一种邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的筛选方法及其应用，属于生物【技术领域】，该模拟抗体是利用核糖体展示技术从Lipocalin模拟抗体库中筛选出来的，利用基因工程技术进行了可溶性功能表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的方法。本发明筛选出的邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体可以应用于邻苯二甲酸二甲酯超标检测与研制邻苯二甲酸二甲酯残留快速检测试剂盒。
【专利说明】-种邻苯二甲酸二甲醒模拟抗体的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的筛选方法，属于生物【技术领域】，用 于制备特异识别邻苯二甲酸二甲醋的模拟抗，该模拟抗体还可W用于研制快速检测邻苯二 甲酸二甲醋残留的免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二甲醋（dimethyl地thalate，W下简称DMP)为无色透明微黄色油状 液体，稍有芳香味，沸点为283. 7C的增塑剂。能与己醇、己離等一般有机溶剂混溶，不溶于 水和石油離。其分子式为〔1化。〇4,摩尔质量为194. 19g/mol。邻苯二甲酸二甲醋化合物是 世界上广泛使用的人工合成有机物，易于富集，不易生物降解。由于产量的增加和广泛的使 用，导致在我国食品、大气、天然水体和±壤中都发现有它们的存在，已成为全球分布最广 泛的污染物之一，分别被美国环保局和中国环境监测总站确定为优先控制的污染物。因此 需要建立一套快速简便、灵敏的检测方法。
[0003] 核糖体展示技术（ribosome display,畑）是一种简便有效的新型体外筛选和分子 进化功能性蛋白质的生物文库技术，它将可扩增的基因组信息DNA或RNA与可选择的蛋白 质联系在一起。RD技术中mRNA缺乏终止密码子并经过适当修饰，在体外翻译过程中核糖 体会停留在mRNA的3'末端，mRNA与翻译产物均不从核糖体上解离下来，形成十分稳定的 "mRNA-核糖体-蛋白质"H元复合物，该种H元复合体形式将蛋白质和mRNA信息连接到一 起，应用RD可进行特殊功能的肤和蛋白质筛选。
[0004] Lipocalin是从低等生物（细菌）到高等哺乳类动物都含有的一组胞外亲脂蛋白 的总称，是广泛存在于自然界功能多样的小分子蛋白质家族，从低等生物（细菌）到高等哺 乳类动物（包括人类）均发现其踪迹。尽管脂质运载蛋白在不同生物中发挥着不同的生理 学功能，但运输和胆存低溶解度物质或化学敏感性物质，如芳香素、维生素、类固醇类激素、 多种二级代谢产物和信息素是它们最典型的生物学功能。由于脂质运载蛋白家族的高级结 构特征与抗体类似，且脂质运载蛋白又具备一些抗体所没有的优点，因此，W Lipocalin为 骨架构建的突变文库得到了越来越广泛的应用。尽管Lipocalin在一级结构上存在多样 性，但其二级结构与四级结构却梅人的相似：由8条反相平行的目折叠片与一个a螺旋 扭曲形成一个桶状结构，形成了 "Lipocalin支架"结构，含有一个配体结合位点，桶的开口 端由连接目条带的多个Loop组成，是整个分子比较柔初的部分，且氨基酸成员为极性氨基 酸，Loop环是其随机突变的区域。研究表明，通过改造Lipocalin骨架作为特异性配体可 W结合特定祀标，亦即通过设计Lipocalin的支架可模拟抗体与小分子结合，该些经过设 计模拟的Lipocalin突变体具有类似抗体的结合特异性，因此可W成为模拟抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是提供一种潜在的检测用邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体。
[0006] 本发明的第二个目的提供一种邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的制备方法。
[0007] 本发明的技术方案概述如下：
[0008] 本发明提供的邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体是从核糖体展示Lipocalin模拟抗体 库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。
[0009] 本发明提供的邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的制备方法为：
[0010] 1. Lipocalin模拟抗体库的扩增
[0011] 选择胆汁H帰结合蛋白化ilin binding protein, tibp)作为Lipocalin库的模 板，设计随机突变位点，W合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸 PCR扩增来合成Lipocalin模拟抗体库片段，约52化。再通过PCR方法添加大小为10化P 核糖体展示元件T (包括T7启动子，5'茎环，核糖体结合位点）和大小为298bp间隔序列 P(瞻菌体P蛋白部分序列），含3'茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全 一致，最终构建成功的核糖体展示Lipocalin模拟抗体库，该库转录后的RNA分子包括一个 5' -loop和3' -loop茎环结构，一个核糖体结合位点，随机突变的Lipocalin库，C末端间 隔序列等，全长约95化P。
[0012] 其中突变库的模板可W是其他Lipocalin分子，优选化P。
[0013] 2.抗邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的筛选
[0014] 在为微孔板上包被DMP-0VA和DMP-BSA作为抗原进行交替筛选。将构建的核糖 体展示Lipocalin模拟抗体库通过体外翻译系统转录翻译后，加入到筛选孔中赔育，通过 改变Mg"浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA H联体解离，得到相应的mRNA，经过 RT-PCR获得筛选后的DNA文库。得到的DNA文库与核糖体展示元件T启动子和P蛋白连 接。然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模 拟抗体DNA文库。经过五轮核糖体展示筛选后，mRNA经过紫外分光光度法测定，结果显示 吸光度明显增加，模拟抗体文库中抗原阳性的模拟抗体序列明显富集。
[0015] Mg化浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。
[0016] 3.邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的可溶性功能表达
[0017] 将五轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，挑选出无致死突变的20个克隆子， 将该基因与pTIG-Trx连接成表达载体，在大肠杆菌化21 0E3)中表达，经SDS-PAGE和 Western Blotting鉴定，在20邸a处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物 存在于破碎菌体后的上清液中，W空质粒宿主菌为对照，DMP-0VA为包被原DMP为竞争小分 子，竞争ELSIA检测诱导上清的竞争结合活性，有竞争结合活性的进一步大规模诱导表达 并纯化。
[0018] 模拟抗体的表达可W采用原核表达载体如地V220，pET系列载体，优选pTIG-Trx。
[0019] 标签蛋白可W为麦芽糖结合蛋白、6X组氨酸标签等，优选6X组氨酸标签。
[0020] 4.邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的纯化与鉴定
[0021] 利用anti-6X化S tag亲和层析柱对表达的特异结合物进行了纯化，使目的条带 得到了明显的浓缩和分离，竞争化ISA分析纯化后产物的竞争结合活性。sra法检测所获模 拟抗体的亲和力。
[0022] 本发明可W提供一种测定环境和食品中邻苯二甲酸二甲醋残留的检测试剂盒中 的最关键检测试剂一特异结合模拟抗体。本发明所制备的邻苯二甲酸二甲醋模拟抗体的 优势在于；（1)利用DMP-0VA和DMP-BSA交替筛选可W克服载体蛋白BSA和OVA对模拟抗 体的干扰（2)所获得的Lipocalin-DMP序列清楚，便于基因工程操作，易于在大肠杆菌中可 W大量功能表达；（3)分子量小，，为将来的进一步临床应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[002引图ILipocalin模拟抗体库的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA marker, 1为核糖体展 示Lipocalin模拟抗体全库DNA，2为阴性对照。
[0024] 图2轮筛选后每轮产物的产量分析，A为筛选后五轮的RT-PCR产物图，1-5 ;第1-5 轮筛选，6为阴性对照；B为筛选后五轮产物在紫外下mRNA吸光度，1-5 ;第1-5轮筛选。
[00巧]图化ipocalin-DMP诱导表达产物的鉴定，其中A图诱导产物破碎后上清的 SDS-PAGE电泳图，B图为蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，C图为相应的Western-blotting 图；1、2为Lipocalin-DMP上清，3为空质粒阴性对照，5、6为纯化后蛋白，7、8为相应的 Western-blotting后的蛋白条带，M为蛋白Marker。
[0026] 图4直接化ISA分析模拟抗体Lipocalin-DMP的结合活性。
[0027] 图5间接竞争化ISA分析模拟抗体Lipocalin-DMP的竞争结合活性。
[002引图6SPR分析模拟抗体Lipocalin-DMP的结合动力学常数。
【具体实施方式】
[0029] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可 从常规试剂公司购买得到。
[0030] 实施例1核糖体展示Lipocal in模拟抗体的扩增 [003U 1.弓I物合成
[0032] 根据bbp序列及构建Lipocalin抗体库需要改变的突变位点来设计合成引物，随 机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T ;K为G和T)，同时设计与核糖体展示元件相连的引 物，主要引物如下表所示。
[003引表1寡核巧酸引物
[0034]
【权利要求】
1. 一种邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的制备方法，主要由以下步骤组成： (1) 核糖体展示Lipocalins模拟抗体库的构建 选择胆汁三烯结合蛋白（bilin binding protein, bbp)作为Lipocalins库的模板， 设计随机突变位点，以合成的BBP基因序列为模板，Lipocalins模拟抗体库片段约522bp。 通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功 的核糖体展示Lipocalins模拟抗体库，全长约950bp。该库转录后的RNA分子包括一个 5' -loop和3' -loop莖环结构，一个核糖体结合位点，随机突变的Lipocalins库，C末端间 隔序列等。； (2) 抗邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的筛选 将构建的核糖体展示Lipocalins模拟抗体库进行体外转录翻译后，用DMP-BSA和 DMP-0VA作为抗原交替筛选邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体，通过降低Mg2+浓度将筛选得到的 模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文 库；然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟 抗体DNA文库；经过五轮核糖体展示筛选后，得到的mRNA经紫外分光光度法测定，结果显示 吸光度明显增加，且RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中 抗原阳性的抗体得到了富集。 (3) 邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的可溶性功能表达 将五轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子，将该基因与 pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴 定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的 上清液中，以空质粒宿主菌为对照，DMP-BSA和DMP-0VA为包被原，DMP为竞争小分子，竞争 ELSIA检测诱导上清的竞争结合活性，有竞争结合活性的进一步大规模诱导表达并纯化； (4) 邻苯二甲酸二甲酯模拟抗体的纯化与鉴定 利用Anti-Histag亲和层析柱对表达的特异结合物进行了纯化，使目的条带得到了明 显的浓缩和分离，竞争ELISA分析纯化后产物的竞争结合活性；SPR法检测所获模拟抗体的 亲和力。
2. 权利要求1所述随机突变库的模板可以是其他lipocalin分子，优选bbp。
3. 权利要求1所述筛选方法中的包被原可以选用DMP-BSA，还可以选用DMP-0VA进行 筛选，优选交叉筛选。
【文档编号】C07K16/44GK104513315SQ201310450947
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】宁保安, 高志贤, 彭媛, 白家磊, 赵丽, 刘建青, 孙思明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所