专利名称：镁(离子)诊断/测定试剂盒及镁(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电
极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。
镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法 法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自 动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、 邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2- (8，-羟基喹啉-5'-磺酸-7'-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费用低， 适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子的干扰， 试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。
离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025) 液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)Ca2+最大干 扰10%等不足。
离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释
5和过滤。Thie叩ont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分 光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35%，认为离子色谱法 可作为总镁测定有价值的参考方法。
Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg" 测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶 联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法； ⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦谷氨酰胺合成酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结 果准确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、 灵敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟 酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁(离子) 浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁(离子)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。
本发明镁(离子)浓度测定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶/]\^2+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+还原型辅酶甲酸脱氢酶甲酸+辅酶 其中，磷酸根可以用磷酸二氢盐取代。
这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC 2.7丄2)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、甲酸脱氢 酶(Formate dehydrogenase; EC 1.2.1.2; EC 1.2.1.43)酶促反应连续监测/速率 比色法。在镁离子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺苷二磷酸， 再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定 还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速 度，可以测算镁(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
己糖激酶6000 U/L
丙酮酸羧化酶8000 U/L
甲酸脱氢酶10000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L草酰乙酸 3mmol/L 磷酸根 3 mmol/L
本发明的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷 酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶。 还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、 草酰乙酸、磷酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷 酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、己糖激酶。 还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、
草酰乙酸、磷酸根在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定镁(离子)浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25腿ol/L
己糖激酶6000 U/L
丙酮酸羧化酶8000 U/L
甲酸脱氢酶10000 U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
草酰乙酸3 mmol/L
磷酸根3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施1
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸 草酰乙酸
磷酸根
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
己糖激酶
丙酮酸羧化酶
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 謂0 U/L甲酸脱氢酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂l、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2
分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸
草酰乙酸
磷酸根
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸羧化酶
100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
甲酸脱氢酶 10000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 己糖激酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定镁(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8士 0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm, 被测镁(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0012;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达6 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士6 %;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.12 ± 0.04AA/mmol /L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)浓度测定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+还原型辅酶 <u>甲酸脱氢酶</u> 甲酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出镁(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种镁(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20~—500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0.35 mmol/L己糖激酶IOOO-——80000 U/L丙酮酸羧化酶IOOO-——80000 U/L甲酸脱氢酶IOOO-——80000 U/L葡萄糖1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L磷酸根1—50 mmol/L其中，磷酸根可以用磷酸二氢盐取代。如果缓冲液使用磷酸缓冲液，则不需要加磷酸二氢钾。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根组成；试剂 2，由缓冲液、稳定剂、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶组成。还原 型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草 酰乙酸、磷酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根组成；试剂 2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲 液、稳定剂、己糖激酶组成。还原型辅酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸 脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~^000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464368SQ20071019216
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司