专利名称：测定草酸浓度的简便方法
测定草酸浓度的简便方法
技术领域：
本发明涉及草酸的浓度测量技术领域，具体地说，是利用合成的金属络 合物与草酸被草酸氧化酶分解所产生的产物过氧化氢反应，生成一种能够被 紫外吸收的物质从而测定草酸浓度的简便方法。
背景技术：
草酸是一种在细胞代谢过程中大量产生的、对几乎所有的生物体都有毒 性的有机物，其在人体内大量累积会导致多种疾病。测定血液、尿液、蔬菜、 植物中草酸的浓度，对高草酸尿症、慢性肾功能衰竭以及肾结石等与草酸相 关疾病的预防、诊断和治疗都有很重要的理论意义和实际应用价值。因此， 如何简单、准确、有效地测定草酸的浓度一直是人们探索的课题。目前文献 报道测定草酸浓度的方法可以分为以下几种(1)直接沉淀法，(2)溶剂萃
取法，(3)同位素稀释法，(4)色谱法(气相和液相法)，(5)酶法(包括溶 解和固相化的酶)，(6)流动方法，(7)其它方法。
其中，直接沉淀法和溶剂萃取法灵敏度较低；同位素稀释法因为使用放 射性同位素，所以限制了该方法在人体的应用，而且整个过程需要的样品量 较大；色谱法在样品量(体积)较小方面有一定的优势，但需要较长的准备 色谱柱的时间和特定的仪器设备；酶法主要是测定草酸被分解后的产物C02 和过氧化氢，其中C02可通过检测缓冲溶液的pH值变化来检测，但反应时间 较长，而且需要较大量的样品(体积)；过氧化氢在第二种酶，如过氧化物酶的催化下，可以使指示剂，如酚红，己二酸二甲酯(DMA)和3-甲基-2-苯并噻 唑腙盐酸盐(MBTH)产生能够被紫外吸收的物质，从而间接检测草酸的浓度; 但这种方法的背景读数较大，而且经过两次酶促反应，误差较大，尽管如此， 酶法因其快速灵敏仍被广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供误差小，灵敏度高，成本 低，时间短的测定草酸浓度的简便方法。
本发明是利用一种合成的金属络合物与草酸被草酸氧化酶分解所产生的 产物过氧化氢发生反应，生成一种能够被紫外吸收的物质来测定草酸浓度的 简便方法。
为实现以上发明目的，本发明测定草酸浓度的简便方法为
(1) 在2-氯甲基吡啶与P-丙氨酸类化合物的水溶液中，在pH 8 — 10的 条件下进行反应，反应完毕后用乙酸乙酯萃取，除掉未反应完的原料，再用 氯仿进行萃取，保留有机相，除去氯仿后，得到3NO类配体；合成的配体和 高氯酸锰在甲醇中反应生成锰络合物，其中，3NO类配体是指配体中含有三 个氮原子和一个氧原子与锰离子配位；
(2) 将制备的金属锰络合物溶解在pH为6.0， 20mM丁二酸钠缓冲溶液 里，再和浓度为1 400 nM的过氧化氢标准样品在5(TC下反应40分钟，测 定反应产物在波长为450 nm的吸光度，做出过氧化氢的标准样品在波长为450 nm时吸光度的标准曲线，其中，正常尿样中草酸的浓度范围大约为1 400 ^M， 450 nm是指金属络合物与过氧化氢反应生成络合物的紫外吸收波长；
G)将未知草酸浓度的样品与过量草酸氧化酶加入到pH为6.0， 20 mM丁二酸钠缓冲溶液中进行反应10分钟；
(4)再将步骤(3)的产物与步骤(1)制备的金属络合物进行反应，测 定反应产物在波长为450nrn的吸光度，然后与过氧化氢的标准样品在波长为 450nrn时吸光度的标准曲线比较，就可得到样品中草酸的浓度。
所述的锰络合物，是指含有单个或多个锰离子的络合物。
本发明测定草酸浓度的简便方法的积极效果是
(1) 金属络合物本身在波长为450 nm的吸收很小，因此几乎没有受到 金属络合物的影响；
(2) 金属络合物稳定性好，适用pH范围为3 6;
(3) 金属络合物与过氧化氢反应后，产物能够被波长为450 nm紫外吸 收，而不需要加入第二种酶和指示剂进行染色，减少了测试误差；
(4) 检测所用的样品(体积)较小；
(5) 该方法的灵敏度较高，最低可以检测到草酸浓度lpM;
(6) 检测过程中只需要紫外吸收仪等简单的仪器，成本低，时间短，易 于推广。
具体实施方式
以下提供本发明的测定草酸浓度的简便方法的具体实施方式
，共提供2 个实施例，但本发明不限于所提供的实施例。
过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线绘制 (1)在2-氯甲基吡啶与P-丙氨酸类化合物的水溶液中，将其pH调到8-10 进行反应，反应完成后，再用乙酸乙酯萃取除掉未反应完的原料，再用氯仿 萃取，保留有机相，除去氯仿后，得到3N0类配体；合成的配体和高氯酸锰在甲醇中反应生成锰络合物；
(2)取上述的金属锰络合物lmM，溶解在pH为6.0， 20 mM 丁二酸钠 缓冲溶液里，再与浓度为1 400 pM的过氧化氢标准样品在5(TC下反应40 分钟，测定反应产物在紫外吸收波长为450nm时的吸光度，做出过氧化氢的 标准样品在波长为450 nm时吸光度的标准曲线，其中，1 mM金属锰络合物 是能够检测到lpM草酸的金属锰络合物的最低浓度。
实施例1测定己知草酸浓度的标准样品
(1) 将样品100微升和过量草酸氧化酶在.40。C， pH为3.5， 20mM丁二 酸钠缓冲液中反应10分钟；
(2) 将步骤(1)得生成的过氧化氢和金属络合物加入到pH为6.0， 50 mM 的丁二酸钠缓冲液中在50"C下反应40分钟；
(3) 测定步骤(2)得到的混合物在紫外吸收波长为450nm时的吸光度； 再与过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线对照，可得到 样品中草酸的浓度。
实施例2测定正常人尿样中草酸浓度
(1) 尿样预处理首先将尿样用浓盐酸酸化，用丁二酸将样品，pH调 至3.5，稀释3倍后，用活性碳处理样品，过滤，滤液为预处理后的尿样；
(2) 取预处理后的尿样500微升与草酸氧化酶加入到30°C, pH为3.5， 20 mM 丁二酸钠缓冲液中反应10分钟；
(3) 将金属锰络合物与步骤(2)生成的过氧化氢在pH为6.0， 2ml的 50 mM的丁二酸钠缓冲液中在50'C下反应40分钟；(4)测定步骤(3)反应产物在紫外吸收波长450nm时的吸光度，与过 氧化氢的标准样品在波长为450nrn时吸光度的标准曲线比较，获得尿样中草 酸的浓度为453 505j^M。
权利要求
1.测定草酸浓度的简便方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将2-氯甲基吡啶与β-丙氨酸类化合物的水溶液在pH 8-10的条件下进行反应，反应完毕后用乙酸乙酯萃取，除掉未反应完的原料，再用氯仿萃取，保留有机相，除去氯仿后，得到3NO类配体；合成的配体和高氯酸锰在甲醇中反应，得到锰络合物；(2)将制备的金属锰络合物溶解在pH为6.0，20mM丁二酸钠缓冲溶液里，再和浓度为1～400μM的过氧化氢标准样品在50℃下反应40分钟，测定反应产物在波长为450nm的吸光度，做出过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线；(3)将未知草酸浓度的样品和过量草酸氧化酶加入到pH为6.0，20mM丁二酸钠缓冲溶液中进行反应10分钟，将草酸完全转化为等量的过氧化氢；(4)再将步骤(3)的产物与步骤(1)制备的金属络合物进行反应，测定反应产物在波长为450nm的吸光度，然后与过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线比较，就可得到样品中草酸的浓度。
2. 根据权利要求1所述的测定草酸浓度的简便方法，其特征在于，所述 的锰络合物，是指含有单个或多个锰离子的络合物。
全文摘要
本发明涉及测定草酸浓度的简便方法，其步骤为(1)利用合成的3NO类配体和高氯酸锰进行反应，制备锰络合物；(2)将制备的金属锰络合物和浓度为1～400μM的过氧化氢标准样品进行反应，测定反应产物在波长为450nm的吸光度，做出过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线；(3)将未知草酸浓度的样品与过量草酸氧化酶进行反应，将草酸分解为等量的过氧化氢；(4)再将步骤(3)的产物与步骤(1)制备的金属络合物进行反应，测定反应产物在波长为450nm的吸光度，然后与过氧化氢的标准样品在波长为450nm时吸光度的标准曲线比较，就可得到样品中草酸的浓度。该方法的优点是简单，灵敏度高，成本低，时间短。
文档编号G01N21/75GK101493417SQ20081003288
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者姜晓军, 左冠科, 张井岩 申请人:华东理工大学