专利名称：：通过聚乙二醇沉淀预测多肽的相对溶解度的制作方法通过聚乙二醇沉淀预测多肽的相对溶解度发明领域本发明基本涉及蛋白质表征领域。更具体地，本发明涉及预测蛋白质溶解度的方法。相关申请的交叉引用本申请要求美国临时申请系列号60/801,862的优先权，该临时申请于2006年5月19号递交，其全部内容在此通过引用并入本文中。
背景技术：
：配制包含多肽的药用组合物的一个重要方面是测定待在制剂中使用的多肽的溶解度。由于，例如，操作步骤多和难以得到足够量的待测多肽，对于评估大量不同多肽的溶解度，通常不易使用测定溶解度的方法。聚乙二醇(PEG)为无毒、非吸收性的长链两性合成聚合物，广泛用于许多工业用途。由于可在室温用于多肽沉淀，PEG在实验室或工业应用中是非常有用的分子。在探索或研发的早期，对于作为例如药物候选物的多肽，需要有高通量筛选法测定其溶解度，从而在研发的相对早期，例如，在商业规模生产之前鉴别溶解度可能存在问题的多肽。另外，例如在只能得到极其有限量多肽的时候，最小化测试溶解度所需要的原料量十分有利。发明概述本发明涉及预测一种或多种多肽的相对溶解度的方法，包括用PEG体积排阻沉淀多肽。此处称该测定法为"相对溶解度测定法"或"PEG沉淀测定法"。更特别地，由本方法测定的实验多肽可与一种或多种已知溶解度的多肽相比较，从而在以耗时、昂贵的商业身JMt生产实验多肽之前，鉴别具有潜在的溶解度难题的多肽。对于选定的多肽，本方法还可用于鉴定其适于多种用途的参数。因此，本发明涉及预测实验多肽相对溶解度的方法。本方法包括提供实验多肽溶液的一个或多个样品，由此提供实验样品；将实验样品与不同浓度的聚乙二醇(PEG)接触，从而形成沉淀的样品；测定与PEG接触过的各实验样品的沉淀；将沉淀的样品中实验多肽的沉淀量，与在相应条件下分析的、至少一种参照多肽样品的溶解度相关联，从而确定实验多肽相对于参照多肽样品的溶解度；或将不同实验条件下沉淀的样品中实验多肽的沉淀量关联起来，从而确定各实验条件下实验多肽的相对溶解度。在一些实施方案中，实验多肽为抗体或抗体的片断、可与配体结合的分子、或可溶的受体。在某些实施方案中，本方法还包括，用各样品测定的溶解度值的对数对该样品的PEG浓度作图，将得到的线条外推至PEG百分比为零，从而提供多肽的表观溶解度值。在一些情况下，实验多肽不与PEG结合。在某些实施方案中，实验多肽的PEG沉淀为可逆的。在一些情况下，PEG沉淀可能不改变实验多肽的二级结构。对一些实施方案，待分析实验多肽的起始浓度不会大幅影响得到的溶解度值。本方法包括这样的实施方案，其中温度升高提高选定的PEG浓度下的溶解度值，或在緩沖液中加入蔗糖提高实验多肽的溶解度。本方法的实施还可以使得，用较高分子量的多肽样品的溶解度对数值对PEG浓度作图，得到的曲线的斜率相对于较低分子量的多肽的曲线斜率有所增加。在本发明的一些实施方案中，参照为溶解度已知的多肽。在一些情况下，用溶解度已知的多个多肽作为参照，例如，来建立标准曲线，通过它可确定实验多肽的相对溶解度。在某些情况下，参照多肽选择为实验多肽的相似类型，例如，当实验多肽是抗体，测定其相对溶解度时，可用已知溶解度的抗体作为参照多肽。在一些实施方案中，通过测定沉淀的样品的浊度检测沉淀。在一些实施方案中，离心沉淀的样品并测定沉淀量，测定上清中的蛋白质的量，或测定沉淀中5的蛋白质的量。另一方面，本发明涉及测定多肽相对于分子量几乎相同的、至少一种其他多肽的相对溶解度的方法。本方法包括提供相同浓度的、至少两种不同多肽的样品；将各多肽样品与一定浓度范围内的实验PEG相接触；测定沉淀多肽样品的最低实验PEG浓度，从而确定沉淀各多肽的PEG最小百分比；将PEG的最小百分比与各多肽相对于其它各多肽的溶解度相关联。在本方法的一些实施方案中，以96孔板形式进行测定法的一个或多个操作。在本方法的一些实施方案中，PEG的浓度范围约2。/。-16V。。可通过确定导致样品乳光的最小实验PEG浓度，视觉上读取孔板或其它多样品形式。在一些情况下，用自动读板器读取板中样品的乳光。除非另有定义，此处使用的所有技术和科学用语含义与本发明所属领域中的普通技术人员所普遍理解的相同。尽管在本发明的实施或验证中，可以使用与此处说明的相似或等同的方法和材料，但适合的方法和材料还是在下文中予以说明。所有在此提及的出版物、专利申请、专利和其它参考文献，其全部内容通过引用并入本文中。此外，材料、方法和实施例为说明性而不是限制性的。本发明的其它特点和优点将会因发明详述、附图和权利要求书而变得显而易见。附图的简短说明图1表示用傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行的Pl与PEG-10K结合研究的结果。图2表示用FTIR进行的Pl二级结构分析的结果。图3为测试多肽与PEG的沉淀是否为完全可逆的而设计的实验结果的柱形图。图4表示比较PEG-10K和PEG-20K溶解度预测准确度的实验的结果。用PEG-10K和PEG-20K测试溶解度，以比较使用备选分子量PEG的体积排阻方法的效果。图5A为使用不同分子量的多肽测试多肽大小对相图影响的实验结果。图5B多肽的分子量与表示溶解度相对于PEG沉淀百分比的图中(如在图l和2)线条的斜率之间的关系图。图6A表示P4多肽溶解度预测的重现性。实验以一式三份进行。20mM琥珀酸盐为P4的配制緩沖液。图6B表示Pl多肽溶解度预测的重现性。实验以一式三份进行。50mM组氨酸为Pl的配制緩沖液。图7A表示多肽浓度对PEG测定的P4溶解度的影响，P4处在20mM琥珀酸盐pH6.0中。起始多肽浓度为5.5mg/mL(方形)和11mg/mL(菱形)。图7B表示多肽浓度对PEG测定的Pl溶解度的影响，Pl处在20mM琥珀酸盐pH6.0中。起始多肽浓度为5.5mg/mL(方形)和11mg/mL(菱形)。图8A表示可变温度(菱形，20。C或方形，0'C)对P4溶解度预测的影响，P4处在20mM琥珀酸盐，pH6.0中。图8B表示可变温度(菱形，20。C或三角形，0'C)对P1溶解度预测的影响，Pl处在20mM琥珀酸盐，pH6.0中。图9表示pH(三角形，20mM琥珀酸盐，pH6.0;方形，10mM磷酸盐，pH7.0;菱形，10mMTris，pH8.0)对Pl溶解度估计的影响。图10为在0。C和20。C，由PEG-10K预测的Pl溶解度的pH图。图11表示緩沖液的离子强度对PEG沉淀方法性能的影响，使用10mg/mLrPl。图12A表示测定蔗糖对P5表观溶解度影响的实验结果，PEG沉淀緩冲液中加入NaCl。图12B表示测定蔗糖对P5表观溶解度影响的实验结果，PEG沉淀緩沖液中不加NaCl。图13为用PEG沉淀方法测定单克隆抗体表观溶解度的高通量筛选中使用的96孔板照片的复制品。图14表示浓度为卯mg/mL的单克隆抗体溶液的乳光与通过PEG沉淀方法预测的相对溶解度之间的关联。发明详述在此公开的方法为评估多肽特征例如溶解度提供了有利条件。本方法用有限数量的操作测定多肽如抗体或抗体片断的相对溶解度。限制操作的数量是有益的，例如，可减少得到一种多肽或一组多肽的溶解度的时间，且较少的操作最小化处理中损失的多肽量。相对溶解度测定法本发明涉及对于估计多肽的相对溶解度(相对溶解度测定法)相对快速有效的方法的需要。一般而言，本方法在测定相对溶解度的方法中使用PEG沉淀，这样可降低溶解度测定法中起始多肽的量，由使用基于膜的浓缩方法测量实际溶解度的常规方法的约200mg，降至约10mg到约30mg(例如，约5mg到约100mg，约5mg到约50mg,或约10mg到约50mg)。本测定方法不妨碍使用较大量的多肽。在一些实施方案中，测定法包括在包含目的多肽溶液(实验多肽；选定的蛋白质)的实验样品中加入选定浓度的PEG(PEG沉淀系列)，测定多肽在各PEG浓度的饱和浓度，将饱和曲线在PEG零浓度的外推值与在同样的测定条件下测试的至少一种其它(即，不同)多肽相比较。在其它实施方案中，实验多肽在两种或多种不同条件下制备，例如不同緩沖液成份、pH或温度，并用不同PEG浓度测定溶解度。在观察到沉淀的样品中，测定上清中的多肽浓度得到饱和浓度，饱和浓度可用对数尺度对相应的PEG浓度作图。拟合线的Y轴截距提供多肽在零PEG的表观溶解度，还可计算线条的斜率。尽管表观溶解度可能与用基于膜的浓缩方法测定的、实际可达到的溶解度相差甚远，但表观溶解度可用于比较一种多肽与另一种之间的相对溶解度。拟合线的斜率与PEG和多肽的分子大小相关，而与pH、温度和緩沖液无关。在一个实施方案中，本发明提供了预测多肽(例如，实验多肽)相对溶解度的方法，本方法包括提供实验多肽溶液的至少一个样品，将各实验样品与不同浓度的聚乙二醇(PEG)接触，测定各样品在给定PEG浓度下的相对溶解度(例如，通过测试沉淀量)，将实验多肽的溶解度与在相应条件下分析的参照多肽样品或第二实验多肽样品的溶解度相比较，从而确定实验多肽对于参照或第二实验多肽的相对溶解度。用此方法可测定更多实验多肽的相对溶解度，例如，三个、四个、五个、十个、二十个、五十个、一百个、一千个或更多。在一些情况下，比较实验多肽在不同实验条件下制备或测试的多个样品的相对溶解度，从而确定实验多肽相对于第二多肽或实验条件设置的溶解度。在某些实施方案中，多肽为蛋白质，例如，抗体、抗体片断、配体结合分子或可溶的受体。测定法中可使用不止一种类型的多肽，或可使用全是同样或相似类型的多肽，例如，全是抗体。本发明还涉及此处说明的方法，其还包括用各样品测定的溶解度值的对数对该样品的PEG浓度作图，将得到的线条外推至PEG百分比为零，从而提供给定多肽样品的表观溶解度值，或不同实验多肽的一组溶解度值。在此方法的一些方面，多肽不与PEG结合，PEG沉淀为可逆的，PEG沉淀不改变多肽的二级结构，或待分析多肽的起始浓度不会大幅影响得到的溶解度值。本方法的其它方面包括升高温度以提高给定的(选定的)PEG浓度下的溶解度值，或在緩冲液中加入蔗糖以影响(例如，提高)多肽的溶解度。在又一实施方案中，预测多肽相对溶解度的方法的实施和分析使得，用多肽样品的溶解度对数值对PEG浓度作图，由较高分子量多肽样品得到的曲线斜率，相对于较低分子量多肽样品的曲线斜率有所增加。在另一实施方案中，此处提供的方法还可包括提供相同浓度的不同多肽的多个多肽样品，将各不同多肽与一定浓度范围内的PEG相混合，测定沉淀各不同多肽的PEG的最小百分比(即，实验PEG浓度的最小百分比)(最小PEG沉淀浓度，MPPC,可用百分比或浓度表示)，将MPPC9与多肽相对于其它多肽样品的溶解度相关联。在一些实施方案中，以96孔板形式分析此处说明的方法中使用的多肽样品。一般而言，PEG浓度范围约2-16%。可通过确定在样品孔中导致可见乳光的PEG最小(最低)浓度，视觉上读取孔板，或者可用自动读板器或其它适合装置读取样品孔中的乳光。Tir參嶔W漆席產刺定法在一些实施方案中，用测定多肽相对溶解度的PEG测定法，来测定选定的多肽在不同测定条件的相对溶解度，即使用可影响溶解度的不同参数。此类测定法可用于，例如，鉴定在哪些个参数条件下多肽的溶解度适于特定目的，例如储存和用作临床化合物。测定法中可变参数的一个例子是緩冲液成份。可测试的緩沖液包括但不限于琥珀酸盐、组氨酸或磷酸盐緩冲液。在一些情况下，测试多肽在不同緩沖液中的相对溶解度可用于鉴定适合多肽特定用途的緩沖液。含有多肽的溶液的密度也可影响溶解度。因此，可用测定法测试的一个参数是分子变化的浓度对溶解度的影响，该浓度可影响溶液的密度或其它性质。这样的分子的一个例子是蔗糖。测定法中可使用的蔗糖的浓度为，例如，约0.5%-10%。还可使用相对惰性并可影响溶液密度的其它分子，例如，右旋糖酐或甘油。可用于测定对多肽的相对溶解度的影响的另一参数是变化的离子强度。可测试的离子强度的非限制性例子包括阳离子，如Na+、Ca2+、K+、C02+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Al3+、Fe3+，或阴离子，如CT1、N03、P043、S042、C032^C2H302—(乙酸盐)。在相对溶解度的测定中另一个可变的参数是温度(例如，约o'c到约30°C，约5。C到约40。C，约5。C到约37。C,约15。C到约37X:，或约25°C到约37'C)。测定中可变化和测试的另一参数是pH(例如，约pH5.0到约pH8.5;约pH5.5到约pH8.0;约pH5.5到约7.5，及约pH6.0到约pH7.5)。测定法中使用的多肽的适宜浓度包括，而不限于，约1mg/mL到约200mg/mL此处所使用的多肽的"实际溶解度，，指溶液中可溶解的多肽的最大量，测量该量时不存在体积排阻剂，例如PEG。具体条件为，例如，温度、緩沖液、离子强度、pH、溶液密度或这些的组合。此处所使用的多肽的"相对溶解度"指多肽(通常是实验多肽)相对于第二多肽或一组多肽的溶解度，或者，在一些情况下，指多肽在一组条件(参数)下相对于同一多肽在一个或多个不同条件下的溶解度。不像实际溶解度，相对溶解度没有数值，而是用于例如与已知溶解度的参照多肽标准、或不同条件下多肽的相对溶解度对比，所述条件例如緩冲液、离子强度、pH、溶液密度、或这些条件的变量的组合。此处所使用的多肽的"表观溶解度"或"预测的溶解度"是用多肽样品溶解度值的对数对PEG浓度作图，将得到的曲线外推计算得到的数值，外推至表示对数溶解度的轴，表示的数值点相应于多肽样品的PEG浓度为零时的多肽溶解度。表观溶解度值可纳入反映多肽在溶液中与其自身相互作用的要素。这称为"活度项"，其可能增大由体积排阻测定法得到的线条外推而获得的表观溶解度值，使得表观溶解度值不准确地偏高。具有相对高的溶解度的多肽情况通常如此，例如白蛋白，其基于六方紧密堆积硬球的堆积密度，具有最大实际溶解度677mg/mL。然而，在PEG沉淀实验中，由于表观溶解度中纳入活度项，该值可高得多。此处公开的测定相对溶解度的方法不提供对实际溶解度的准确计算，而提供对比溶解度的方法，来比较多肽与相同条件下的其它多肽、或同一多肽与其自身在不同实验条件下的溶解度。在一个应用相对溶解度测定法的实施例中，多肽或溶解度未知的多肽与已知溶解度低的多肽相比较，例如，实施例中的P5抗体。溶解度与难溶的多肽相似的蛋白质或多肽，其溶解度也低。这样的信息对于确定例如使用这样的蛋白质或多肽的应用的适宜条件很有用，或对于不接受低溶解度的应用，可用于筛出蛋白质或多肽。因此，如果两种多肽PEG沉淀方ii法的结果非常相似，或如果实验多肽的相对溶解度比已知低溶解度的多肽低，相对溶解度测定法可用于鉴别可能会在大规模生产中产生相似溶解度问题的多肽。,應的沉淀此处公开的相对溶解度测定法包括对一种或多种选定的(例如，实验)多肽(例如，至少两种选定的多肽，至少三种选定的多肽，至少五种选定的多肽，至少十种选定的多肽，或多于十种多肽)的PEG沉淀。在单次测定中可测的多肽数目通常受限于可用的形式(例如，多孔板或印制网格)和在合理时间内对许多多肽实施操作步骤的能力。PEG沉淀进行如下将PEG溶液加入含有选定的多肽的水性溶液，得到PEG/多肽溶液；孵育PEG/多肽溶液足够长的时间，使得溶液中的多肽沉淀，通常为30-60分钟。可用不同的时间，并可用本领域技术人员显而易见的方法依经验确定。测定法的成分(包括多肽和PEG)通常在室温通过例如吸液或振荡混合，并在期望温度孵育足够测得沉淀的时间，通常约30-60分钟。可取出沉淀的多肽(例如，通过离心)，测定上清中残留的或沉淀中的多肽的量，并计算该多肽的溶解度。或者，不收集沉淀，而通过例如测定PEG/多肽溶液的乳光(例如，浊度)来分析沉淀情况。在一些情况下，沉淀情况的分析是通过测定经离心收集的沉淀量，或通过测定收集的沉淀中蛋白质的量而进行的。本领域已知测定乳光的方法，包括例如，用UV/可见光分光光度计在400nm或更高波长检测吸光度、其它光电浊度分析法(例如，自动浊度分析法)、直接用眼观察、直角光散射或荧光。适于在相对溶解度测定法中使用的PEG的例子包括但不限于PEG-10K、PEG-20K、或在约PEG4-30K的范围中。尽管其它质量的PEG制剂可适用(例如，化学级、商品级或医药级)，通常使用超纯的PEG。颠12此处说明的方法通常用于测定多肽、包括多肽片断的相对溶解度。但是，本方法可用于测定可用PEG沉淀的任何类型分子的相对溶解度。通常，用此处说明的方法测定相对溶解度的多肽是分离或純化的蛋白质或多肽。这样的分子通常基本上不含其细胞或组织来源的细胞物质或污染性多肽，或者，当待测分子是化学合成的时候，包含该分子的样品基本上不含化学前体或其它化学品。用语"基本上不含"指选定的蛋白质或多肽制剂中，非选定的蛋白质或多肽(此处也称为"污染性多肽")或化学前体少于约30%、20%、10%或5%(干重)。当选定的蛋白质或多肽由重组方法制备时，通常也基本上不含培养基，即，培养基少于蛋白质或多肽制剂体积的约20%、少于约10%，少于约5%。此处使用的"多肽"指氨基酸链，不考虑长度或翻译后修饰，包括例如蛋白质、肽、蛋白质或多肽片断、以及缀合蛋白质。该术语还包括含有非自然存在的氨基酸的多肽。多肽可来自任何来源，例如，分泌的重组多肽、由自然来源分离的多肽、非分泌的重组多肽、或合成的多肽。适合在测定法中使用的多肽浓度为约0.5mg/mL到10mg/mL，约10mg/mL到100mg/mL，和约100mg/mL到300mg/mL。测定法中使用的蛋白质可以是变性的，或具有二级或三级结构(例如，自然存在的结构或在例如分离过程中诱导的结构)。如果样品中杂质的溶解度充分小于目的肽，则会低估表观溶解度。相反，如果杂质的溶解度充分高于目的肽，则会高估目的肽的表观溶解度。縱初对溶叙为测定多肽或多肽集合的相对溶解度，可用沉淀的浊度或其它量度(例如，样品PEG沉淀之后沉淀或上清中的蛋白质含量)对变量(例如，PEG浓度、pH、离子强度、緩冲液摩尔浓度、蔗糖浓度，或这些的组合)作图。例如，选定的多肽或多肽集合的Y轴截距与在同样条件下测定的一种或多种多肽Y轴截距相比较，以多肽的溶解度排序(例如，较难溶到较易溶)，从而提供相对溶解度的量度。此处说明了测定相对溶解度的其它方法，包括视觉评估乳光，和将这样的评估与相对溶解度相关联。方法验证改变实验参数，对比预测结果，以此验证相对溶解度测定法，参数例如(i)温度，提高多肽的溶解度，(ii)起始多肽浓度，在浓度范围约lmg/mL到约100mg/mL，不影响相对溶解度的测定，(iii)pH，当pH由pH8.0降低至pH6.0，提高溶解度，(iv)緩冲液的离子强度，当离子强度提高时降低溶解度，且可由加入盐(INaCl)补偿，以及(v)蔗糖，提高溶解度，即使多肽的溶解度相对较低也是如此。所有这些结果与用本领域已知的方法改变参数和溶解度的结果一致。因此，相对溶解度测定法可用于提供关于多肽溶解度的有用信息，其与用其它方法测定的溶解度相一致。因此，当测定条件变化时，此处说明的相对溶解度测定法的结果与预测的结果一致，进一步说明测定相对溶解度的PEG沉淀方法适于替代实际溶解度的测定，后者可能需要十倍之多的起始多肽量。使用相对溶解度测定法的高通量筛选(HTS)通过使用96孔板形式或设计为容纳多样品(例如，在孔或刻印网格中)同时分析的其它形式，此处说明的相对溶解度测定可用于大M^莫分析选定的多肽的方法。在此测定法的实例中，相似分子量的不同多肽(例如不同抗体，如果分子量大致等同，其在溶解度图中具有相同的线条斜率)以同样的多肽浓度悬浮，并与一定范围的PEG浓度(例如，约1-20%)在96孔或其它多孔形式例如印制有疏水网格的载片中混合，孵育足够使沉淀产生的时间，视觉筛选沉淀各多肽的最低PEG浓度。而后将最低PEG浓度与多肽的大致相对溶解度相关联。此形式通过测定多肽开始沉淀时PEG的大致浓度，使得多个多肽样品可以相对于彼此进行分析，沉淀的测定是经由观察哪些样品变成可见的混浊或不透明(例如，测定浊度)。因此此技术可省去离心沉淀的需要，而和其它技术中一样得到上清中的浓度读数。但在本方法的一些情况下，也可使用这样的方法(例如，离心和浓度读数)。为分析相对溶解度的高通量筛选测定法的结果(例如，用于筛选多肽集合的相对溶解度的测定法)，可视觉筛选浊度(通过检查样品孔中的乳光)，或者，用UV/可见光分光光度计自动进行此过程，在400-600nm范围测量，例如在500nm。此处使用的术语"乳光"指可检测的浊度或其它表明多肽溶液(例如，PEG/多肽溶液)含有沉淀的可见迹象。在一些情况下，乳光对于人眼而言不可检测。在这种情况下，可通过更灵敏的方法测定对样品例如高通量筛选样品进行分析，这样的方法如分光光度法，例如，自动化的分光光度法，用可见光分光光度计或等同的方法检测样品的吸光度。实施例本发明由下列实施例得到进一步举例说明。实施例仅为说明目的，而不应诠释为以任何方式限制本发明的范围或内容。实施例1.进行多肽的PEG沉淀的一般方法下文所述的实验中使用的所有PEG购自佛鲁卡化学公司(FlukaChemicalCorp.,隆空科马，纽约州)。观察到在緩冲溶液中溶解PEG导致测量的pH明显变化，40%PEG-10K在20mM琥珀酸盐緩冲液中的pH变化达lpH单位。由于PEG浓度增加令pH递增，该pH变化可改变溶解度曲线的斜率。因此，PEG在緩冲液中溶解后，调整40。/。PEG-10K储液的pH值。将多肽透析进入选定的緩沖液，用緩冲液稀释至10mg/mL或515mg/mL，以制备抗体储液。根据表l在1.5mLEppendorf管中加入小份多肽溶液和40%PEG-10K溶液至终体积350|ul，充分混合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>令所有溶液在目标温度平衡至少30分钟。在某些多肽PEG的比例下，观察到沉淀产生。离心所有混合物以分离多肽沉淀，用紫外光和可见光分光光度法在280nm和320nm测定上清。在孵育和离心的全过程中，样品的温度保持在20。C或0。C(在冰水浴中)。由于水在0。C的高热容量，选择0'C的冰水浴以减少温度波动。作溶解度图，用对数线性标度的饱和溶解度数据作为PEG浓度的函数，通过指数函数进行拟合。实施例2，测定多肽-PEG相互作用进行结合实验，以检查目的多肽(选定的多肽)是否与PEG相互作用，因为如果在相对溶解度测定法中与PEG相互作用，会对测定结果的分析造成不利影响。准备两个小柱，在各柱中填入0.5mLMabSelectTMProA树脂(通用电气医疗集团(GEHealthcare),皮斯卡塔韦，新泽西州)。用10mL10mM磷酸盐pH7.0洗涤两个柱以除去乙醇。在各柱中加入2mL30mg/mL相同緩冲液中的抗体(Pl)，将流出液重新注入柱中以保证最大结合。用10mL结合緩沖液(10mM磷酸盐pH7.0)冲洗各柱以除去未结合的多肽。在其中一个柱中加入20o/oPEG-10K(在50mM组氨酸pH6.0中)，而后用10mL相同緩冲液洗涤。用1mL水悬浮各柱中的树脂，将各悬浮液移入10mL冻干瓶。冻干每份两个瓶中的样品。用傅里叶变换红外光i普(FTIR)分析下列三个样品PEG-10K粉，与PEG孵育的冻干ProA-mAb树脂，未与PEG孵育的冻干ProA-mAb树脂。3mg各样品粉与200mgKBr混合，用模压以四p屯压力压成13-mm的饼。用MBFTIR分光计(ABBBomen公司，魁北克，加拿大)进行KBr片的傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。FTIR分析技术通过测量多肽在多种红外线波长的吸收来鉴定有机材料。红外线吸收产生特定分子成份和结构所特有的吸收带。以2cm"分辨率共扫描256次，平均后得到各光傳。获取数据的过程中，不断用干燥空气净化分光计，以排除大气水的光谦影响。如图1中的结果所示，PEG不与Pl结合。尽管考虑用相对溶解度测定法测试缀合多肽，但与选定多肽缀合的分子通常一定不与PEG相互作用。可用本领域已知的方法修改此实施例中说明的方法，以测试PEG与分子的相互作用。实施例3.测定多肽中的结构变化为测定PEG沉淀方法中多肽是否发生任何结构变化，平行分析不与PEG接触的水性Pl抗体和用PEG技术沉淀的Pl抗体。加入40%PEG溶液至PEG终浓度12%，以沉淀10mg/mL处于50mM组氨酸pH6.0中的Pl，离心收集沉淀。将沉淀多肽和30mg/mL的Pl溶液装入配有CaF2窗口的BioCell液槽(生物工具公司(BiotoolsInc.)，沃康达，伊利诺伊州)，用ABBBomenMBFTIR分光计测量。修正光镨中的水的影响，用9点光滑函数(9-pointsmoothingfunction)光滑处理，标准化，用酰胺I区的二阶导数分析。如图2所示，多肽的PEG沉淀不引起多肽二级结构的变化。这样的结果与基于本领域知识做出的预期相符合，因此证实了PEG沉淀方法对于测定多肽的相对溶解度有用。实施例4.PEG沉淀方法的可逆性分析PEG沉淀(相对溶解度测定法)的验证要求测量沉淀之后上清中的多肽含量得到的体积排阻曲线，是在可溶的和沉淀多肽的之间的平衡状态下产生的。平衡状态指反应中多肽的固相和水相之间没有净变化，取决于固相能够恢复成水相("可逆性")。为检验所述方法的可逆性，重新溶解PEG沉淀的P1抗体并重新定量上清，与起始多肽的量相比较。通过在同样緩沖液中加入40%PEG-10K至PEG终浓度为14%，沉淀1mL10mg/mL处于50mM组氨酸pH6.0中的PI抗体。用UV-可见光分光光度计测量上清浓度。在混合物中加入2mL50mM组氨酸pH6.0以完全溶解沉淀，离心，测量上清中的多肽浓度。用浓度和体积相乘计算可溶多肽的总量。如图3的数据所示，重新溶解后复原的PI抗体的量并不显著少于起始量，表明本方法完全可逆，说明满足这种测定要求。实施例5.PEG分子量的影响为比较使用不同分子量PEG的体积排阻的效果，测试使用PEG-10K和PEG-20K的溶解度(图4)。用50mM組氨酸緩冲液，pH6.0悬浮的Pl作为起始多肽，在20。C进行实验。由于PEG-20K沉淀蛋白质的效率较高，沉淀10mg/mLPI需要的PEG-20K浓度(约7%或更多)略低于PEG-10K浓度(约8.5%或更多)。尽管斜率不同，两种类型PEG得到相似的Y轴截距，说明两种PEG类型都得到相似的表观溶解度值。由于PEG-20K储液的高粘度使得制备样品时难以操作；因此，之后的研究选择PEG-10K。实施例6，多肽分子量的影响使用不同分子量的其它多肽，来测试多肽大小对用相对溶解度测定法测量溶解度的影响。图5A表示各测试多肽的结果曲线。用各多肽相应线18条的斜率对多肽的分子量作图，得到的图(图5B)表明随着多肽大小增加，斜率增加。使用PEG引起的多肽沉淀方法的一些显著特点，可通过参照图4加以理解。由截距估计的表观溶解度值为4679mg/mL和5223mg/mL,不正确地偏高。据报道估计的白蛋白最大溶解度为677mg/mL，即基于以六方紧密堆积硬球的堆积密度，在lmL体积中堆积多于667mg蛋白质，在空间上是不可能的(Atha和Ingham，/5"/.C7^附.256:12108-12117(1981))。Atha和Ingham指出，高浓度的多肽得到的截距包括活度相关项，因此超出实际溶解度的限度。于是，对于高溶解度多肽的数据应小心解释。外推的表观溶解度不表示实际溶解度。因此，在以下实验中，应认为PEG沉淀方法是定性的，而不是定量的，即本方法可用于多肽之间的互相比较，而不是用本方法精确测定单个多肽的实际溶解度。实施例7.相对溶解度测定法的重现性两种不同的单克隆抗体即P4(在20mM琥珀酸盐pH6.0中)和Pl(在50mM组氨酸pH6.0中)均按照实施例1中说明的方案用来测试相对溶解度测定法的重现性。溶解度测量重复进行三轮，不在同一天进行(图6A和6B)。在两个温度下，对于两种单克隆抗体，溶解度的预测均显示出良好的重现性。因此，对于多次测试的同个多肽的溶解度，此处说明的方法得到可重现的结果。当PEG沉淀在不同温度下进行(即，测试初始温度两次，得到一致结果，测试第二温度两次，得到一致结果)，仍观察到这样的重现性。这些结果表明，用PEG沉淀方法测定溶解度，多次测定之间没有显著的变化性。这样的特点对于测定法，例如，用于商业用途的相对溶解度测定法来说很重要。实施例8.多肽起始浓度的影响为测定此处说明的PEG沉淀方法是否不受多肽浓度影响，用实施例1中的方法，在5.5mg/mL的低浓度和11mg/mL的高浓度测试P4抗体和Pl抗体两者。改变溶液中的多肽的总含量对于预测的多肽溶解度的影响在图7A和7B中示出。对于两种测试抗体，外推的溶解度值均不受5.5mg/mL和11mg/mL之间多肽总浓度的影响。这些数据表示，测定溶解度的PEG沉淀方法可应用于一定的蛋白质浓度范围。实施例9.温度的影响为测试用于测定相对溶解度的PEG-沉淀方法是否符合已知的温度对于多肽溶解度的影响规律，用实施例1的基本方法测试P4和P1，但在两个不同温度进行0'C和20。C。用此方法发现在升高的温度，表观溶解度增加(图8A和8B)。通过实验，例如，用测试实际溶解度的方法，经验性地发现温度对于溶解度有相似影响。因此，此处说明的PEG沉淀方法与使用测试实际溶解度的方法所预期的结果相符。实施例10.pH的影响测试Pl在不同pH的溶解度(图9)。Pl浓度对于PEG百分比浓度的对数直线反应表明，当pH由pH6降至pH8时，Y轴截距(零PEG浓度，即表观溶解度)降低，但斜率不变。pH图(图10)充分符合多肽pH在其pi(对于Pl为7.5-8.0)左右时具有最低溶解度的预期。这些数据还表明PEG沉淀方法可得到与其它方法，例如，测定实际溶解度的方法相符的结果。实施例11.緩冲液和离子强度的影响用不同緩冲液例如琥珀酸盐、组氨酸和磷酸盐在pH6.0测试Pl抗体的表观溶解度值，不同緩冲液得到不同的结果(图11)。这些数据表明，10mM组氨酸緩沖液的低离子强度，是10mg/mLPl在该緩冲液中没有沉淀产生的原因，之后可通过加入NaCl得到补偿。因此，进行相对溶解度测定法时，离子强度增加可降低蛋白质的溶解度。这符合预期的实际溶解20度测量。这进一步验证了本方法与本领域已知的标准溶解度测定法所获得的结果相一致。实施例12.蔗糖的影响之前的研究表明蔗糖在超滤/透析过滤中增加P5的溶解度。为确认相对溶解度测定方法的可靠性，测定蔗糖对于P5的预测溶解度的影响(图12A和12B)。比较加入或不加2%蔗糖的P5，P5处于10mM组氨酸緩冲液pH6.0中，20。C。这些实验的结果如图12B所示，表明随着蔗糖的加入，P5在测试的两种緩沖液中的预测溶解度均增加。蔗糖引起的溶解度增加的幅度，在低离子强度的緩冲液中通常较高。通过在蔗糖样品和无蔗糖的样品中加入5mMNaCl在相对溶解度测定法中检验这一点。如图12A所示，NaCl大幅降低蔗糖引起的溶解度升高。这些相对溶解度测定法的结果与之前实验测定的蔗糖对溶解度的影响相吻合，进一步验证了相对溶解度方法的有效性。实施例13.在高通量筛选(HTS)中应用相对溶解度测定法为展示相对溶解度测定法在单克隆抗体高通量篩选中的用途，使用用于高通量篩选的96孔板。由于对不同单克隆抗体在所有以上测试的不同条件下(緩冲液、温度、浓度)，其相图的斜率保持不变，为此研究设计了简化形式的HTS。在50mM组氨酸pH6.0中透析所有单克隆抗体，调整其浓度至10mg/mL。用同样緩冲液制备40。/。PEG-10K储液，调整pH至6.0。根据表2，在石英96孔板的孔中装入不同比例的单克隆抗体PEG-10K储液，至每孔终体积为200]Lil。设计为每行为一种特定单克隆抗体，其中PEG终浓度由#1列中的2%增加至#12列中的16%。上下吸液五次以混合所有样品，而后在室温孵育15分钟。当所有单克隆抗体的起始多肽浓度调整至同样的水平时，更易溶的单克隆抗体需要更高百分比的PEG来沉淀。因此，多肽沉淀所需的PEG的最小百分比表明多肽的相对溶解度(图13)。本方法的这种简化形式避免了离心、稀释和沉淀步骤之后上清的浓度测量，使得效率高且需要的多肽材料少。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>使用SPECTRAmaxPlus384微孔板分光光度计(分子仪器公司(MolecularDevicesCorp.)，桑尼维尔，力p利福亚州)在500nm(A500)用吸光度测量90mg/mL单克隆抗体样品的乳光(表示沉淀)，在图14中作出得到的与相对溶解度(即，观察到沉淀的最低PEG浓度)之间的关系。这些结果表明，随着相对溶解度降低，乳光增加。其它实施方案应理解尽管结合发明详述对本发明进行了说明，但以上说明为说明性而不限制本发明的范围，而由所附的权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改落入以下权利要求书的范围之中。权利要求1.一种预测实验多肽相对溶解度的方法，所述方法包括a.提供实验多肽溶液的一个或多个样品，由此提供实验样品；b.将实验样品与不同浓度的聚乙二醇(PEG)接触，由此形成沉淀的样品；c.测定与PEG接触过的各实验样品的沉淀；以及d.将沉淀的样品中实验多肽的沉淀量，与在相应条件下分析的、至少一种参照多肽样品的溶解度相关联，由此确定实验多肽相对于参照多肽样品的溶解度；或将不同实验条件下沉淀的样品中实验多肽的沉淀量关联起来，由此确定各实验条件下实验多肽的相对溶解度。2.权利要求1所述的方法，其中实验多肽为抗体。3.权利要求l所述的方法，其中实验多肽为能够与配体结合的分子。4.权利要求l所述的方法，其中实验多肽为可溶的受体。5.权利要求l所述的方法，其中实验多肽为抗体片断。6.权利要求l所述的方法，还包括用各样品测定的溶解度值的对数，对该样品的PEG浓度作图，将得到的线条外推至PEG百分比为零，由此提供多肽的表观溶解度值。7.权利要求1所述的方法，其中实验多肽不与PEG结合。8.权利要求1所述的方法，其中PEG沉淀为可逆的。9.权利要求l所述的方法，其中PEG不改变实验多肽的二级结构。10.权利要求1所述的方法，其中待分析实验多肽的起始浓度并不大幅影响得到的溶解度值。11.权利要求1所述的方法，其中温度升高提高选定的PEG浓度下的溶解度值。12.权利要求1所述的方法，其中在緩沖液中加入蔗糖提高实验多肽的溶解度。13.权利要求1所述的方法，其中用较高分子量多肽样品的溶解度对数值对PEG浓度作图，得到的曲线的斜率相对于较低分子量多肽的曲线斜率有所增加。14.权利要求l所述的方法，其中参照为溶解度已知的多肽。15.权利要求l所述的方法，其中通过测定浊度测定沉淀。16.权利要求1所述的方法，其中离心沉淀的样品并测定沉淀量，测定上清中的蛋白质的量，或测定沉淀中的蛋白质的量。17.—种测定多肽相对于分子量几乎相同的至少一种其他多肽的相对溶解度的方法，所述方法包括a.提供相同浓度的至少两种不同多肽的样品；b.将各多肽样品与一定浓度范围内的实验PEG相接触；c.测定沉淀多肽样品的最低实验PEG浓度，由此确定沉淀各多肽的PEG最小百分比；和d.将PEG的最小百分比与各多肽相对于其它各多肽的溶解度相关联。18.权利要求17所述的方法，其中至少(b)至(c)以96孔板形式进行。19.权利要求17所述的方法，其中PEG的浓度范围约2%-16%。20.权利要求17所述的方法，其中通过确定导致样品乳光的最小实验PEG浓度，视觉上读取孔板。21.权利要求17所述的方法，其中用自动读板器读取板中样品的乳光。全文摘要本申请说明了一种利用基于聚乙二醇(PEG)的体积排阻沉淀预测多肽相对溶解度的方法。可测试不同的多肽相对于彼此或相对于参照的溶解度。可测试单个多肽在不同实验条件下的相对溶解度。用多肽的溶解度对数对于一定范围的PEG浓度作图，通过基于该图的比较可确定溶解度。另外，提供了对于多个多肽，进行相对溶解度差异的高通量视觉或自动化高通量筛选的方法，其中可省去测量实际溶解度或各样品在各PEG浓度的实际沉淀量的步骤。文档编号G01N33/68GK101449166SQ200780018164公开日2009年6月3日申请日期2007年5月17日优先权日2006年5月19日发明者A·坎托尔,N·W·沃恩,立李申请人:惠氏公司