任一项的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤(i)将所述样品暴露于分析物特异性底物，其中所述分析物特异性底物吸附或结合所述分析物，并且其中所述分析物特异性底物包含一种或多种触发元件；和(ii)去除未吸附或未结合的分析物特异性底物。14.根据权利要求1-13之任一项的方法，所述方法在步骤(a)和(b)之前包括以下步骤将所述一种或多种触发元件暴露于无电镀金属溶液中，其中所述无电镀金属溶液使金属沉积于所述触发元件上。15.—种能够与分析物结合的感受器，其中所述感受器用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。16.—种能够与分析物感受器结合的分析物模拟物，其中所述分析物模拟物用触发元件标记，其中所述触发元件当被触发时产生脉冲噪音。全文摘要本发明提供一种用于测定样品中分析物存在的方法，其中所述分析物的存在由当被触发时产生脉冲噪音的一种或多种触发元件的存在与否来指示，所述方法包括以下步骤(a)将所述一种或多种触发元件暴露于触发脉冲；和(b)检测由所述一种或多种触发元件产生的脉冲噪音。本发明进一步提供可用于本发明的方法中的试剂。文档编号G01N33/53GK101317092SQ200680044264公开日2008年12月3日申请日期2006年9月28日优先权日2005年9月28日发明者B·拉古斯,L·维乔雷克申请人:联邦科学技术研究组织