专利名称：：评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法
技术领域：
：本发明涉及巻烟烟气冷凝物毒性评价领域，具体说是一种评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，是利用小鼠微核试验来评价巻烟烟气毒性，本发明的方法为评价巻烟烟气毒性提供一种灵敏性高、结果可靠的手段。
背景技术：
：近年来，国际上对烟草制品及烟用添加剂的危害性评^f介开展了大量研究工作。1999年FDA(美国食品药品管理局)要求I0M(美国科学院医学研究所)制定一套科学的方法，用于评估长期使用药物产品或者烟草替代产品(用于降低而不是消除烟草危害)的安全性和效果。才艮据目前的研究结果，感受烟草产品的生物标记已得到—睑证并应用。但是，生物标记的早期指标在用于预测后期的疾病发展上几乎没有得到验证，目前已有的知识尚不足以支持进行正式的"低危害"巻烟产品评估。体外毒性测试并非危害的直接测定，但可以确保烟草产品不会增加潜在的危害，毒理学数据可以在一定程度上支持"低危害"巻烟产品的评价。C0RESTA(国际烟草科学研究合作中心)也成立了相关的工作组(烟草烟气体外毒性测试工作组)，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，确定主要的方法。根据研究结果，对于细胞遗传学/突变的哺乳动物细胞分析，工作组推荐体外孩t核分析(Micro露leusTest)、染色体畸变分析或L5178Y小鼠淋巴瘤分析[DooliUle，D.J.，Massey，E.D.,CORESTATaskForceOnInVitroToxicityTestingofTobaccoSmoke,烟草制品及巻烟添加剂安全评价与低潜在性危害巻烟产品开发国际研讨会，杭州，2004.10]。目前国内外评价巻烟烟气毒性的微核分析均采用体外法，该方法虽然筒单，但可信度较低。微核检测将细胞成制涂片，固定染色后用显微镜计数1000个多染红细胞的微核数，计数工作量极大，人为影响因素多，且容易出现微核误判。
发明内容本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而开发的一种评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，即采用体内樣史核试验，利用抗体荧光标记法直^l妄测定凝:核率，该方法灵敏性高、结果可靠。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法是采取体内微核试验方式，通过小鼠灌胃染毒、细胞培养、固定、染色后，采用抗体荧光标记法直接测定樣t核率。本发明的具体检测方法包括以下步骤a、选择小鼠；b、巻烟烟气凝集物制备按标准吸烟法，将烟气分别经过装有有才M目(乙酸乙酯)和无机相(基础培养液)的空气采样器收集，将有机相与无机相培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1-2支烟/ml，-80。C保存；c、小鼠进行巻烟烟气冷凝物(CSC)染毒，每鼠灌胃口服急性毒性剂量的l"LD50，1/札DS0和1/8LD50,正常对照组灌胃同体积的基础培养液；d、抽血进行培养、固定、染色、计数，36h后取尾静脉血5nL加入含肝素的40juLNaHC03緩冲液中，加入-80。C预冷的lml曱醇，置-80。C中固定24h以上；取100juL固定好的血样加入O.5ml4。C预冷的NaHC03緩冲液中(0.9%NaCl，5.3mmol/LNa跳，调pH7.5)，离心(3000转/min,10min),去上清，分别加入10mLRNA酶(10mg/ml，沸水灭活15min)、0.5pLCD71抗体(0.5mg/mL)、70jiLNaHC03緩冲液，4。C放置1~2h后37。C温育45min。加入300"L4。C预冷的PI(硤化丙啶，1.33Mg/ml)，混勻，4'C染色过夜。用流式细胞仪检测20000个网织红细胞中的微核细胞数，实验结果用每100o个网织红细胞中的孩吏核细胞数表示；e、实验结果进行处理和分析，评价巻烟烟气毒性。所述小鼠为6-7周龄，体重18-22克，为二级NIH小鼠。在本发明中，离心分离时转速3000转/min,时间10min。本发明具体要求是l.试验动物二级NIH小鼠(6-7周龄，体重18-22g)，雌雄各半(每种巻烟20只)。2.检疫(3d)合格的NIH小鼠，进行巻烟烟气冷凝物(CSC)染毒，如果比较不同巻烟的微核，则以CSC口服毒性最大的巻烟剂量为准，正常对照组灌胃同体积的&出培养液。本发明相比现有技术的优点在于方法灵敏性高，结果可靠，开创了一种新型的用于评价巻烟烟气毒性的检测方法。具体实施方式本发明以下结合不同类型巻烟(实施例)作进一步描述实施例1对某一国产烤烟型品牌巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(基本培养液)收集。将有机溶剂与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。-8(TC保存，CSC经口服毒性测得其中一个LD50高者为13.2支/Kg，则1/2LD50为6.6支/Kg、将购于中国药品生物制品检定所SPF级NIH-q小鼠(体重18-22g)随机分为正常对照组、阳性对照组(环磷酰胺SOmg/Kg)和巻烟组(因组别较多采用单一剂量6.6支/Kg),每组20只(雌雄各半)，分別给药，36h后取尾静脉血5juL加入含肝素(10u/ml)的40pLNaHC03緩冲液中，加入-80。C预冷的lml曱醇(将加入1.0ml分析纯曱醇的1.5ml离心管置于含1/3水的乙醇中，放入-80。C冰箱过夜)，置-80。C中固定24h。取100liL固定好的血样加入O.5ml4。C预冷的NaHC03緩冲液中(0.9%NaCl,5.3mmol/LNaHCO"调pH7.5),离心(3000转/min,10min)，去上清，分别加入10juLRNA酶(10mg/ml，沸水灭活15min)、0.5juLCD71抗体(0.5mg/mL)、70juLNa线緩冲液，4'C放置1-2h后37。C温育45min。加入300jliL4'C预冷的PI(碘化丙啶，1.33|ag/ml)，混匀，4。C染色过夜。用流式细胞仪检测20000个CD71阳性细胞(网织红细胞)中的PI阳性细胞数，微核率(％。)=(CD7rPl7(CD7r+CD7rPD}*1000。某一国产巻烟烟气诱发小鼠微核形成率(％。)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2对某一国产混合型巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(基本培养液)收集。将有机溶剂与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。-80匸保存，CSC经口I良毒性测得其中一个LD50高者为13.2支/Kg,则1/2LD50为6.6支/Kg、将购于中国药品生物制品检定所SPF级NIH-q小鼠(体重18-22g)随机分为正常对照组、阳性对照组(环磷酰胺50mg/Kg)和各巻烟组(因组别较多采用单一剂量6.6支/Kg),每组20只(雌雄各半)，分别给药，36h后取尾静脉血5iaL加入含肝素(10u/ml)的40yLNaHC03緩沖液中，加入-80。C预冷的lml曱醇(将加入1.0ml分析纯曱醇的1.5ml离心管置于含l/3水的乙醇中，放入-80。C水箱过夜)，置-80。C中固定24h。取100mL固定好的血样加入0.5ml4。C预冷的NaHC03緩冲液中(0.9%NaCl，5.3mmol/LNaHC03,调pH7.5),离心(3000转/min，10min)，去上清，分别加入10juLRNA酶(10mg/ml，沸水灭活15min)、0.5jiLCD71抗体(0.5mg/mL)、70jLiLNaHCO3緩冲液，4。C放置l-2h后37。C温育45min。加入300juL4。C预冷的PI(碘化丙啶，1.33jug/ml)，混匀，4。C染色过夜。用流式细胞仪4企测20000个CD71阳性细胞(网织红细胞)中的PI阳性细胞数，<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3对某一境外巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(基本培养液)收集。将有机溶剂与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。-80°(:保存，CSC经口服毒性测得其中一个LD50高者为13.2支/Kg，则1/2LD50为6.6支/Kg、将购于中国药品生物制品检定所SPF级NIH-q小鼠(体重18-22g)随机分为正常对照组、阳性对照组(环磷酰胺50mg/Kg)和各巻烟组(因组别较多采用单一剂量6.6支/Kg),每组20只(雌雄各半)，分别给药，36h后取尾静脉血5jiL加入含肝素(10u/ml)的40jaLNaHC03緩冲液中，加入-80。C预冷的lml曱醇(将加入1.Oml分析纯曱醇的1.5ml离心管置于含l/3水的乙醇中，放入-80。C冰箱过夜)，置-80。C中固定24h。取100pL固定好的血样加入0.5ml4'C预冷的NaHC03緩沖液中(0.9%NaCl,5.3mmol/LNaHC03，调pH7.5)，离心(3000转/min，10min)，去上清，分别加入10iaLRM酶(10mg/ml，沸水灭活15min)、0.5yLCD71抗体(0.5mg/mL)、70juLNa线緩冲液，4。C放置12h后37。C温育45min。加入300iaL4。C预冷的PI(碘化丙啶，1.33|ag/ml)，混匀，4。C染色过夜。用流式细胞4义;险测20000个CD71阳性细胞(网织红细胞)中的PI卩曰性细胞数，微核率(％。)=(CD71+Pl7(CD7r+CD7rpr)}*1000。某一境外巻烟烟气诱发小鼠微核形成率(％。)巻烟类别微核形成率(％。)境外巻烟24.69权利要求1.一种评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，其特征在于采取体内微核试验方式，通过小鼠灌胃染毒、细胞培养、固定、染色后，采用抗体荧光标记法直接测定微核率。2、根据权利要求1所述的评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，其特征在于该4企测方法包括以下步骤a、选择小鼠；b、巻烟烟气凝集物制备:按标准吸烟法，将烟气分别经过装有有机相(乙酸乙酯)和无才;i4目(基础培养液)的空气采样器收集，将有机相与无机相培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1-2支烟/ml，-80。C保存；c、小鼠进行巻烟烟气冷凝物(CSC)染毒，每鼠灌胃口服急性毒性剂量的1/2LD50,1/4LD50和1/8LD50,正常对照组灌胃同体积的基础培养液；d、抽血进行培养、固定、染色、计数，36h后取尾静脉血5nL加入含肝素的40jaLNaHC03緩冲液中，加入-80。C预冷的lml曱醇，置-80。C中固定24h以上；取100pL固定好的血样加入O.5ml4。C预冷的NaHC03緩冲液中(0.9%NaCl，5.3mmol/LNaHC03，调pH7.5)，离心，去上清，分别加入10jiLRNA酶(10mg/ml，沸水灭活15min)、0.5mLCD71抗体(0.5mg/mL)、70|uLNaHC03緩冲液，4'C放置l2h后37。C温育45min;加入300pL4'C预冷的PI(碘化丙啶，1.33jag/ml)，混匀，4'C染色过夜；用流式细胞仪检测20000个网织红细胞中的微核细胞数，实验结果用每1000个网织红细胞中的^效核细胞数表示；e、实验结果进行处理和分析，评价巻烟烟气毒性。3、根据权利要求2所述的评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，其特征在于所选小鼠6-7周龄，体重18-22克，为二级NIH小鼠。4、根据权利要求2所述的评价巻烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，其特征在于离心分离时转速3000转/min，时间10min。全文摘要一种评价卷烟烟气毒性的小鼠体内微核分析检测方法，其特征在于采取体内微核试验方式，通过小鼠灌胃染毒、细胞培养、固定、染色后，采用抗体荧光标记法直接测定微核率。具体包括以下步骤a.选择小鼠，b.卷烟烟气凝集物制备，c.小鼠进行卷烟烟气冷凝物(CSC)染毒，d.抽血进行培养、固定、染色、计数，e.实验结果进行处理和分析，评价卷烟烟气毒性。本发明相比现有技术的优点在于方法灵敏性高，结果可靠，开创了一种新型的用于评价卷烟烟气毒性的检测方法。文档编号G01N33/48GK101251536SQ20081004945公开日2008年8月27日申请日期2008年4月1日优先权日2008年4月1日发明者刘惠民,斌彭,朱茂祥,杨陟华,聪聂,谢剑平,谢复炜,乐赵申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院