专利名称：：微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒及其制备、使用方法
技术领域：
：本发明涉及到阳性单克隆抗体的筛选方法的改进，具体的讲就是微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒及其制备、使用方法，其属于免疫学检测
技术领域：
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背景技术：
：1975年Koohler和Milstein创造/杂交瘤技术，经过小断提高，单克隆抗体已经应用于生物学各个领域。主要(1)在食品检测上的应用，具有高度的准确性和敏感性。(2)应用单克隆抗体对病原体进行分型和对抗原结构进行精细研究。(3)用于抗原物质的纯化。(4)在肿瘤方面，研究肿瘤特异性抗原；使用单克隆抗体联接抗肿瘤药，使它尤如导弹一样能准确捕获肿瘤细胞并将其杀死。(5)基础学科上已广泛用于病理、免疫、遗传等学科的研究。(6)在繁殖内分泌学上的应用，促进了生殖生理的发展。(7)在医学界，兽医界，用于诊断与治疗等。由于单克隆抗体的广泛应用，单克隆体制备就越显重要，其制备方法也不断改进与探索，但目前仍以常规方法制备单克隆抗体，常规单克隆抗体制备过程是免疫原的制备，免疫Balb/C小白鼠，进行细胞融合，筛选阳性细胞株，克隆这样几个主要步骤。在制备单克隆抗体中，最难的是选用何种方法来筛选阳性细胞株，因筛选工作量较大，因而快速，简单，准确的筛选方法是科学家们一直探索和追求的。目前常采用的筛选方法主要是间接EL工SA检测，间接免疫荧光检测。制备单克隆抗体的常规抗原主要有三种来源(1)微生物抗原，主要包括各种病原体，如真菌，细菌，病毒等，此类微生物制备的单抗主要用丁诊断和治疗以及微生物精细形态的研究，此类抗原的来源多从生病的人类、家畜、水产养殖动物等体内提取，或是体外培养分离而来，在分离提纯抗原时，很难将抗原提的很纯，或多或少含有一定的组织抗原或是培养基抗原(以下将这些抗原统称为基质抗原)，用ELISA筛选则必须加一基质抗原对照，通过对比筛选出阳性细胞株。来源96孔细胞培养板上同一孔中的抗体，需在酶标板上分入两孔进行检测，一是抗原，二是基质抗原，通过OD值得测量和计算比较才能得到结果，较为繁琐，达不到直观，简便，快速的筛选。另外，来源96细胞培养板上同一孔中的抗体约50-100叱，量较少，再分入两孔进行检测，其量更少则使检测的灵敏度，精确度降低。用间接免疫荧光检测筛选，一是必须有含一定量的抗原的病理组织，二是工作量较大，每次可能需要制备并检测卜.百张免疫荧光片子。(2)半抗原，在免疫原制备中需加载体，其载体就相当于基质抗原，在ELISA筛选中也存在以上同样问题。间接免疫荧光检测一般不用于此类单抗的筛选。(3)组织抗原，此类抗原提纯中，也有基质抗原存在，因而，用ELISA筛选也存在以上同样问题，此类单抗主要用间接荧光筛选。因此，目前，在单克隆抗筛选中，迫切需要一种直观，快速，简便，高通量准确的筛选方法，并能用于任何一种抗原产生的单克隆抗体的筛选
发明内容本发明是针对在单克隆抗筛选中，迫切需要一种直观，快速，简便，高通量准确的筛选方法，并能用于任何一种抗原产生的单克隆抗休的笳选而设计发明的，以达到直观，快速，简便，高通量准确的筛选阳性单克隆抗体的目的。本发明以现有的球术的实际特点，由于其一，现用于阳性单克隆抗体筛选方法的繁琐，复杂，不直观，如ELISA筛选，抗体不能在同一孔中分别与抗原和基质抗原结合来筛选阳性抗体，必需分孔检测，造成用于筛选的抗体量更少，使其检测精确度降低；再是每一实验孔检测结果都耍与其相应基质抗原对照孔检测结果计算比较，因而较繁琐，不直观。其二，间接荧光筛选，虽精确，直观，但不一定有合适的病理组织用于筛选，再是工作量大。而且以上无论是ELISA还是间接荧光筛选，每种方法检测时间至少需要2-3h，并且需要一定的设备与仪器。因而，目前在单克隆抗筛选中，迫切需要一种直观，快速，简便，高通量准确的筛选方法，并能用于任何一种抗原产生的单克隆抗体的筛选。因此，本发明针对现有检测方法存在的问题，利用免疫金渗滤原理，提供了一种微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒及其制备、使用方法，达到了直观，快速，简便，高通量准确的筛选的目的，并可用于任何一种抗原产生的单克隆抗体的筛选和克隆。本发明是由以下技术方案实现的，研制一种微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其包括微孔盖板，微矩阵点样板，硅胶板，硝酸纤维素膜，吸水层，底板，微量点样笔，A液含牛血清白蛋白吐温-磷酸盐缓冲液，B液胶体金标记的抗鼠IgG，C液吐温-磷酸盐缓冲液。所述微孔盖板为96孔，上下贯通，其排列方式以及孔的标识同96孔培养板，孔的底面积为25-55mm、板的厚度为4-8mm，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤。所述微矩阵点样板为192孔，上下贯通，孔的底面积为3-4mm2，其上每两孔为一组，该组孔的位置应位于微孔盖板上的其对应的微孔中，板的厚度为l-4mm，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤。所述的底板，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤，厚度为10-25mm。所述微孔盖板，微矩阵点样板和底板的四角上均留有固定硝酸纤维素膜或吸水层的针(钉)？L。通过此孔用针(钉)固定硝酸纤维素膜和吸水层，使其在更换微孔盖板和微矩阵点样板时，保持位置不变。所述的硅胶板共2块，其形状分别微孔盖板，微矩阵点样板相同，并分别与以上各板配套使用，将其放置在硝酸纤维素膜与以上各板之间，防止盖板和微矩阵点样板孔内液体向孔的四周渗漏的作用。如无渗漏可以不用。所述的硝酸纤维素膜，其膜孔径为0.2-0.8um。所述的吸水层为高分子吸水材料，厚度为5-10mm。所述的微量点样笔，是毛细玻璃管或是毛细塑料管。所述的A液含牛血清白蛋白吐温-磷酸盐缓冲液，B液胶体金标记的抗鼠IgG，C液吐温-磷酸盐缓冲液，均用公知的方法制备。本发明的微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒的使用方法，所述该使用方法的步骤如下(1)抗原的包被底板上放置吸水层，其上是硝酸纤维膜，再放置上微矩阵点样板(可在硝酸纤维膜和微矩阵点样板之间加硅胶板)，并将以上几层上下固定起来，用微量点样笔通过微矩阵点样板上的孔分别将样品点于硝酸纤维膜上，每组孔分别点抗原样和对照样(为基质抗原)，晾干。将微矩阵点样板取下，换上微孔盖板(可在硝酸纤维膜和微孔盖板之间加硅胶板)，按上述方式固定。(2)经微孔盖板上的微孔加入A液，渗入。(3)再加入被筛选的单克隆抗体液，渗入。(4)再加入B液，渗入。(5)再加入C液，渗入。(6)结果判定①每一组中抗原样处出现红色斑点，对照样处无红色斑点，表示此被筛选的抗体为阳性抗体，产生此抗体的细胞株则为筛选中首选的可进行克隆的细胞株。②每一组中抗原样处出现红色斑点，对照样处也出现红色斑点，可根据斑点的颜色强弱来判断(注颜色强于>;颜色弱于<;颜色相同二)i抗原样处红色斑点>对照样处红色斑点，可筛选出继续克隆。i丄抗原样处红色斑点=对照样处红色斑点，可筛选出，如果以上步骤筛选出的阳性细胞株较少，可考虑继续克隆，反之，弃之。iii抗原样处红色斑点<对照样处红色斑点，一般弃之。③每一组结果中抗原样处无红色斑点，对照样处无红色斑点，弃之。本发明主要优点(1)同步筛选本发明的微矩阵点样板，其特点是此板上的孔是成对的，可分别点抗原与基质抗原两个样于硝酸纤维膜上，此成对样点的位置恰好位于微孔盖板h对应的微孔中，因而可对细胞培养板上同一培养孔中的培养液进行筛选。同孔同步检测筛选出是抗抗原还是基质抗原的抗体。(2)成对点样，结果直观利用微矩阵点样板成对样点即抗原与基质抗原两个样，用这一成对样同孔同步筛选阳性抗体，结果直观，易判断。(3)检测快速本发明利用免疫金渗滤原理达到快速检测目的，整个检测过程不超过30分钟。(4)高通量一次可筛选96个样品，并且微孔盖板上的孔与96孔培养板上标识一致，可用于对96孔培养板上的对应孔的抗体进行筛选。(5)操作简单不需其他任何仪器设备，可适用于任何一个制备单克隆抗体的实验室与企业。(6)应用性强可用于任何一种抗原产生的单克隆抗体的筛选和克隆。附图l:为微孔盖板俯视图附图2:为微矩阵点样板俯视图附图3:为底板前视立体图附图4:整个试剂盒组装图附图4中Al为微孔盖板；。2为微矩阵点样板；=i>3为硝酸纤维素膜；。4为吸水层；A5为底板；本发明的实施例结合附图进一步描述如下具体实施方式实施例1.所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒具体使用方法如下(1)将微矩阵点样板，硝酸纤维素膜，吸水层，底板按附图4上下顺序组装，以上几层用镙丝或弹簧扣上下固定；(2)包被抗原用微量点样笔将抗原通过微矩阵点样板.匕的孔点在硝酸纤维膜上，每组孔点一抗原样，点一对照样(为基质抗原)，晾干。将微矩阵点样板取下，换上微孔盖板，按上述方法上下固定；(3)经微孔盖板上的微孔加入含W。牛血清A蛋A、0.05。/。吐温-0.01M磷酸盐缓冲液100lil，渗入；(4)加入被筛选的单克隆抗体液50-100ul，渗入；(5)加胶体金标记的羊(兔)抗鼠IgG100ul，渗入；(6)加入O.05%吐温-0.OlM磷酸盐缓冲液lOOy1，渗入。(7)筛选结果判断，所述筛选结果判断方法见实施例2注以上实施过程中，如果微孔板或微矩阵点样板孔内液体向孔的四周渗漏时，将与其配套的硅胶板加在硝酸纤维膜与以上各板之间，以防渗漏。实施例2.如实施例1所述筛选结果判断方法，由以下现象与原理实现的(1)每一组结果中抗原样处出现红色斑点，对照样处无红色斑点，此结果说明此被筛选的抗体中只有抗抗原的抗体，无抗基质抗原的抗体，因而其为阳性抗体，产生此抗体的细胞株为首选，可继续克隆。(2)每一组结果中抗原样处出现红色斑点，对照样处也出现红色斑点，此结果说明产牛此抗体的细胞株中既有抗抗原的，也有抗基质抗原的细胞株。以何种细胞株为主，则可根据斑点的颜色强弱来判断i抗原样处红色斑点>对照样处红色斑点，此结果说明产生此抗体的细胞株以抗抗原的细胞株为主，可筛选出继续克隆。ii抗原样处红色斑点=对照样处红色斑点，此结果说明产牛此抗体的细胞株既有抗抗原的，也有抗基质抗原细胞株，或是以抗基质抗原细胞株为主。如果以上步骤筛选的阳性细胞株较少，可筛选出，考虑继续克隆，反之，弃之。iii抗原样处红色斑点<对照样处红色斑点，此结果说明产生此抗体以抗基质抗原细胞株为主，或是只有抗基质抗原细胞株，一般弃之。(3)每一组结果中抗原样处无红色斑点，对照样处无红色斑点，此结果说明既无抗抗原的抗体也无抗基质的抗体，弃之。实施例3.微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒筛选结果与间接免疫荧光检测法筛选结果比较。共取30孔杂交瘤(抗虾白斑病毒)细胞培养液，用微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒检测结果见表1，用间接免疫荧光检测感染虾白斑病毒的虾鳃结果见表2:表1试剂盒检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从表1可见抗体现较强阳性，并可继续克隆的共9孔；从表2可见抗体现较强阳性，并可继续克隆的共9孔；并且，两组孔号均是对应的。相符率100%。其余21孔只有1孔结果不同，相符率达95%以上。结论微矩阵快速筛选阳性争克隆抗体试剂盒在筛选阳性单克隆抗体中其精确度同间接免疫荧光检测筛选法。权利要求1、微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒包括微孔盖板，微矩阵点样板，硅胶板，硝酸纤维素膜，吸水层，底板，微量点样笔，A液含牛血清白蛋白吐温-磷酸盐缓冲液，B液胶体金标记的羊(兔)抗鼠IgG，C液吐温-磷酸盐缓冲液。2、如权利要求1所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗休试剂盒，其特征为所述微孔盖板为96孔，上下贯通，其排列方式以及孔的标识同96孔培养板，孔的底面积为25-55咖2，板的厚度为4-8鹏，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤。3、如权利要求l所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述微矩阵点样板为192孔，上下贯通，孔的底面积为3-5mm2，其上每两孔为一组，该组孔的位置应位于权利要求2所述微孔盖板上的其对应的微孔中。板的厚度为l-4mm，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤。4、如权利要求1所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述的底板，其材质为亚克力，或是塑料，或是化纤，厚度为10-25mm。5、如权利要求1所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述微孔盖板，微矩阵点样板，底板各板的四角上均留冇固定硝酸纤维素膜和吸水层的针(钉)孔。通过此孔用针(钉)固定硝酸纤维素膜和吸水层，使其在更换微孔盖板和微矩阵点样板时，保持位置不变。6、如权利要求l所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述的硅胶板共2块，其形状分别与微孔盖板，微矩阵点样板相同，并分别与以上各板配套使用，将其放置在硝酸纤维素膜与以上各板之间，防止板孔内液体向孔的四周渗漏的作用。7、如权利要求l所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述硝酸纤维素膜其膜孔径为0.2-0.8um。8、如权利要求1所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述吸水层为高分子吸水材料，厚度为5-10mm。9、如权利要求l所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述微量点样笔是毛细管。可以是玻璃或是塑料毛细管。10、如权利要求1所述微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒，其特征为所述微孔盖板，微矩阵点样板，硅胶板，硝酸纤维素膜，吸水层，底板的组装可用弹簧夹子，或是弹簧扣子，或是螺丝固定。全文摘要本发明提供一种微矩阵快速筛选阳性单克隆抗体试剂盒及其制备、使用方法，涉及免疫检测
技术领域：
。该试剂盒包括微孔盖板，微矩阵点样板，硅胶板，硝酸纤维素膜，吸水层，底板，微量点样笔，A液含牛血清白蛋白-吐温-磷酸盐缓冲液，B液胶体金标记的羊(兔)抗鼠IgG，C液吐温-磷酸盐缓冲液。该试剂盒使用方法是利用免疫金渗滤原理对微孔中硝酸纤维素膜上包被的抗原-单抗-金标羊(兔)抗鼠IgG复合物进行检测。该试剂盒特点是高通量检测样本，每一微孔中可通过微矩阵点样板包被一阳性抗原和一对照抗原，同时对其进行检测比较，使单克隆抗体的筛选工作直观快速，简便高效，可用于任何一种抗原产生的单克隆抗体的筛选和克隆。文档编号G01N33/577GK101275949SQ200810015070公开日2008年10月1日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者王晓洁申请人:鲁东大学