专利名称：获取生物源样本的图像的装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种对诸如细胞、细菌和其他生物样本的生物源样本(或标 本)发出的微光成像的方法和装置，更具体的说，本发明涉及通过对生物发 光现象产生的弱光成像而对这种样本进行观察和各种测量的方法和装置。
背景技术：
近年来，在生命科学领域的研究中越来越多的使用对生物源的样本成
像的技术，该生物源样本如细胞，具有荧光蛋白质例如GFP，和/或发光蛋 白质，例如荧光素酶、发光蛋白质通过转基因而在任意细胞中表达。可以 表达荧光或发光蛋白质，同时与细胞内另外任意的某种蛋白质(蛋白质标记) 混合，并且，如果将荧光或发光蛋白质编码基因插入或替换特定遗传调节 区域的下游侧，将仅基于特定遗传调节区域的激活而表达该荧光或发光蛋 白质。因此，至今为止，在细胞内和/或外发生的各种生物现象中，想要使 得与蛋白质表示或遗传区域的激活一起表达的荧光或发光蛋白质被观察 到，以及在使用光学显微镜检测和/或探测所观察的蛋白质或遗传区域何时 以及如何表示，和/或得到的蛋白质在细胞内和外将如何表现，就使用这种 荧光或发光蛋白质作为报告分子或探针分子。
荧光蛋白质，诸如GFP在细胞内相对稳定，且从中发出的荧光明亮， 因此广泛使用这些蛋白质来稳定和简便地执行细胞内结构的成像(例如，参 见Mason(1999年)Fluorescent and luminescent probes for biological activity,
第二版)。另一方面，诸如荧光素酶的发光蛋白质通过化学发光和/或生物发 光现象发光而没有激励荧光染料的激发光(激发光通常对于细胞或其他生 物样本有害)。因此，对于在光学显微镜下观察期间，期待发光蛋白质作为
一种探头对生物样本成像而不对其形成伤害，并且也报道了 一些使用这种 发光蛋白质的成像技术的例子。例如，Rutter等人通过使用光子计数摄像机 在单个活细胞中对荧光素酶的基因表达成像，观测到在胰岛素发出的信号
中包括MAP致活酶(Rutter, White, Tavare (1995年)"Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non-invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells" Current Biology Vol. 5 890-899.)。 Sternberg 等人也报道了使用光子计数摄像机和冷却CCD摄像机探测生物发光 (Sternberg, Eberl， Kongsbak, Molin (1997年),"Detection of bioluminescence from individual bacterial cells: a comparison of two different low-light imaging system" J. Bioluminescence and Chemiluminescence Vol. 12: 7-13.)。此夕卜， Takasuka等人也报告通过使用光子计数摄像机在单个活细胞中对荧光素酶 的基因表达成像观察到泌乳刺激素促进剂活性的动态变化(Takasuka, White: Wood, Robertson, Davis (1998年)，"Dynamic changes in prolactin promoter activation in individual living lactotrophic cells" Endocrinology Vol, 139: 1361-1368.)。
如上所述，在对上述细胞内基因表达的荧光和/或发光蛋白质成像时， 该荧光蛋白质的荧光相对较亮，因此通过成像系统中配备的常规光学显微 镜可以获得它们荧光的相对清楚的显微镜图像。然而，来自细胞或其他生 物样本(此后称作"细胞等")的发光蛋白质的光强通常非常弱或细微，因此很 难使用用于正常显微镜图像的摄像机和成像系统获得发光的显微镜图像 (实际上，通常通过人眼不能观察到发光蛋白质的发光)。因此，在对发光蛋 白质成像的常规系统中，专用于探测微光的摄像机或图像采集设备，诸如 超高灵敏度摄像机或光子计数摄像机被安装到光学显微镜上(但是，即使具 有超高灵敏度摄像机，还是需要在摄像机的光接收面上对来自样本的光积 分至少数分钟或数十分钟以产生一幅图像)。
以此方式，在光学显微镜的荧光或发光观察中，显微镜图像中的光原 理上仅是蛋白质发出的光。因此，在样本中没有蛋白质存在的区域中的条 件或形态是不能观察到的。在观察荧光蛋白质的情况下，然而，可以观察 到细胞的形态和条件等，因为它们具有相对较亮的荧光，并且由于应用了 激发光而来自细胞内荧光蛋白质之外材料的自荧光发射等。另一方面，在 发光蛋白质的发光观察的情况下，来自样本的光，诸如来自发光蛋白质的 光非常微弱，以至于不能产生图像，除非将其积分若干至数十分钟，并且， 在发光蛋白质之外没有材料发射光的情况下，就很难获得在样本中细胞等
位置、形态以及这些改变(在没有光的区域不能知道是否有细胞存在)。然而， 在观察期间，尤其是长时间观察活细胞样本等时，光强会变化，和/或细胞 会移动或变形，并且因此很难确定哪个细胞或细胞的哪个部分发光。例如， 很难分析细胞质中发光改变现象以及某些神经细胞中的神经突起。
在一些现有技术中，为了观察细胞等的位置和形态，与发光蛋白质的 发光观察一起执行透射光观察。在此情况下，然而，透射光观察和发光观 察中摄像机光接收面上的光量非常不同。因此，对于透射光观察和发光观 察，使用不同摄像机(使用不同的物镜)，并且由此不同的摄像机分别产生发 光图像(来自发光蛋白质的光的图像)和照明图像(透射光的图像)。因此，显 微镜图像示出细胞的形态等，且在不同的图像上创建出示出发光蛋白质的 分布的显微镜图像，这就使得很难精确确定样本中发光蛋白质的实际分布 或位置(通常，摄像机对于透射光观察和发光观察的视场的尺寸和/或位置会 偏移，并且在这种情况下，在样本中确定发光蛋白质的实际分布和位置就 变得更困难)。此外，在一次观察很多细胞的时候，不容易找到与照明图像 中细胞对应的、发光图像中对应的发光细胞。
在上述使用发光蛋白质的"发光成像"中，如果可以探测或限定样本中 发光蛋白质的分布，同时获得同一样本中细胞的形态和/或条件等，就可以 加宽"发光成像"的应用范围，并且将在对于各种生物过程中涉及的反应等 的分析中变得有用。如上所述，然而，在现有技术中，由于发光蛋白质的 光很微弱且在样本中不包括发光蛋白质的区域没有光，就很难关于某些细 胞中什么位置和/或样本中哪个细胞表现出发光蛋白质的信息，尽管可以探 测样本中发光蛋白质表示的存在或不存在。实际上，通过超高灵敏度图像 探测元件，可以执行弱光探测，但是在此情况下，可以获得的图像仅仅是 镶嵌图像，并且因此很难执行详细分析，同时限定其中要测量发光量的区 域。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种装置和方法，用于对上述生物 发光现象产生弱光的细胞和/或其他生物样本成像，其中以这样的方式获得 细胞等的发光图像，其中可以确定发光细胞和/或细胞中的发光位置。 本发明的另一个目的是提供这样一种方法和装置，其可以从特定区域 获取数据，并且在细胞中用于分析各种现象。
根据本发明的一个方面，通过光学成像装置获得生物源的样本图像的 装置的特征在于该装置包括照明部分，用于照射样本；照明图像获取部 分，用于获得样本的照明图像；发光图像获取部分，其获取样本中细胞的 发光图像；以及图像处理部分，用于叠加照明图像和发光图像，以产生叠 加图像，并确定或指定叠加图像中所分析区域。在此结构中，通常光学成 像设备可以是光学显微镜。在此情况下，照明图像是在光学显微镜下使用 来自照明部分的照明光通过执行透射光观察获得的透射光显微镜图像，且 发光图像是通过光学显微镜观察细胞内发光现象获得的发光显微镜图像。 该照明图像获取部分和发光图像获取部分优选包括共用的显微镜图像采集 设备，通过该设备采集透射光显微镜图像和发光显微镜图像。
根据上述结构，通过观察样本细胞中的发光现象获得的发光图像与通 过照明样本获得的照明图像相叠加，因此其中细胞的形态和/或条件等可以 被观察到，并且因此，可以比以往更加精确的在样本和/或细胞中定位发光 图像中细胞的发光位置。尤其是，通过通用显微镜图像采集设备获得照明 图像(透射光显微镜图像)和发光图像(发光显微镜图像)时，叠加图像就变得 非常容易。甚至在观察区域中具有类似形态的很多细胞的时候，其中通过 观看将发光图像与照明图像叠加得到的、示出样本中细胞形态的图像，可 以立即确定发光的细胞，并且因此，在图像中要观看的区域，即分析发光 现象中要监视的区域等(分析区域)就很容易被找到。此外，可以在发光图像 中获得样本的条件，因此，甚至在细胞移动和/或变形的时候，可以容易地 判断哪个细胞、在何处或如何移动和/或变形，并且相应的，可以容易地发 现发光如何变化。此外，依照本发明的结构，尽管仅通过在发光图像中观 察，在样本的细胞密度中很难区别随机发生的多个细胞的重叠，但是可以 指定具有适当细胞密度的区域并随后判断是否存在重叠细胞，由此使得可 以更精确的分析发光量。
在本发明的装置中，如上所述，要彼此叠加的透射光显微镜图像和发 光显微镜图像优选通过共用显微镜图像采集设备采集。此时，依照本申请 发明人的研究，已经知道，在显微镜图像采集设备的光接收面上形成样本
图像的物镜和光学显微镜的透镜组件设计为使得物镜的数值孔径(NA)与投 射在光接收面上的样本图像的放大率((3)之间比率(NA/p)的平方值为0.01或 更大，使用诸如CCD摄像机的图像采集设备仅从单个细胞发出的光可产生 图像(参见日本专利申请No.2005-267531)。此外，令人惊讶的，此成像条件 可以用于所有源于生物样本的成像，而其在过去很难成像，并且已经知道 即使是在光学显微镜下眼睛很难直接看到的微弱的发光分量，诸如生物发 光，细胞的图像等可以在较短时间段内获得(例如20分钟)。此外，依照发 明人研究的光学条件，已经知道在图像采集设备物镜的数值孔径(NA)/投影 图像的放大率(P)的平方值表示的光学条件是0.071或更高的时候，可以在1 到5分钟的短时间内进行成像，使得可以获得甚至在图像分析中可用的细 胞等的图像。因此，在本发明装置的一个实施例中，通过设置显微镜图像 采集设备的光接收面和物镜以及透镜组件，以将其NA/p的平方值设置为 0.01或更高，更优选的为0.071或更高，就可以创建透射光显微镜图像和发 光显微镜图像的更好的叠加图像。
此外，在本发明的装置中，还可以提供获取细胞荧光图像的荧光图像 获取部分。在光学成像设备是光学显微镜的时候，荧光图像是用光学显微 镜执行样本荧光观察获得的荧光显微镜图像。同样在此情况下，荧光显微 镜图像和发光显微镜图像可以通过共用显微镜图像采集设备获得。本领域 技术人员公知的，在荧光观察中，通过使用对环境条件诸如pH、 Ca浓度 或膜电位等敏感的各种荧光染料，可以探测各种细胞间的反应。因此，应 该理解，将这种荧光观察获得的荧光图像和发光图像结合可以揭示细胞中 发光位置与各种细胞内现象间的关系。需要说明，样本中细胞形态等与发 光位置间的空间关系可以通过叠加发光图像和照明图像而容易地获得，并 且，依照此特征，还可以进一步增加结合发光图像和荧光图像的用处。
在本发明装置的一个实施例中，可以提供显示叠加图像的显示部分， 以给用户容易地在显示部分上观看样本中或细胞中的发光位置。此外，在 本发明的装置中，可以提供记录部分来记录叠加图像，用于图像的分析和 显示。
另外，如上所述，在观察细胞发光中，尤其对转基因表达的诸如荧光 素酶、发光蛋白质的发光蛋白质的发光成像的过程中，将发光蛋白质基因
引入细胞，使得表达相应的发光蛋白质，同时与任意的蛋白质(观察对象) 混在一起，或者，该基因可以被替换、或插入遗传调控区的下游侧，并因 此将得到的表达的发光蛋白质用作报告分子，用于探测何时何地表达测量 中的任意目标蛋白质。这样，在细胞接收各种激励之一的时候，在细胞中 经常通过发光蛋白质表达要报告的蛋白质。因此，在本发明装置的一个实 施例中，可以提供用于给细胞提供任意激励的细胞激励供给部分。例如， 该细胞激励供给部分可以包括至少一个从具有以下部分的组中选出的部 分试剂供给部分，给细胞提供试剂；温度调节部分，用于调节样本的温 度；以及气体供给部分，用于给细胞提供气体。
此外，在一个实施例中，本发明的上述装置可以是获取生物源的样本 的图像的装置，包括光学显微镜；显微镜图像采集设备，用于采集光学显 微镜观察的显微镜图像；以及图像处理设备，用于获得显微镜图像作为图 像数据并执行图像处理，其特征在于该图像处理设备包括图像叠加部分， 用于通过叠加透射光图像和发光图像产生叠加图像，其中在光学显微镜下 用显微镜图像采集设备在样本的透射光观察中采集样本图像获得透射光图 像，以及通过用显微镜图像采集设备对样本中细胞内发光现象发出的光进 行采集获得发光图像；还包括图像区域指定部分，用于指定叠加图像中的 分析区域。在此装置中，^t选的，该显微镜图像采集设备具有光接收面， 且该光学显微镜包括物镜和透镜组件，其在显微镜图像采集设备的光接收 面上形成样本的图像，其中将光学显微镜的光学系统构建为使得物镜的数 值孔径与在光接收面上投影样本图像的放大率之间的比率的平方值为0.01 或更高。
根据本发明的另一个方面，提供一种利用光学成像设备获取生物源的 样本的图像的方法，包括下面的步骤照射样本并获取其照明图像；不照 明样本获得样本细胞中发光现象发出的光的发光图像；叠加照明图像和发 光图像以产生叠加图像；确定叠加图像中的分析区域。根据本发明的方法， 如上装置所述的，可以产生照明图像和发光图像的叠加图像，并且由此执 行发光现象的分析，其中在照明图像中出现的样本或细胞中获得找到发光 的区域。这样，可以用上述装置执行本发明的方法，但是也可以用其他任 意的设备进行。此外，在本发明的方法中，可以执行在样本细胞中获取荧
光图像以及发光图像和照明图像的步骤，并且因此可以将发光现象与从荧 光获得的信息关联起来，同时获得在细胞或样本中哪里发生发光现象。
在上述方法中，以及在上述装置中，光学成像设备可以是光学显微镜。 此时，照明图像是使用光学显微镜执行透射光观察获得的透射光显微镜图 像，且发光图像是用光学显微镜观察样本细胞中发光现象获得的发光显微 镜图像，其中优选的是，通过通用显微镜图像采集设备采集透射光显微镜 图像和发光显微镜图像。此外，在光学显微镜中，优选将在显微镜图像采 集设备的光接收面上形成样本图像的物镜和透镜组件设计为使物镜的数 值孔径与在光接收面上投影样本图像的放大率之间的比率的平方值为0.01 或更高。
在一个实施例中，例如在长时间对发光现象成像时，照射样本并获取 照明图像的步骤执行多次，因此可以任意检査样本中细胞等形态的改变和/ 或位置的移动等。此外，在其细胞内基因中要观察的细胞结合了给细胞提 供某特定激励如试剂激励、电激励、气体激励或热激励而表达的发光蛋白 质基因时，有选择的给细胞提供上述至少一种激励的步骤可以在获得照明 图像和发光图像(或还可以获得荧光图像)的步骤之前进行。此时，为了在提 供激励前检査条件，优选将获得细胞照明图像和发光图像的步骤在提供细 胞激励之前进行。
此外，获得一系列上述各种图像以及叠加照明图像和发光图像的步骤 之后，可以执行显示和/或记录照明图像和发光图像的叠加图像的步骤，以 允许用户检査图像和/或随后执行任意处理。
此外，可选的，在指定分析区域之后，为了详细检查或观察分析区域 的条件，可以执行显示对应于分析区域的照明图像区域，对应于分析区域 的发光图像区域以及对应于分析区域的荧光图像区域中至少两个(在也需 要荧光图像时)的步骤。在发光现象的分析中，可以执行测量发光图像中与 分析区域对应的区域的光强的步骤和显示该光强改变的步骤。
从上面的描述可以知道，在发光图像中，通常样本中没有发光蛋白质 的区域条件是本质上不能观察的，且图像采集设备或摄像机中观察的光很 微弱，因此，即使可以探测发光蛋白质的发光现象，也很难正确获得样本 中何处出现发光现象。依照本发明的装置和方法，产生通过叠加照明图像
和发光图像获得的图像，因此可以分析发光现象同时获得样本中出现发光 的位置。根据本发明的特征，由于发光细胞和非发光细胞分别可以从照明 图像和发光图像的叠加图像中立即确定，就可以对观察到发光的细胞数量 以及没有观察到发光的细胞的数量执行任意统计分析。此外，与现有技术 相比，可以容易地执行仅监视发光细胞的发光强度的随时间的观察。例如， 在测量过程中样本内细胞移动时，就可以跟踪照明图像和发光图像的叠加 图像中的发光细胞。过去，在增加显微镜物镜的放大率的时候，由于增加 了物镜的放大率，来自发光位置的信号相对减少，因此可能错过发光位置。 然而，根据本发明，由于可以在发光图像和照明图像的叠加图像上确定样 本的发光位置，就减少了失败，例如错过发光位置。
可以说，上述的本发明增加了在细胞和/或其他生物样本成像中发光蛋 白质的用处。根据本发明，过去仅对报告分子使用发光蛋白质以光谱执行 的、对细胞内各种蛋白质的表达的各种试验、测量和分析，可通过成像来 进行，其中标识了各个细胞。
本发明的其他目的和优点通过下面的说明将变得显而易见。
图1A是示意图，示出微光测量装置第一实施例的结构的概况，其包括 依照本发明的反转的光学显微镜，且图1B是图1A的样本容器附近的结构 的详细的示意图，包括给样本中的细胞提供激励的设备；
图2A以功能框图的形式示出微光测量装置的计算机80的结构(图像处 理设备)，且图2B示出与计算机80连接的控制面板的示意图3以流程图的形式示出本发明获得生物源样本图像的方法的步骤， 其通过本发明的微光测量装置进行；
图4示意示出在NIH3T3细胞中观察的发光强度的周期性变化，其中 通过将荧光素酶基因连接到具有时钟基因结合其中的表达载体，来表现出 质体。在24小时的周期中当发光变得很微弱的时候(a)，就不能获得发光的 图像；
图5示出本发明微光测量装置的第二实施例的结构(光学系统)的示意 图，其同时执行荧光和生物发光测量；
图6是本发明微光测量装置的第三实施例的结构(光学系统)的示意图， 其同时执行荧光和生物发光测量，以及分别进行数字变焦和光学变焦的图 像扩展；
图7是说明将要引入用作例子1的样本Hda细胞中的质体中预计的分 子条件的图，质体中将荧光素酶基因连接到具有四环素操纵子(Tet02)的表 达载体。如图7A所示，将TetR同型二聚体与Tet02区域结合时，不表达 连接到Tet02的荧光素酶基因。另一方面，在给细胞四环素时，TetR同型 二聚体结构改变并且与Tet02区域分开，如图7B所示，导致表达荧光素酶；
图8是示出例子1中添加四环素和曝光照明图像和发光图像的时间；
图9A、 9B和9C的每个示出例子l中获得的照明图像、发光图像以及 叠加图9A中照明图像和图9 B中发光图像得到的图像(图9A的框内的扩展 图像)。在图9C中，表示为ROI-l和ROI-2的方框指定为分析区域；
图10示出图9C中指定的分析区域中(Hela细胞)发光强度随时间变化 的图IIA、 11B和11C的每个示出例子2中获得的照明图像、发光图像 以及叠加图IIA中照明图像和图11B中发光图像得到的图像。发光位置在 实际的装置中通过伪彩色显示，但是，图11C中以白色显示；
图12为示出图11中PP-1区域中发光细菌的发光强度随时间变化的图13A、 13B和13C的每个示出例子3中获得的照明图像、发光图像 以及叠加图13A中照明图像和图13B中发光图像得到的图像；
图14是示出例子3中随时间进展的发光细菌移动的叠加图像(左)和照 明图像(右)；
图15是例子3中发光细菌(V.t.)的发光强度随时间变化的图。 最佳实施方式
下面，对参照附图的若干优选实施例详细说明本发明，其中相同参考 标记表示相同的部件。
本发明装置的第一实施例 装置的结构
图1A是本发明第一实施例优选装置的示意图，其获取生物源样本的图
像，以测量生物发光现象产生的微光，并执行细胞和/或其他生物样本的成 像。(此后称作"微光测量装置")。
参照附图，本发明的微光测量装置包括反转的显微镜，包括光源2、照 明光学系统l，使得光源2发出的光成为平行束并引导得到的束到样本4、 观察光学系统5，用于形成样本4的图像、以及目镜6，用于扩展样本4的 图像进行眼睛观察；CCD摄像机8(图像获取部分或显微镜图像采集设备)， 具有图像传感器7，用于采集样本4的显微镜图像；以及计算机80(图像处 理部分或图像处理设备)，具有TV监视器，CCD摄像机8通过信号线81 连接到计算机。
光学显微镜的结构
上述光学显微镜的结构可以是正常的反转显微镜，其中从光源2开始 以所描述的顺序，照明光学系统1构建有会聚透镜10、偏转镜12，用于偏 转照明光的光轴ll、以及会聚透镜14。光源2可以是相干光源，具有可见 范围内的波长，诸如卤素灯、LED光源、钨灯、水银灯等。此夕卜，来自相 干光源的光诸如激光，并通过漫射片等转换成非相干光，还可以用作光源2。 尽管光源的波长通常在可见光范围内，也可以使用红外光。
观察光学系统5构建为具有物镜15，用于形成样本4的图像、第一中 继透镜16、偏转镜17，用于偏转来自物镜15的光以及第二中继透镜18， 与第一中继透镜16结合用于将来自物镜15的图像(样本4的图像)形成到成 像面上。在第二中继透镜18和成像面19之间，转换(change over)镜20可 以安装为使得任意改变样本4的图像在眼睛通过目镜6观察和通过CCD摄 像机8观察之间的观察路径。此时，对于转换镜20，不必使用机械转换的 类型，可以使用半反半透镜将光路分成两个。
在上述结构的样本透射光观察中，以Koehler照明源照射样本4，如正 常光学显微镜观察透射光的情形一样。因此，来自光源2的光首先通过会 聚透镜IO变为平行光束，并导致照射样本4，同时在聚光透镜14的光瞳位 置形成光源2的图像。随后，照射样本4的光通过样本4进入物镜15以在 成像面19上通过第一中继透镜16和第二中继透镜18形成样本图像，且在 成像面19上得到的样本4的图像通过目镜6被观察者观察到。此外，在 CCD摄像机8采集样本4的图像时，通过第二中继透镜18的光被转换镜
20反射，并由此样本4的图像形成在CCD摄像机8的图像传感器7上。 此时，物镜的放大率可以例如为20倍。
如图所示，样本4设置在样本台3上，其中优选如图1B详细所示，样 本4可以和培养基一起放置到样本容器21中，该容器诸如具有盖子26的 试验盘。样本容器21的底部由具有与用于显微镜的0.17mm厚度的光学透 明盖玻璃一样的特性，因此样本容器21的底部的样本可以使用正常物镜观 察到(此时，样本容器21不限于这种试验室盘，以及可以使用载片、微片 等)。此外，为了保持样本容器21中的潮湿，样本容器21可以置于水浴22 中，其中通过管嘴23提供纯净水，并且与水浴22—起通过有盖的关闭容 器30保持。随后，如图1B详细所示，通过供气管24以及来自测量设备之 外的气缸25的Co2管嘴84将Co2气体供给水浴22的上表面。气缸25中 的气体例如5%0)2和95%02混合气体。供应Q)2气体到盖上的关闭容器30 的流速是约50mL/min。此外，加热片27可以设在样本容器21下面。该加 热片27通常以温度控制器(未示出)通过0.5°C的步幅调整样本容器内的温 度。
此外，如随后所述，为了通过激励细胞执行产生发光现象的试验(使得 表达发光蛋白质)，可以设置自动分配设备100，作为给细胞激励的装置。 在自动分配设备100中，泵102从试剂容器101获得试剂溶液并使用管嘴 103将预定量的试剂溶液释放到样本容器21中。如图所示，在将样本容器 21放到盖上的关闭容器30中时，优选的，在从管嘴103释放试剂溶液前， 关闭容器30的盖31和样本容器的盖26通过马达(未示出)打开，与自动分 配设备100协调操作，在释放溶液后，盖131和样本容器盖26通过马达关 闭。此时，在下述的计算机控制下，自动分配设备100可以在获取显微镜 图像前后和/或在其间的任意时间操作。
此外，在样本台3上，优选的，为了任意水平移动样本台3(X方向和 Y方向)，两个步进马达沐示出)分别安装为彼此方向分开90。。两个步进马 达可以基于计算机90的指令通过样本台控制器(未示出)而驱动，使得自动 控制样本台3的定位。
此外，优选的，在样本台3下的物镜15周围，可以安装物镜加热器28 与物镜15接触，因此可以在温度调节设备(未示出)的控制下通过步进间隔
0.5°C以物镜加热器28调整物镜15的温度，因此物镜15外部将保持在任 意温度。同样，在物镜加热器28周围，配有"Z轴物镜驱动机构9"，用于 自动沿Z轴(光轴方向)运动物镜15。 Z轴物镜驱动机构9通过齿轮齿条机 构(未示出)上下移动物镜15。通过计算机控制的步进马达(未示出)执行齿轮 齿条机构旋钮的旋转操作。或者，Z轴物镜驱动机构9可以是摩擦辊机构。
显微镜图像采集设备的结构
CCD(电荷耦合器件)摄像机8用于接收样本4的图像，其中的图像传感 器7可以具有例如1360x1024个像素。在本发明的设备中，如下所示，CCD 摄像机8采集通过样本4的透射光观察获得的透射光显微镜图像，和通过 样本4的发光观察获得的发光显微镜图像，即观察由于样本4中细胞发光 现象发射的微光。因此，CCD摄像机8作为光探测器采集发光观察中的微 光，优选选择具有尽可能高灵敏度的探测器。因此，对于CCD摄像机8优 选使用致冷CCD，在其底部配备有具有Peltier器件的冷却系统29，其可以 将摄像机的温度降低到+5。C到-70。C的范围内，以抑制来自CCD摄像机8 的暗电流。此外，优选在CCD摄像机8的光接收面上安装红外截滤波器 13，以截止作为背景光的红外照射。CCD摄像机8采集的图像通过信号线 81传送到计算机80并在与其连接的TV监视器37上显示。此夕卜，CCD摄 像机8可以是3板型彩色摄像机，以釆集彩色照明图像。对于显微镜图像 的图像采集设备，例如，可以使用CMOS图像传感器、SIT摄像机等。
图像处理设备的结构
计算机80可以构建为具有CPU的计算机，并可以进行任意类型的本 领域技术人员公知的各种图像处理。计算机80控制本发明的微光测量装置 的各个部分的操作，以获取显微镜图像作为图像数据，并且还执行从透射 光观察获得的照明图像和从发光观察获得的发光图像产生叠加图像，以及 使用该图像数据的各种处理，诸如使用叠加图像确定分析区域。
图2A表示功能块形式的计算机80。参照附图，计算机80包括CPU 35、 存储器41，用于存储控制CPU35操作的控制程序、信号处理电路33以及 数字变焦电路34，用于转换CCD摄像机8采集的图像为图像数据、显示
控制电路36和TV监视器37，用于显示CCD摄像机8采集的图像、记录 和再现控制电路38以及记录介质39的驱动器，用于记录和/或在TV监视 器37上显示CCD摄像机8采集的图像和/或通过图像处理获得的图像、以 及控制面板40，用于输入用户的命令。在控制面板40上，如图2B所示， 提供各种类型的按钮，诸如再现按钮43、记录按钮47、快门按钮44、变焦 放大按钮42、变焦縮小按钮143、十字光标按钮45、以及模式开关48，以 及由此通过与CPU 35连接的控制面板40，将用户的命令输入计算机80。
在上述结构中，形成在CCD摄像机8的图像传感器7上的样本4的显 微镜图像通过图像传感器转换成模拟电信号，即模拟图像信号。得到的信 号随后在CPU 35的控制下传送到信号处理电路33，其中对于图像信号执 行放大处理、滤波处理和/或如边缘增强的任何图像处理。随后，处理的图 像信号发送到数字变焦电路34(数字信号处理部分)。数字变焦电路34对来 自信号处理电路33的模拟图像信号执行A/D转换以产生数字图像信号，并 且在任何数字处理之后按照需要执行诸如gamma校正，得到的数字图像信 号传送到显示控制电路36，用于在TV监视器37上显示图像，以及传送到 记录和再现控制电路38，用于记录图像数据到存储槽(未示出)中的可拆卸 的记录介质39上(例如，存储卡、硬盘、磁盘、磁光盘等)。此时，本发明 装置的数字变焦电路34设计为可以剪切整个CCD摄像机8的釆集像素区 域内的任何区域，并传送剪切的图像区域到显示控制电路36或记录和再现 控制电路38，同时以任意放大率将其放大。因此，可以在TV监视器37上 仅显示CCD摄像机8采集的部分被放大的显微镜图像，和/或仅记录该部 分图像。
此外，在上述结构中，记录和再现控制电路38可以设计为响应于来自 CPU 35的再现控制信号读取当前记录到记录介质39中的数字图像信号， 且该读出数字图像信号可以通过显示控制电路36输入TV监视器37中， 因此可以在TV监视器37的屏幕上显示样本4的记录图像。
操作上述图像处理设备时，在用户打开控制面板上的记录按钮47时， 本发明的装置执行记录模式，其中CPU 35提供记录控制信号给记录和再现 控制电路38。随后记录和再现控制电路38响应于记录控制信号记录从数字 变焦电路34提供的图像信号到记录介质中。另一方面，打开再现按钮43
时，本发明的装置开始再现模式，其中CPU35提供再现控制信号给记录和 再现控制单元38，其在TV监视器37上显示上述记录的图像数据。此夕卜， 在模式开关48设置为图像采集模式时，来自CPU 35的控制信号就响应于 推动快门按钮44输出到数字变焦电路34，且此时来自CCD摄像机8的一 帧图像就经受数字信号处理并结合到存储器41中。随后，结合到存储器41 中的图像数据通过任意压縮电路进行压縮，并通过卡读取器/写入设备记录 在存储卡上。
在数字变焦电路34上执行的CCD摄像机8获得的整个像素区域内任 意区域的剪切设置通过使用变焦放大按钮42、变焦縮小按钮143和十字光 标按钮45来执行。在图像区域的剪切设置中，在TV监视器37上显示表 示数字变焦电路34要剪切的图像区域的中心的"变焦中心位置"以及图像区 域的框。允许用户操作十字光标按钮45来设置变焦中心位置在任意位置， 同时观看TV监视器37，并且还允许通过变焦放大按钮42和变焦縮小按钮 143来确定要剪切的图像区域的尺寸。从剪切过程获得的图像的放大率可以 在M= l.OO(CCD摄像机采集的整个区域)到4.00(CCD摄像机采集的整个区 域的l/4)的范围内任意设置。
此时，上述图像的放大可以通过调整显微镜的光学系统来进行(光学变 焦)，而不使用数字变焦电路34。例如，通过步进马达的马达驱动，沿着光 轴偏移CCD摄像机8和第二中继透镜18间的焦距进行这种光学变焦。此 外，在执行光学变焦的透镜结构中(变焦透镜)，使用三个可变放大率的透镜 组、执行像差补偿的补偿透镜组等、以及执行对焦调整的会聚透镜(未示出)， 透镜的焦距可以分10步手动或自动变化。可以执行驱动变焦透镜，使得安 装在变焦透镜周围的变焦马达(超声波马达)基于CPU 35输出的控制信号而 操作，以沿着光轴移动变焦透镜。
此外，为了控制自动分配设备100和照射设备82(包括光源2)的操作， 计算机80可以连接到这些设备从而获得CCD摄像机8采集的图像信号可 以与通过自动分配设备100的分配操作的执行同步进行。
通过第一实施例的装置对样本的观察和测量
如上所述，在发光蛋白质的发光现象测量中，其发光强度很弱，因此
很难用CCD摄像机探测光信号，且通常不能观察到细胞的内部结构。因此， 不可以像显微镜正常的观察中一样，调整物镜的焦点同时检查样本中观察 的细胞。因此，发光观察中物镜的焦点位置基于用显微镜透射光观察中获 得的样本照明图像而确定，其中用来自诸如卤素灯的光源的光通过照明光
学系统照射样本。例如，通过设置物镜的焦点位置为在增加生物发光蛋 白质发光强度的时候，物镜在透射光观察中获得高对比度图像的位置和在
CCD摄像机上获得汇聚的清楚的发光图像的位置之间的光轴上的近似中间 位置。此后，将说明使用上述本发明的装置对发光蛋白质的发光进行成像 的成像方法。
图3以流程图示出本发明发光成像的方法中的处理过程。参照附图， 首先，样本4(细胞等)和培养溶液放入试验盘中(样本容器21)，其随后设置 在装置中(步骤l)，且打开照明光(步骤2)。随后，在CCD摄像机8的图像 传感器7的光接收面上形成通过物镜15的样本4的显微镜图像，且用来自 图像传感器7的信号获得样本的照明图像(步骤3)。下面，在获得的照明图 像上指定所需区域，即具有适当细胞密度的区域(步骤4)。此后，台移动以 偏移具有适当细胞密度的指定区域到视场的中心(步骤5)。随后，照明图像 的数据存储到存储设备中(步骤6)，且关闭照明(步骤7)，并且随后完成第 一照明图像的获取。
下面，为了在样本的细胞内表达发光蛋白质，以激励细胞的装置来激 励细胞。激励细胞的试剂可以通过自动分配设备提供(步骤8)。此时，在台 上，在步骤8之后完成照射步骤，且得到的照明图像数据可以保存到存储 器件中(步骤9)。随后，不通过照射，获得发光信号(步骤IO)并保存到存储 器件中(步骤11)，且由此完成第一发光图像的获取。随后，对于获取发光 图像重复步骤10和步骤11直到预定时间、预定发光强度或完成了预定次 数上述过程的执行。此时，可以以这样的方式执行这些处理，其中照明图 像获取和发光图像获取成对，或者，每执行预定次数的发光图像获取，执 行一次照明图像获取。对于细胞的活性、测量的条件等以适当的方式执行 这些图像获取。
在完成照明图像和发光图像获取之后，产生照明图像和发光图像的叠 加图像并在图像处理设备(计算机80)中显示(步骤12)。通过参照得到的照
明图像和发光图像的显示的叠加图像可以确定发光细胞，并且因此，即使 在测量期间移动了也可以容易地指定某些细胞。
下面，判断在叠加图像内是否可以分辨细胞内发光位置，以及如果可 以分辨发光位置(步骤13:是)，指定测量区域(步骤15)。测量区域可以通 过任意装置在监视器上指定，诸如鼠标、光标或指针等，其可以通过手动 操作或通过执行其中阈值进行各种改变的图像处理来限定屏幕上的区域。 例如， 一个细胞可以指定为一个测量区域，且细胞的一部分也可以指定为 一个测量区域。
另一方面，在很难分辨细胞中发光位置的时候(步骤13:否)，就在以
伪彩色显示CCD摄像机的输出之后指定测量区域(步骤14)，因此将发光绘 制为容易可见(步骤15)。此时，例如， 一个细胞可以指定为一个测量区域， 并且细胞内的部分还可以指定为一个测量区域。此时，不仅可以在激励如 细胞的分析对象之前指定区域，还可以在之后进行，并且，基于激励之后 获得的发光图像或照明图像，要测量的区域可以偏移到存在可以进行适当 测量的对象的区域。如果一区域在选择激励的时候没有很微弱或很小的发 光，要测量的区域就可以改变到其中可以探测到适当发光的区域。或者， 在激励的时候具有微弱或没有发光的所分析细胞中，响应于激励增加发光 量的细胞可以被指定为要分析的对象，并且随后，可以选择性地跟踪探测 的对象用于数据获取和分析。
此外，随时间变化的发光强度可以以动画形式显示，或数字化并以图 表形式显示(步骤16)。这样，最后执行分析(步骤17)。详细的说，使用得 到的数据，执行比较每个细胞的发光强度、比较一个相同的细胞内各个位 置的发光强度、确定细胞的发光模式、比较发光模式随时间的变化等。从 这些结果，可以分析细胞对于试剂、电、气体和热激励的反应。此外，还 可以在不执行激励的时候分析细胞的活动。
根据本发明的使用，例如，如图4所示，在观察发光强度周期性变化 的样本时，即使发光消失也可以观察所需细胞发光强度的变化，而不错过 在发光消失前和后所关心的细胞，因此，可以指定某些细胞并连续追踪其 发光强度。
本发明装置的第二实施例
图5示意性地示出本发明装置的第二实施例，其中将执行荧光观察的 结构进一步添加到本发明第一实施例的图1所示的微光测量装置中。
参照附图，在本发明第二实施例的装置中，其中与第一实施例的装置 类似，数字变焦和/或光学变焦同时执行，用于激发光的光学系统49被添 加到其中，并且将观察光学系统5修改为使得来自样本4的荧光被引导到 CCD摄像机中。
用于激发的光学系统49构建有激发光源50、准直透镜51、偏转镜52 以及可切换二向色镜53。激发光源50通常是氩激光器，具有10mW的输 出功率和488nm的波长。此时，激发光源50可以是可见范围内的气体激 光器，诸如氦氖激光器。激光通过准直透镜51转换成圆形平行束，具有特 定束宽，在偏转镜52上反射，并进入安装在观察光学系统5中的可切换二 向色镜58。
可切换二向色镜58具有反射激发光源50的激光波长的光并透过样本4 的荧光和发光信号的谱的谱特征。因此，进入观察光学系统5的激光在可 切换二向色镜53上反射，并随后从其底部进入物镜15，朝向样本容器21 中的样本4汇聚并激发样本4中的荧光分子。此时，可切换二向色镜58安 置在保持器中(未示出)，并且根据激发激光的波长波动而可交换地安装。此 外，如果不需要改变激发光源50的波长，可以安装常规的二向色镜替换使 用可切换的二向色镜58。
对于物镜15，可以使用具有高NA(数值孔径)，例如0.9或1.0或更高 的浸液型物镜。在从样本4发出并且进入物镜15的荧光信号和发光信号穿 过装置的观察光学系统5时，这些信号穿过可切换二向色镜58，前进到第 一中继透镜16和第二中继透镜18，并在切换镜20上反射，并最终在CCD 摄像机8的图像传感器7的光接收面上形成各图像。随后，在第一实施例 的装置中，来自CCD摄像机8的光信号被发送到计算机80，其中显示并 分析该发光图像，执行发光强度随时间的测量和信号分析等，且得到的分 析结果在计算机80的TV监视器37的屏幕上显示。
可以用本领域技术人员公知的方式进行荧光观察。例如荧光观察中使 用的荧光染料可以是罗达明绿(RhG); TMR(四甲基异硫氰酸罗达明)和
5-Tamra(5-羧基四甲基异硫氰酸罗达明)。为了激发TMR和5-Tamra等，波 长514.5nm的氩激光器和波长543.5nm的氦氖激光器等可以用来分别激发 激光源。此外，FITC(荧光素异硫氰酸酯)，TOTOl，吖啶橙、得克萨斯红 等可以用作荧光染料。
本发明装置的第三实施例
图6示出本发明的微光测量装置的另一个实施例的示意图，其可以进 行数字变焦或光学变焦，以及如图5装置一样同时进行测量荧光和生物发 光。
参照附图，在实施例中，测量设备本身即光学显微镜封闭在隔光盒54 中，其中隔光盒54的底部通过障碍物56固定在底盘55上，且由此该盒设 计为防止外部光进入观察光学系统5。在隔光盒54的上表面，安装分离的 阻光盖57，且阻光盖57的一端通过铰链58连接到隔光盒54的主体上，使 得可以旋转开关该阻光盖57。
为了获取照明图像，例如来自如卤素灯、金属卤化物灯等的光源2的 用于照明的光通过光纤60被引入以照明样本台3上样本容器21的上表面， 并照射整个样本4。此外，为了获取荧光图像，将激光(激发)光源50安装 在装置主体外的光源盒62上，且从激光光源50激发出的激光通过外框架 上的激光入射开口 64进入该装置的主体。激光例如可以是具有10mW输出 和488nm波长的氩激光。通过激光入射开口 64进入装置体的激光首先进 入观察光学系统，在可切换二向色镜53上反射，从其底部进入物镜15，并 向样本4汇聚以将其照明。可切换二向色镜53安装在保持器上且根据激发 激光的波长振荡而可交换地安装。
用紧固销将样本容器21固定在XY样本台3上。XY样本台3设计为 使得其在XY平面上的位置可以通过齿轮-齿条机构在XY平面上任意移动。 安装在样本容器21之下的物镜15装有在Z轴上驱动物镜的机构9，以使 其可以沿着光轴(Z轴)移动。通过引线，Z轴物镜驱动机构9与微光测量装 置之外安装的焦点探测部分77通信并受其控制。
在观察光学系统5中，物镜15收集的信号光穿过可切换二向色镜53， 并随后不受偏转，如上述第一和第二实施例所示，信号光通过安装在镜桶66下部的透镜67并汇聚到CCD摄像机8的光接收面上。透镜67位于用 紧固销安装在底盘55的基座75上的镜桶66的下部，且在基座75上，CCD 摄像机8设置为使得透镜67的Z轴的焦点位置与光接收面的近似中心一 致。携带样本台3且物镜15安装其上的主体座76通过固定在底盘55上的 柱73安装，相对于镜桶的上下部分72和66上下移动。此时，可选的，可 以提供物镜焦点探测部分70，其连接到位置探测部分71，因此来自位置探 测部分71的输出信号可以输出到TV监视器37。
对于CCD摄像机8，由于来自样本的光微弱，优选使用具有尽可能高 灵敏度的摄像机，如第一和第二实施例中一样。CCD摄像机8的像素数量 可以是例如1360xl024。为了抑制来自CCD摄像机8的暗电流，包括Peltier 器件的致冷系统29配备在CCD摄像机的底部以降低并保持CCD摄像机8 的温度在0。C附近。CCD摄像机8的光接收面上，设置红外截滤波器13， 以截止可以是背景光的红外光。然而，将红外光作为信号光的时候，在测 量之前从镜桶66的下部去除红外截滤波器13。 CCD摄像机8的输出部分 连接到信号线69，并且由此将来自CCD摄像机的样本图像通过信号处理 部分74传送到计算机80，并在TV监视器37上显示。3片型彩色摄像机 可以用作CCD摄像机8，因此可以获得彩色的照明图像。
操作中，首先基于光源2照射的样本4的照明图像，物镜的焦点调节 到样本上。为此，通过Z轴物镜驱动机构将物镜15沿着光轴移动足够量， 并且在其每个移动步骤中，通过信号处理部分74分析来自CCD摄像机8 的光学输出信号，用于探测物镜15在光轴上的位置，其中获得高对比度的 图像。随后，找到提供高对比度图像的物镜15在光轴上的上侧和下侧的两 个位置，并且通过信号处理部分74的计算，将上下位置间的近似中间位置 确定为发光观察的焦点位置。此后，通过操作Z轴物镜驱动机构9，移动 物镜15并固定到得到的焦点位置，并且此后，样本4射出的荧光信号和发 光信号用CCD摄像机8接收。
在Z轴物镜驱动机构9中，可交换地安装多个物镜15。在具有大放大 率的物镜15用于观察细胞等时，移动样本4中的培养基，由于较小的视野， 在一些情况下就可以使得细胞等的样本4移到视野之外。因此，优选的， 样本4首先用具有低放大率的物镜15观察，诸如xl0和x20，且在确认并
利用鼠标和键盘指定样本4的所需位置之后，通过本发明装置中的放大功 能扩大图像。此时，计算机可以用作信号处理部分74。
为了研究本发明的用途，进行下面的试验。此时，应该理解下面的例 子用于说明本发明的用处且不应限制本发明的范围。
例子l
在例子1中，使用微光测量装置，其中图1中的该测量装置提供有自 动分配设备100，在引入荧光素酶基因的多个Hela细胞中的某些细胞中， 临时观察到试剂激励导致的发光。
对于样本来说，使用其中载体"pcDNA6/TR(从In vitro gene co.获得)" 持续表达四环素阻遏物(TetR)的Hela细胞，以及包括与具有已经被转基因 的四环素操纵子(Tet02)的表达载体"pcDNA4/TO(从In vitro gene co.获得)" 相连的荧光素酶基因的质体。在引入这两种基因的细胞中，如图7A示意所 示，TetRs首先以载体(pcDNA6/TR)表达为TetR，且TetRs形成同型二聚体， 其与Tet02基因区结合，由此抑制与Tet02区连接的荧光素酶基因的转录。 然而，如图7B所示，将四环素给与细胞时(试剂激励)，导致TetR同型二 聚体的构造改变，导致TetR同型二聚体从Tet02区分开，因此将导致荧光 素酶基因的转录和表达荧光素酶蛋白质。因此，在此试验例子中，导入上 述基因的细胞中，观察到四环素激励使得表达荧光素酶和细胞内的发光现 象。
在图1的装置中，对于物镜15来说，使用Olympus UApo/340(20x， N.A. 0.75)以及显微镜的商用物镜"Oil， 20x， N.A.0.8"或"5x， N.A.0.13"。对于 CCD摄像机8，使用5° C致冷的显微镜摄像机"DP30BW(Olympus)"。在 此CCD摄像机中，CCD元件(对应于图像传感器7)为2/3英寸的类型，其 像素数量为1360x1024，且每个像素的尺寸为6平方nm。从物镜穿过成像 透镜(中继透镜)并在CCD元件上形成的样本图像的总放大率设置为4倍。 在观察和对Hela细胞成像期间，整个装置被暗箱覆盖。
在下面的过程中执行上述试验操作。
(l)制备Hda细胞样本，其中共同表达始终表达TetR的载体和包括与 Tet02的表达载体相连的荧光素酶基因的质体。对于培养基，可以使用包含
10mMHEPES，具有lmM荧光素酶的D-MEM介质。
(2) 下面，(l)中的样本用作样本，且采集照明图像和发光图像。 一直配 对采集照明图像和发光图像。 一次图像获取的曝光时间(在CCD摄像机上 信号的积分时间)对照明图像设置为10msec，对发光图像设置为5min。
(3) 随后将四环素加入样本以导致其中的荧光素酶基因转录，并且在添 加四环素之后立即如过程(2)所示成对采集样本的照明图像和发光图像。
(4) 随后，如图8所示，过程(2)的采集图像以10min的间隔重复约10 小时。采集图像的过程通过计算机处理自动执行，其中在本发明的装置中， CCD摄像机获得的光信号自动转换成数字数据。
(5) 在完成图像获取之后，获取的照明图像和发光图像被叠加以确定表 达荧光素酶的Hela细胞。随后，表达荧光素酶的Hela细胞随时间变化的 发光强度被数字化并进行分析。在叠加图像上很难确定Hela细胞的发光位 置时，以伪彩色显示CCD摄像机8的输出值，为了可以通过人眼容易地识 别发光位置。
图9A、 9B和9C分别示出照明图像、发光图像和叠加图像。图10示 出ROI-l和ROI-2区域中两个细胞中发光强度随时间的变化，每个区域都 环绕在图9C的以上述方式获得的叠加图像的方框中。因此，已经示出，根 据本发明，可以确定哪个细胞发光并测量其发光随时间的变化。
例子2
在例子2中，使用与例子l中一样的装置，执行发光细菌(P.发光菌)的 发光观察，且监视细胞中试剂激励的发光强度随时间的变化。发光细菌是 活动的，发光生物体以下面的形式广泛存在自然中，(i)海水中的独立活生 物体，(ii)与鱼或头足类动物的发光器官共生，(iii)死鱼、动物尸体中的增殖， (iv)咸水鱼消化道中或乌贼表皮上的习惯性寄生，且该细菌连续显示出强的 发光，足以在氧气条件下通过眼睛观察。
观察中，将Olympus UApo/340(40x， N.A. 1.35)或Oil Iris "Oil, 40x， N.A. 1.35"用作物镜15。其他采集图像的条件与例子1中一样。
试验操作以下面的过程执行。
(l)发光细菌，作为共生生物体存在于萤鱿(fireflysquid)的发光器官内，
其被隔绝开并在包括3%NaCl的LB培养基内培养。将甘油添加到此培养基 内以获得25。/。的甘油溶液(v/v)为最终浓度。
(2) 将(1)中的样本用作样本，且采集照明图像(观察图像)和发光图像。 照明图像和发光图像始终成对采集。 一次图像获取的曝光时间(在CCD摄 像机上信号的积分时间)对照明图像设置为10msec，对发光图像设置为 lmin。
(3) 随后使用自动分配设备100，将氨比西林添加到样本中，禁止发光 细菌中的细胞壁合成。由此，抑制发光细菌的增殖，使得细菌灭绝。这样 执行添加氨比西林，其中自动分配设备100的操作与图像采集同步，其中 在添加氨比西林之后立即执行采集图像，其中照明图像和发光图像成对采集。
(4) 随后，上述过程(2)描述的图像采集以5min的间隔重复直到添加氨 比西林之后经过1小时。采集图像的过程通过计算机处理自动执行，其中 在本发明的装置中，CCD摄像机获得的光信号自动转换成数字数据。
(5) 在完成图像获取之后，获取的照明图像和发光图像被叠加以从中确 定强的发光细菌。随后，以采集各个图像的时间顺序排列叠加图像以形成 动画，且追踪伴随着发光细菌运动的发光位置的改变，且数字化和分析发 光细菌的发光随时间的改变。此时，用计算机处理自动执行发光细菌的跟
踪o
图11A、 11B和11C分别示出照明图像、发光图像和叠加图像(表达为 伪彩色)。图12示出图11C中PP-1区域中发光细菌的发光强度随时间的变 化。根据例子2，已经示出，即使在诸如细菌的微生物体在测量期间运动， 也可以确定哪个微生物体发光以及测量其发光随时间的变化。
例子3
在例子3中，执行发光细菌(V.tischeri)的发光观察，其中跟踪发光细菌 的位置和发光强度随时间的变化。采集图像的条件与例子2中一样。 试验操作以下列步骤进行。
(l)发光细菌，在包括3%NaCl的琼脂LB培养基盘内培养，这里将发 光强度高的群体分类并悬浮在包括3%NaCl的液体LB培养基内。
(2) 将(1)中的样本用作样本，且采集照明图像(观察图像)和发光图像。 照明图像和发光图像始终成对釆集。 一次图像获取的曝光时间(在CCD摄 像机上信号的积分时间)对照明图像设置为5msec，对发光图像设置为3min。
(3) 随后，重复上述过程(2)描述的图像采集。采集图像的过程通过计算 机处理自动执行，其中在本发明的装置中，从CCD摄像机获得的光信号自 动转换成数字数据。
(4) 在完成图像采集之后，获取的照明图像和发光图像被叠加。由于发 光细菌随时间变化运动，就以采集各个图像的时间顺序排列叠加的图像以 形成动画，且追踪伴随着发光细菌(V.t.)运动的发光位置的改变，且数字化 和分析发光细菌的发光随时间的改变。此时，可以用计算机处理自动执行 发光细菌的跟踪。
图13A、 13B和13C分别示出照明图像、发光图像和叠加图像，且图 14示出发光细菌随时间变化移动。图15示出发光细菌(V.t.)发光强度随时 间变化。如例子3所示，即使在诸如细菌的微生物体在测量期间运动，本 发明也可以测量指定的发光部分随时间变化的发光。如所示，仅通过跟踪 动态主体，而与有无激励无关，例如行为性和/或细胞学分析(增殖活动等) 都是可行的。此外，由于可以跟踪细菌的动态条件，就可以测量样本中发 光区域的运动，而与有无激励无关。
尽管对于具体实施例详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来 说，在本发明的范围其他的各种可行的实施例也是显而易见的。
权利要求
1、一种使用光学成像设备获取生物源样本图像的装置，包括照明部分，用于照明该样本；照明图像获取部分，用于获取该样本的照明图像；发光图像获取部分，用于获取该样本中细胞的发光图像；图像处理部分，用于叠加该照明图像和该发光图像以产生叠加图像，并确定该叠加图像中的分析区域。
2、 根据权利要求l的装置，其特征在于，该光学成像设备是光学显微 镜；该照明图像是在该光学显微镜下利用该照明部分的照明光在透射光观 察中获得的透射光显微镜图像，且该发光图像是在该光学显微镜下观察该 细胞内发光现象发出的光而获得的发光显微镜图像；其中该照明图像获取 部分和该发光图像获取部分包括共用显微镜图像采集设备，其采集该透射 光显微镜图像和该发光显微镜图像。
3、 根据权利要求2的装置，其特征在于，该显微镜图像采集设备具有 光接收面，且该光学显微镜包括在该显微镜图像采集设备的光接收面上形 成该样本的图像的物镜和透镜组件，其中该物镜的数值孔径与投射在该光 接收面上的该样本图像的放大率之间比率的平方值为0.01或更大。
4、 根据权利要求l的装置，其特征在于，该装置包括荧光图像获取部 分，用于获取该细胞的荧光图像。
5、 根据权利要求4的装置，其特征在于，该光学成像设备是光学显微 镜；该荧光图像是在该光学显微镜下的样本荧光观察中获得的荧光显微镜 图像，且该发光图像是在该光学显微镜下观察该细胞内发光现象发出的光 而获得的发光显微镜图像；其中该荧光图像获取部分和该发光图像获取部 分包括共用显微镜图像采集设备，其采集该荧光显微镜图像和该发光显微 镜图像。
6、 根据权利要求l的装置，其特征在于，该装置包括显示部分，用于 显示该叠加图像。
7、 根据权利要求l的装置，其特征在于，该装置包括记录部分，用于 记录该叠加图像。
8、 根据权利要求l的装置，其特征在于，该装置包括细胞激励供给部 分，用于激励细胞。
9、 根据权利要求8的装置，其特征在于，该细胞激励供给部分是从包 括以下部分的组中选出的至少一个试剂供给部分，用于给该细胞提供试 剂；温度调节部分，用于调节该样本的温度；以及气体供给部分，用于给 该细胞提供气体。
10、 一种利用光学成像设备获取生物源样本图像的方法，其特征在于 该方法包括下面的步骤照明该样本并获取其照明图像；不照明样本而获取该样本中的细胞的发光现象发出的光的发光图像； 叠加该照明图像和该发光图像以产生叠加图像；以及 确定该叠加图像中的分析区域。
11、 根据权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括显示该叠加图 像的步骤。
12、 根据权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括记录该叠加图 像的步骤。
13、 根据权利要求10的方法，其特征在于，执行两次或更多次照明该 样本和获取该照明图像的步骤。
14、 根据权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括在获取该照 明图像和该发光图像的步骤之前的给该细胞激励的步骤。
15、 根据权利要求14的方法，其特征在于，该方法包括在给该细胞 激励的歩骤之前的获取该照明图像和该发光图像的步骤。
16、 根据权利要求14的方法，其特征在于，在给该细胞激励的步骤中给该细胞的激励是从包括以下激励的组中选出的至少一个激励试剂激励；电激励、通过气体的激励和通过热的激励。
17、 根据权利要求10的方法，其特征在于，还包括步骤测量该发光图像中与该分析区域对应的区域中的光强，并显示该光强的变化。
18、 根据权利要求10的方法，其特征在于，该方法包括获取该样本中细胞的荧光图像的步骤。
19、 根据权利要求18的方法，其特征在于，该方法包括这样的步骤显示该照明图像中与该分析区域对应的区域、该发光图像中与该分析区域 对应的区域、和该荧光图像中与该分析区域对应的区域中的至少两个区域。
20、 根据权利要求10的方法，其特征在于，该光学成像设备是光学显 微镜；该照明图像是在该光学显微镜下的透射光观察中获得的透射光显微镜图像，且该发光图像是在该光学显微镜下观察该细胞内发光现象发出的光而获得的发光显微镜图像；其中该透射光显微镜图像和该发光显微镜图 像通过共用显微镜图像采集设备而采集。
21、 根据权利要求20的方法，其特征在于，该显微镜图像采集设备具 有光接收面，且该光学显微镜包括在该显微镜图像采集设备的光接收面上 形成该样本的图像的物镜和透镜组件，其中该物镜的数值孔径与投射在该 光接收面上的该样本图像的放大率之间比率的平方值为0.01或更大。
22、 一种获取生物源样本图像的装置，该装置包括光学显微镜；显微 镜图像采集设备，用于采集该光学显微镜观察的该样本的显微镜图像；以 及图像处理设备，用于获得该显微镜图像作为图像数据并执行图像处理， 其中，该图像处理设备包括图像叠加部分，用于通过叠加透射光图像和发 光图像产生叠加图像，其中在该光学显微镜下用该显微镜图像采集设备在 该样本的透射光观察中采集该样本的图像而获得该透射光图像，以及在该 光学显微镜下用该显微镜图像采集设备对该样本中细胞内发光现象发出的 光进行采集而获得该发光图像；还包括图像区域指定部分，用于指定该叠 加图像中的分析区域。
23、 根据权利要求22的装置，其特征在于，该显微镜图像采集设备具 有光接收面，且该光学显微镜包括物镜和透镜组件，用于在该显微镜图像 采集设备的光接收面上形成该样本的图像，其中该物镜的数值孔径与在该 光接收面上投影的该样本图像的放大率之间比率的平方值为0.01或更高。
全文摘要
提供了一种使用光学成像设备对生物源的样本的发光现象成像的新装置和新方法。在本发明的装置和方法中，对通过照明样本获得的照明图像和不照明样本而对样本中细胞的发光现象发射的光获取的发光图像进行叠加，以产生叠加图像。在叠加图像中，确定分析区域。由此，即使在发光观察中探测的光很微弱的时候，也可以指定样本的细胞中发光细胞和/或发光位置。
文档编号G01N21/64GK101351735SQ20068004954
公开日2009年1月21日 申请日期2006年12月26日 优先权日2005年12月27日
发明者福冈庄尚, 秋吉龙太郎, 铃木浩文 申请人:奥林巴斯株式会社