专利名称：用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法
技术领域：
本发明属于生物技术的植物、农作物检测,特别涉及一种用茎叶表皮细胞质壁分离比 率快速鉴定番茄耐盐植株方法。
背景技术：
随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，土地和淡水资源越来越匮乏，土地盐碱
化成为日益严重的环境问题之一。利用植物的耐盐特性是改良和利用盐碱地以及微咸水资
源的一条重要途径。栽培番茄(丄Kope^/cow escw/e加wn Miller)的一些近缘种如醋栗番茄(丄.
/7/ ^>2e//e/z/o//ww (jusl) Mill)、契斯曼尼番茄c/ze^附a"// Riley)耐盐能力非常强，用
50%~70%的海水灌溉几乎不影响其正常的生长发育过程。通过远缘杂交技术和后代耐盐性
鉴定，这些近缘种的耐盐基因已经成功地转移到了普通番茄中。但在杂交和自交过程中，
各种基因之间不断地进行重组和分离，如何准确地鉴别和筛选耐盐且高产优质的优良基因
型，成为科学家苦苦探索的关键技术。
最早人们用含盐培养基上的种子萌发试验来挑选耐盐种子。大量的试验证明，盐胁迫
通常只是延迟了种子的萌发时间，种子萌发过程中的耐盐能力与植株生长阶段的耐盐能力 相关性不高；许多耐盐植物的种子萌发阶段和幼苗阶段并不耐盐。后来有人提出用种子根 在含盐培养基上的生长速度来鉴别耐盐植株，这种方法在拟南芥上得到成功应用，但在番 茄上实验结果表明，种乎根在盐胁迫条件下的生长速度与成珠期的耐盐能力没有相关性。 目前大家公认的耐盐潜力鉴定方法是溶液培养法，即把相同苗龄的植株放在含盐量不同的 营养液中，根据植株的生长量、生根量、死亡率等判断它们的耐盐潜力。用这种方法鉴定 出来的耐盐性与生产实践中的耐盐表现基本一致。溶液培养法一般需要3-5周，试验材料 生长势的一致性、溶液培养过程中的温度和通气状况是影响实验结果的主要因素，材料容 量有限、试验时间较长是溶液培养法的主要缺点。
在高渗环境中，植物细胞由于液泡失水而使原生质层与细胞壁分离的现象，叫做质壁 分离。质壁分离是植物生活细胞所具有的一种特性。可以用来区别细胞的死活；也可用来 测定细胞液的渗透压，以及原生质的透性、弹性、粘滞性等。造成质壁分离的原因是细 胞壁是全透性的膜，而质膜和液泡膜均是选择透过性的膜，当外界溶液的浓度比细胞液的 浓度高时，细胞液的水分就会向外渗出，液泡的体积缩小，由于细胞壁的伸縮性有限，而原生质的伸縮性较大，所以在细胞壁停止收縮后，原生质继续在收縮，这样原生质层与细 胞壁就逐渐分开，原生质层与细胞壁之间的空隙里就充满了外界浓度较高的溶液。如果把 发生了质壁分离现象的细胞再浸入浓度很低的溶液或清水中，外面的水就进入细胞，液泡 变大，整个原生质层又慢慢恢复到原来的状态，这种现象叫做质壁分离的复原。对番茄而 言，盐胁迫首先是通过渗透势的改变引起细胞内容物的外流，从理论上讲也会出现质壁分 离。在相同的盐胁迫环境中，耐盐基因型的质壁分离情况和不耐盐的基因型应该有明显的 区别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄
耐盐植株方法。只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高。
本发明的技术方案是
一种用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法，其特征在于
1) 以对植物无害的活体染料中性红为指示剂，对番茄植株的茎叶表皮细胞进行染色， 活细胞的液泡被染成樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固， 胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象；
2) 耐盐能力不同的番茄基因型，其茎叶表皮细胞在盐溶液中的存活率有很大的差异； 在高盐溶液中处理一定的时间，茎叶表皮细胞的质壁分离比率，即细胞存活率，能快速准 确地反映基因型的耐盐能力。
所述的用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法选择对植物无害 的中性红染料，染液浓度以0.03%为宜，染色时间不超过10分钟，不少于5分钟；茎叶表 皮厚度应均匀一致，否则影响染色效果。
所述的用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法选择化学纯的 NaCl，溶液浓度一般以1.5M为宜，处理时间15-20分钟；降低盐溶液浓度需要延长处理时 间，增加盐溶液浓度需要縮短处理时间；番茄茎叶表皮细胞对盐胁迫的灵敏度在基因型间 有明显差异。
本发明效果是
实验结果充分地证实了这个理论推导。利用质壁分离鉴定技术，只需20-30分钟就能 准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高，具有非常广阔的应用前景。对其 他植物耐盐潜力的快速鉴定具有重要参考价值。本发明具有以下优点和特点l.该技术体系以植物细胞的质壁分离现象和中性红染料的着色原理为依据，只需少量的番茄叶片或 茎杆表皮细胞，就能迅速地鉴定出植株的耐盐能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等 优点。2.根据水培试验和质壁分离试验的相关性，确定各种植物的耐盐临界值，然后根据 质壁分离试验淘汰大量不耐盐的基因型，可以有效地压縮田间试验的规模，节约时间和人 力，大幅度提高优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
图1. 1番茄茎表皮细胞经0. 5M NaCl处理后的质壁分离情况 图1. 2番茄茎表皮细胞经1. 0M NaCl处理后的质壁分离情况 图2.1 1. 5M NaCl溶液处理普通品种叶表皮细胞的质壁分离情况 图2. 2 1. 5M NaCl溶液处理耐盐品种叶表皮细胞的质壁分离情况 图3番茄不同品种在盐溶液中的生长情况
质壁分离试验的结果表明，在1.5M NaCl溶液中放置15-20分钟，耐盐品种Edkawi 的茎叶表皮细胞出现明显的质壁分离现象，盐胁迫引起的细胞死亡率在20%以内；普通番 茄品种的茎叶表皮细胞大部分丧失活力，细胞死亡率在80%以上。说明番茄植株的耐盐能 力和茎叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，用1. 5M NaCl溶液进行质壁分离试验，能快速、 准确地筛选出耐100mM以上NaCl溶液的番茄植株。
具体实施例方式
针对传统技术鉴定植物耐盐潜力所需时间长、所需材料多、工作效率低的问题，发 明人进行了大量的研究工作，最终建立了利用细胞质壁分离技术快速鉴定番茄耐盐潜力的 新方法。以发生质壁分离的细胞在被观察细胞中所占的比率为依据，可以快速、准确地确 定不同基因型的耐盐潜力，从而筛选耐盐潜力高的优良基因型，在短时间内淘汰大量的无 用材料，进而选育出耐盐的优良番茄新品种。
本发明旨在提供一种科学高效的耐盐潜力快速鉴定方法，通过该方法淘汰大量不耐 盐的基因型，实现耐盐基因和高产优质基因的结合，加速耐盐番茄新品种的选育。
本发明之目的通过如下的技术方案来实现-
番茄细胞质染色技术的研究
中性红是对植物无害的常用活体染料之一，它是一种弱碱性PH指示剂，变色范围 在p朋.4 8.0之间(由红变黄)。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红 并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原 生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。
把经过中性红染色的番茄茎叶表皮细胞放在盐溶液中，经过一定的时间后，原生质 出现明显的质壁分离现象。随着盐浓度的提高或盐溶液浸泡时间的延长，液泡浓缩成圆球 状。当盐浓度过高或在盐溶液中浸泡时间过长时，细胞膜破损，细胞内外成一体，染色浅， 观察不到红色球团。在盖玻片的一端滴加清水，另一端用吸水纸吸收水分，清水能使浓縮 成团状的细胞质重新彭大。质壁分离复原后的细胞呈粉红色，不能复原的细胞能观察到玻 璃胶状的细胞质。
番茄茎叶表皮细胞质壁分离临界盐浓度的确定
把从活体上剥离下来的叶和茎表皮细胞放在0.03%中性红溶液中，染色10分钟，细 胞质完全着色，然后把染色后的表皮细胞分别放在0.5M、 l.OM、 1.5M和2.0M的NaCl 溶液中处理15分钟，在10X10倍的光学显微镜下观察，发现都有不同程度的质壁分离。 0.5M NaCl溶液处理的表皮细胞质壁分离程度较轻，.很容易用蒸馏水复原；盐浓度越高， 相同处理时间内的细胞质壁分离越严重(图1.1、图1.2)。 1.5M和2.0MNaCl溶液处理的 表皮细胞出现大量的死亡，死亡细胞因膜丧失选择透性而无法被中性红染色，耐盐品种的 表皮细胞死亡率明显较低(图2.1、图2.2)。 1.5MNaCl处理时，细胞死亡率对时间长短的 灵敏性较低，可重复性较好。因此，我们把1.5M作为NaCl胁迫的临界盐浓度。
质壁分离比率与耐盐潜力的相关性研究
为了鉴定不同番茄品种的耐盐能力，用公认的耐盐品种Edkawi (LA2711)做对照， 和一系列普通番茄品种一起进行水培试验。水溶液由自来水加不同重量的NaCl配制而成。 在lOOmM的NaCl溶液中培养3周后，商业品种津杂202 (试验材料顺序号为6030)和其 他普通番茄品种全部表现出叶片枯萎、根系停止生长的症状(图3左)，而耐盐品种Edkawi (试验材料顺序号9-11)叶色嫩绿、根系生长正常(图3右)，与在自来水中的生长状况 相似。
质壁分离试验的结果表明，在1.5M NaCl溶液中放置15-20分钟，耐盐品种Edkawi 的茎叶表皮细胞出现明显的质壁分离现象，盐胁迫引起的细胞死亡率在20%以内；普通番 茄品种的茎叶表皮细胞大部分丧失活力，细胞死亡率在80%以上。说明番茄植株的耐盐能 力和茎叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，用1. 5M NaCl溶液进行质壁分离试验，能快速、 准确地筛选出耐100mM以上NaCl溶液的番茄植株。
施例l从美国加州大学番茄遗传资源研究中心(TGRC)引进耐盐番茄Edkawi(LA2711)，和我们选育的番茄新品种津杂202进行杂交试验，获得耐盐基因和其他优良基因重组的杂 交后代种子1000粒。把这些种子和亲本Edkawi、津杂202的种子同时放在育苗盘上发芽， 等长到4叶1心时，用第3片叶进行质壁分离试验。首先从Edkawi和津杂202的叶片和 茎杆上轻轻剥下表皮细胞，放在0. 03%的中性红溶液中处理10分钟，然后转移到1. 5MNaCl 溶液中处理15分钟。在10X10的光学显微镜下，观察到Edkawi的表皮细胞中，大部分 呈现出粉红色的团状细胞质，而津杂202的表皮细胞中，只有极少数细胞含有粉红色的团 状细胞质。说明1.5M的NaCl溶液能够把耐盐基因型鉴别出来。
IOOO粒杂交种子发芽后，共获得860株番茄植株，在4叶1心阶段，用第3片叶子 和叶柄上的表皮细胞，进行质壁分离试验。各单株的茎叶表皮细胞在中性红中染色10分 钟后，转移到1.5M NaCl溶液中处理15分钟，然后进行显微观察计数，凡是表皮细胞的 质壁分离率低于50%的基因型， 一律淘汰。质壁分离率高于80%的基因型，直接移栽到试 验田中进行农艺性状的鉴定。质壁分离率介于50%和80%之间的基因型，放在100mM的盐 溶液继续进行耐盐性鉴定。从860个单株中总共鉴别出36株耐盐基因型，使得田间试验 的规模大幅度縮小，工作效率大幅度提高。
权利要求
1、一种用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法，其特征在于1)以对植物无害的活体染料中性红为指示剂，对番茄植株的茎叶表皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象；2)耐盐能力不同的番茄基因型，其茎叶表皮细胞在盐溶液中的存活率有很大的差异；在高盐溶液中处理一定的时间，茎叶表皮细胞的质壁分离比率，即细胞存活率，能快速准确地反映基因型的耐盐能力。
2、 根据权利要求1所述的用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法，其 特征在于选择对植物无害的中性红染料，染液浓度以0.03%为宜，染色时间不超过10 分钟，不少于5分钟；茎叶表皮厚度应均匀一致，否则影响染色效果。
3、 根据权利要求1所述的用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法，其 特征在于选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以1.5M为宜，处理时间15-20分钟；降低盐 溶液浓度需要延长处理时间，增加盐溶液浓度需要縮短处理时间；番茄茎叶表皮细胞对盐 胁迫的灵敏度在基因型间有明显差异。
全文摘要
一种用茎叶表皮细胞质壁分离比率快速鉴定番茄耐盐植株方法，以活体染料中性红为指示剂，对番茄植株的茎叶表皮细胞进行染色，活细胞、死细胞的着色不同，从而判断耐盐能力不同的番茄基因型，在高盐溶液中处理一定的时间，茎叶表皮细胞的质壁分离比率，即细胞存活率，能快速准确地反映基因型的耐盐能力。利用质壁分离鉴定技术，只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高，具有非常广阔的应用前景。
文档编号G01N21/88GK101576507SQ200810052999
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月5日 优先权日2008年5月5日
发明者刘仲齐, 刘侠妤, 郏艳红 申请人:天津市农业生物技术研究中心