专利名称：用动态散斑照明实现准共焦荧光显微的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明是一种利用动态散斑照明近似实现共焦荧光显微(也就是准共焦荧光显微)的新 方法和新装置。该方法能够以非侵入的方式，获取生物组织样品的高时间和空间分辨三维层 析显微图像信息，装置结构简单、性价比高、后期数据处理方便、易于操作和推广，有巨大 的应用前景和市场，对于临床疾病诊断和生命科学研究等都具有非常重要的意义。
技术背景在生命科学研究和临床诊断领域，激光扫描共焦显微[l]已经成为一种能够有效获得生物 组织样品高空间分辨三维层析图像信息的显微技术。与传统的光学显微技术相比，激光扫描 共焦显微具有深层分辨能力和三维层析能力，并且能够有效降低样品的散射光对所获得图像 对比度的影响，改善了图像分辨率和成像质量[2]。传统的激光扫描共焦显微镜一般采用复杂 的扫描成像方式来获得整个样品的图像，因此图像的获取时间长，同时导致系统复杂，不便 于操作；另外，这种系统的价格昂贵，只有为数不多的一些科研单位和医院有条件装备。为 了克服传统激光扫描共焦显微镜的缺点，早期的解决方法是采用随机扫描的方式来提高图像 信息的获取时间[3]。但是，在共焦显微镜中所采用的共焦针孔在有效避免信号串扰和消除背 景影响的同时也大大降低了有效信号的功率。为此，提出了很多新颖的光学显微成像方法， 例如，结构光照明显微成像技术[4]。这种显微成像技术具有与传统共焦显微成像技术相近的 层析成像能力，但是不适用于对具有一定厚度的样品成像。近年来，出现了一种使用散斑照 明的准共焦显微成像技术[5]，这种显微成像技术使用随机变化的散斑图案照明样品，记录一 系列宽场荧光图像和相应的散斑照明图案，通过对所获得的散斑荧光图像的统计积分来获得 样品的宽场荧光显微图像。随着对"散斑现象"的深入研究，以"散斑摄影术"和"散斑干涉计量 术"为基础的散斑计量学逐步发展成为的一门崭新的、具有广阔应用前景的学科[6-8]。目前， 使用散斑效应对样品进行宽场照明以获得待测生物样品的三维层析图像已成为一种引起广泛 关注的非扫描式三维荧光显微成像技术。当使用激光光束投射到一光学粗糙表面(即表面平均起伏大于光波波长量级)上时，即 呈现出利用普通光照明见不到的斑点状图样，其中的每一个斑点称为散斑(Speckle),整个 图样称为散斑图案(Speckle Pattern) [9]，这种散斑现象是使用高相干光时所固有的。散斑的 物理成因可以简单地说明如下当激光照射到物体表面，其上的每一个物点(面元)都可视 为子波源，产生散射光。由于激光具有高相干性的特点，物体表面的每一个物点散射的光将 和其他物点所产生的散射光发生干涉。又因为物体表面各个面元是随机分布的(这种随机性 由表面粗糙度引起)，则由它们散射的各个子波的振幅和相位都不相同，而且也是随机分布的。 所以由各面元散射的子波相干叠加的结果，形成的反射光场具有随机的空间光强分布。当把 探测器或眼睛置于光场中时，将记录或观察到一种杂乱无章的干涉图样，呈现颗粒状结构， 此即"散斑"。根据观察方式的不同，散斑可以分为"自由空间散斑"和"像面散斑"两种类型。[IO]当激光 照明漫射体(反射或透射体)时，在其附近的自由空间产生的散斑称为"自由空间散斑"(或 菲涅耳型散斑、"客观"散斑)。观察屏上任一点的光场，来自于整个漫射表面上所有散射点源产生的子波的叠加。散斑的平均尺寸与产生散斑的辐射面对观察点的张角a有关。距离漫射 体为z处的散斑的横向平均尺寸为
<formula>formula see original document page 4</formula>
式中，X是光的波长，L为漫射体上照明光束的孔径的线宽度。散斑的纵向平均尺寸为
<formula>formula see original document page 4</formula>当a愈小时，散斑的尺寸愈大。应当强调散斑的平均尺寸与漫射体本身的颗粒度无关。 但散斑的细微空间分布却和漫射体的结构有关。照射尺寸相同但结构不同的两个漫射体，在 相同距离处产生的散斑虽然平均尺寸相同，但分布却完全不同。
漫射体受激光照射，经透镜成像，在像面上产生的散斑称为"像面散斑"(或夫琅未费型 散斑、"主观"散斑)。每一个物点在像面上产生一个衍射斑(相干脉冲响应)，所有衍射斑相 干叠加得到物体的像。当透镜孔径D足够大，脉冲响应比较窄时，对像面上任一点光场能产 生贡献的，只是物面上以几何物点为中心的一个小区域。可以说，像面散斑尺寸与漫射体被 照明的面积无关，而仅与透镜孔径对观察点的张角I3有关，散斑的平均横向尺寸为
D ) ， (3)
式中，di为像距。这个尺寸和爱里衍射图样的中央亮斑是同一数量级的。 使用散斑照明样品产生层析成像的原理卩l]如图1所示，图中实线表示探测点扩散函数
(PSFdet)。散斑照明产生的散粒状荧光在焦平面内有较高的对比度，而在焦平面外的其他地
方相对模糊。因此，在散斑图案的随机移动时，在焦点内的光强度变化大(依赖于是否散斑
微粒与PSFdet相互重叠)，离焦的光强度变化小。因而，在一系列图像中提取变化的处理算法
优先显示产生自焦平面内的荧光信号，从而在样品上实现光学层析。 散斑照明荧光显微的成像原理
利用散斑照明图像获得层析图像的计算方法可由下面的公式表示[12]<formula>formula see original document page 4</formula>(4 )
式中I,m对应的是散斑照明产生的荧光图像，S对应的是相应的散斑照明图像作为参考 图像，Ip是经计算机处理后所得到的样品层析图像。
成像的层析特性能够通过计算样品上同一平面的离焦合成强度Iint(U)与焦点内的强度 Iint(0)的比值R得到[13]
n,n,(氛(O)， (5)
其中，光学单位定义为"-2"^^2/々，Az表示离焦距离，N表示数值孔径，、表示照明 光波长。
在散斑照明准共焦荧光显微系统的图像接收面上所探测到的信号强度可以由下式表示式中，A(》，—》表示样品上的散斑强度，C(A一z)表示样品中荧光标记的浓度，探测和照明的点扩展函数PSFs (分别表示为PSFdet和PSFm)。利用Gaussian-Lorentzian近似定义探测 和照明的点扩展函数PSFs:<formula>formula see original document page 5</formula>其中，《=lArA2。定义^4 = ;^。2/2，并且自相关函数可以由下式表示<formula>formula see original document page 5</formula>最终，像面上每一个象素的均方根(rms)可以表示为<formula>formula see original document page 5</formula>实际上，均方根图像必须由有限个(比如N个)强度In的原始图像来获得，每一个图像 对应于动态变化的散斑图案。与传统的共焦显微成像技术相比较，动态散斑照明准共焦荧光显微主要具有如下的优点1) 可获得厚组织样品的高分辨率深层层析图像；2) 与传统共焦显微镜相比，具有较好的轴向和横向空间分辨率；3) 具有高的图像对比度和放大倍率；4) 在样品上不易发生光致漂白，对样品的光致损伤小；5) 容易和现有的光学显微镜结合，不需要复杂的扫描装置和共焦光阑，系统整体稳定 可靠，结构简单；6) 系统自动化程度高，整体成本低，性价比高。 发明内容本发明提出并实现了一种将动态散斑照明与传统荧光显微镜有机地结合，实现快速获取 生物组织样品的高空间分辨三维层析图像的新方法和装置，避免了传统激光扫描共聚焦显微 技术中存在的系统复杂、不便于操作和维护等问题。本发明的原理和装置如图2所示，系统由氩离子激光器201、玻璃基底散射体202、步进 电机203、扩束整形及中继光学装置透镜204和205、双色分光镜206、荧光显微物镜207、 滤光片209、镜头210和CCD相机211等组成，实验样品是208。本发明使用波长为488nrn的氩离子激光器作为激发光源，平均输出功率为20mW。本发明采用具有一定颗粒度的玻璃基底散射体202，激光器201输出的光通过散射体202 时形成散斑图案。本发明通过计算机控制的步进电机203带动玻璃基底散射体202旋转，产生动态变化的 散斑图案，并通过扩束、整形中继光学系统204和205后耦合进普通的荧光显微镜。本发明对耦合进荧光显微镜的散斑图案，经过双色镜206后用荧光显微物镜207聚焦在待测样品208上，形成动态变化的散斑光场激发样品。
本发明通过特殊设计的光路及耦合系统、高灵敏度图像增强及探测系统实现对微弱信号 的高灵敏度探测。
本发明通过图像采集系统可以实时监测和记录样品的荧光信号，快速获得高空间和时间 分辨的荧光强度数据信息，通过计算机存储、处理，最终得到待测样品的三维高空间分辨层 析荧光显微图像。
图l、用散斑照明实现准共焦荧光显微层析成像的原理图 图2、用动态散斑照明实现准共焦荧光显微的装置示意图
具体实施例方式
本发明的具体实施方式
如图2所示。采用波长为488nm的氩离子激光器201作为光源， 平均输出功率为20mW。 201所发出的激光，经过一块具有特定颗粒度的玻璃基底散射体202 后，产生散斑图案。202装在一台步进电机上203上，并利用计算机控制203步进旋转大约 0.5度，产生动态的散斑图案。所产生的散斑照明激发光束通过光束扩束整形、中继光学系统 耦合204和205后，被耦合到一台传统的宽场荧光显微镜，激发光经过双色分光镜206后， 被反射进显微物镜207，并聚焦到样品208上，形成动态的散斑照明。样品所发出的荧光信 号通过双色镜206后，经滤光片209滤出激发光后，经过光学镜头210被CCD相机211接收。
用计算机控制步进电机的旋转，在样品上产生不同的散斑照明图案，用CCD相机记录一 系列图像。经计算机处理后，最终可获得样品聚焦层的高空间分辨图像。根据实验样品及实 验目的的不同，可以采用不同的数据处理方法，获得样品的三维高空间分辨层析图像。
参考文献 T. Wilson, C丄Sheppard， 1984， Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy, Academic Press, New York. M.G. Somekh， C.W. See, J. Goh， Optics Communications, 2000, 2, pp75. M. Petran, M. Hadravsky, M.D. Egger， R. Galambos, J. Opt. Soc. Am., 1968, 58, 661. D. Karadaglic, R. Juskaitis, T. ^Vilson， Scanning, 2002, 24， pp310. J.G. Walker, Optics Communications, 2001,189, pp221. K厄尔夫，散斑计量学，贺铎民，贺民霞译，1989，机械工业出版社. J. R. Dainty (Ed.). Laser Speckle and Related Phenomena, 1975, Springer陽Verlag. M. Francon. Laser Speckle and Application in Optics, 1979, Academic Press, New York.王仕墦等，2003，信息光学理论与应用，北京邮电大学出版社.吕乃光编，1987，傅立叶光学，机械工业出版社. Cathie Ventalon and Jerome Mertz， Optics Letters, 2005, December, Vol. 30, No. 24. [12]Shi-hong Jiang, John G. Walker, Optics Communications, 2004， 238, ppl. T. Wilson, Confocal Microscopy, 1990, Academic Press, San Diego， CA.
权利要求
1.一种利用激光散斑图案照明样品，在无需扫描的情况下，实现准共焦荧光显微的方法。
2. 根据权利要求1所述的方法，所用激光器是氩离子激光器，输出波长488nm，输出功率 20mW。
3. 根据权利要求1和2所述的方法，所用的氩离子激光器可以是连续输出，也可以是脉冲 输出；激光器的输出波长可以是458nm， 476nm， 488nm和514nm;激光的输出功率可以 是从5mW到IOW。
4. 根据权利要求1所述的方法，所用激光器可以是二极管激光器，输出波长在350nm到 1000nm，输出功率从lmw到20W。
5. 根据权利要求1、 2、 3和4所述的方法，所用激光器可以是其它的固体、气体和化学激 光器，输出波长可调谐，连续或脉冲输出，激光器输出激光的波长范围从350nm到 IOOO跳
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的散射体具有一定的颗粒度、散射角和透过. 率参数。
7. 根据权利要求1和6所述的方法，采用步进电机控制散射体的旋转角度，产生动态变化 的散斑图案。
8. 根据权利要求1和7所述的方法，可采用一维、二维或三维控制台带动散射体，产生动 态的散斑照明图案。
9. 根据权利要求1和6所述的方法，采用光学系统将带有散斑图案的光束进行扩束、整形 后耦合进入荧光显微镜，被双色镜反射到物镜，聚焦到样品上产生动态的散斑照明图案。
10. 根据权利要求1和9所述的方法，应根据激发光源的波长以及研究样品的不同，在荧光 显微镜中选用不同的双色分束镜。
11.根据权利要求9和10所述的方法，样品所发出的荧光用显微镜物镜收集后，通过双色镜 并经过滤光片后被CCD相机接收。
12. 根据权利要求1和11所述的方法，CCD相机前的滤光片应该能够阻挡激发光，对样品所 发出的荧光具有高的透过率。
13. 根据权利要求l、 9、 10、 ll所述的方法，所用的荧光显微镜既可以是整个系统的一个整 体设计部分，也可以是对单独的荧光显微镜的光路改造；荧光显微镜可以是正置的，也 可以是倒置的。
14. 根据权利要求l、 11和12所述的方法，接收荧光图像的CCD相机即可以是制冷的、也 可以是常温工作的。
15. 根据权利要求l、 11、 12和14所述的方法，接收荧光图像的相机还可以是CMOS相机和 其它各种摄像机。
16. 根据权利要求l、 11、 12、 14和15所述的方法，所用的相机可以是带有增强器。
17. 根据权利要求l、 6、 7、 8、 9和11所述的方法，利用计算机或其它的机械的或光电的手 段，改变在样品上的散斑图案，并依次记录一系列样品的荧光图像。
18. 根据权利要求〗7所述的方法，采用均方根或方差法等数据处理方法，从所获得的一系列 荧光图像中，提取出样品上激发光聚焦面的层析图像。
19. 根据权利要求18所述的方法，可通过横向或纵向移动样品，以获取样品不同位置或不同 深度的层析图像，实现无需进行激发光扫描的高空间分辨三维层析成像。
全文摘要
本发明是一种将动态散斑照明与传统的宽场荧光显微镜有机地结合起来，实现近似共焦荧光显微(也就是准共焦荧光显微)的新方法和新装置。本发明采用氩离子激光器作为光源，激发光经散射体后通过扩束、整形等中继光路系统后耦合到荧光显微镜中，并聚焦到样品上。用计算机控制散射体的步进旋转，在样品上产生动态散斑照明图案。对接收到的一系列荧光图像处理后可在无需扫描的情况下，获得高空间分辨的层析图像。该方法能够以非侵入的方式，获取生物组织样品的高时间和空间分辨三维层析显微图像信息，装置结构简单、性价比高、后期数据处理方便、易于操作和推广，有巨大的应用前景和市场，对于临床疾病诊断和生命科学研究等都具有非常重要的意义。
文档编号G01N21/64GK101303302SQ200710106240
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者君 尹, 屈军乐, 牛憨笨, 磊 王, 赵羚伶 申请人:深圳大学