专利名称：用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法
技术领域：
本发明属于生物技术的植物检测，是一种叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法。
背景技术：
随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，土地和淡水资源越来越匮乏，土地盐碱化成为日益严重的环境问题之一。开发利用广大的中重度盐碱地，既可以阻止土壤盐渍化的进一步加剧，又能扩大农田的种植面积，解决人口增多与耕地减少的矛盾。杨树在缺林少木的盐碱、干旱、贫瘠和荒漠地区栽植，可迅速恢复植被，减少风沙危害、降低地下水位、保护农田、减少地表蒸发，增加森林覆盖率，也为纸浆用材林建设和工业商品林建设提供足够的原材料。杨树是杨柳科杨属植物落叶乔木的通称。全属有100多种，它可以分为大叶杨、白杨、青杨、黑杨、胡杨等5类。杨树是地球上分布很广的一种树种，欧、亚、北美洲都有它的足迹，中国有50多种。杨树又是用材林、防护林和四旁绿化的主要树种。杨树是通过分子杂交技术和耐盐突变体筛选，获得了不同耐盐性的杨树新品种。但各种基因之间不断地进行重组和分离，如何准确地鉴别和筛选耐盐的优良基因型，成为科学家苦苦探索的关键技术。 杨树的评价主要是在大田条件下对生物学特征、形态特征、抗性、适应性等指标进
行评价，现在不但注重杨树资源的生产力、适应能力，而且更加关注资源的分子遗传多样
性、木材品质和抗性等遗传能力。杨树的耐盐碱筛选鉴定主要是比较其存活率、相对生长
量、鲜干重比和脯氨酸含量等等的生物学鉴定、分子鉴定和直接盐碱地筛选鉴定。但是杨树
生长期长，评价生长形状、物候性状、生长期等需要的时间较长，费时费力，分子鉴定成本较
高，耗费人力物力，选择一个优良基因型需要较长时间，而且受环境因素的影响。 在高渗环境中，植物细胞由于液泡失水而使原生质层与细胞壁分离的现象，叫做
质壁分离。质壁分离是植物生活细胞所具有的一种特性。可以用来区别细胞的死活；也可
用来测定细胞液的渗透压，以及原生质的透性、弹性、粘滞性等。造成质壁分离的原因是细
胞壁是全透性的膜，而质膜和液泡膜均是选择透过性的膜，当外界溶液的浓度比细胞液的
浓度高时，细胞液的水分就会向外渗出，液泡的体积縮小，由于细胞壁的伸縮性有限，而原
生质的伸縮性较大，所以在细胞壁停止收縮后，原生质继续在收縮，这样原生质层与细胞壁
就逐渐分开，原生质层与细胞壁之间的空隙里就充满了外界浓度较高的溶液。如果把发生
了质壁分离现象的细胞再浸入浓度很低的溶液或清水中，外面的水就进入细胞，液泡变大，
整个原生质层又慢慢恢复到原来的状态，这种现象叫做质壁分离的复原。对杨树而言，盐胁
迫首先是通过渗透势的改变引起细胞内容物的外流，从理论上讲也会出现质壁分离。在相
同的盐胁迫环境中，耐盐基因型的质壁分离情况和不耐盐的基因型应该有明显的区别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法。只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高。
本发明的技术方案是 —种用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法，其特征在于
1)耐盐能力不同的杨树基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大的差 异；在高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映基因型的耐盐 能力；细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高； 2)以对植物无毒的活体染料中性红为指示剂，在微碱性环境中对杨树植株的叶表 皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于 原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。
选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以4M为宜，处理时间10_15分钟；杨树叶表皮 细胞对盐胁迫的灵敏度在基因型间有明显差异 以对细胞无害的0. 03%活体染料中性红为指示剂，对在盐溶液中处理一定时间杨 树的叶表皮细胞染色8-10分钟，活细胞呈樱桃红色，统计细胞死亡率，从而判断耐盐能力 不同的杨树基因型。 染色时间10分钟；叶表皮厚度应均匀一致。
本发明效果是 利用叶表皮细胞死亡率鉴定技术，只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜 力，省工省时，工作效率极高，具有非常广阔的应用前景。对其他植物耐盐潜力的快速鉴定 具有重要参考价值。本发明具有以下优点和特点1.该技术体系以植物细胞的质壁分离现 象和中性红染料的着色原理为依据，只需少量的杨树叶片表皮细胞，就能迅速地鉴定出植 株的耐盐能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。2.根据叶表皮细胞死亡率试验淘 汰大量不耐盐的基因型，可以有效地压縮田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高优 良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
图1. 1107杨叶表皮细胞经2. 0M NaCL处理后叶表皮细胞染色 图1. 2中天杨叶表皮细胞经2. 0M NaCL处理后叶表皮细胞染色 图2. 1107杨叶表皮细胞经4. 0M NaCL处理后叶表皮细胞染色 图2. 2中天杨叶表皮细胞经4. 0M NaCL处理后叶表皮细胞染色 叶表皮细胞死亡率试验的结果表明，在4M NaCl溶液中放置10-15分钟，耐盐品种
中天杨的叶表皮细胞的死亡率，比普通品种107的叶表皮细胞死亡率低很多。107杨表皮细
胞大部分丧失活力，细胞死亡率在95%以上。说明杨树植株的耐盐能力和叶表皮细胞的耐
盐能力高度相关，用4M NaCl溶液进行处理，通过统计叶表皮细胞死亡率，能快速、准确地筛
选出耐高于0. 6% NaCl的杨树植株。
具体实施例方式
针对传统技术鉴定植物耐盐潜力所需时间长、所需材料多、工作效率低的问题，发 明人进行了大量的研究工作，最终建立了利用叶表皮细胞死亡率技术快速鉴定杨树耐盐潜 力的新方法。以叶表皮死亡的细胞在被观察细胞中所占的比率为依据，可以快速、准确地确定不同基因型的耐盐潜力，从而筛选耐盐潜力高的优良基因型，在短时间内淘汰大量的无用材料，进而选育出耐盐的优良杨树新品种。 本发明旨在提供一种科学高效的耐盐快速鉴定方法，通过该方法淘汰大量不耐盐的基因型，实现耐盐基因和高产优质基因的结合，加速耐盐杨树新品种的选育。
本发明的目的通过如下的技术方案来实现
杨树叶片表皮细胞染色技术的研究 中性红是对植物无害的常用活体染料之一，用其染色不会影响细胞的生命活动以直引起细胞死亡，它是一种弱碱性PH指示剂，变色范围在p朋.4 8. 0之间(由红变黄)。它在酸性及中性范围内解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上时，它不解离而以分子态溶解于水，呈黄色的溶液。当介质呈微碱性时，中性红分子的解离作用很弱，主要以分子状态存在，不易被细胞壁吸附，但较易透过质膜和液泡膜进入液泡。由于液泡内溶液呈酸性，因此中性红在液泡中发生解离，将液泡染成红色，此时细胞质和细胞壁不显色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。 把杨树叶表皮放入0. 03%中性红染色液8-10分钟，细胞染成樱桃红色全为活细胞，死细胞能观察到玻璃胶状的细胞质；杨树叶表皮经过一定的盐溶液处理后放在中性红染色8-10分钟，部分细胞成分红色，为活细胞，其余为死细胞。随着盐浓度的提高或盐溶液浸泡时间的延长，不同的基因型杨树表皮细胞质壁分离程度不同，质壁分离引起的死亡率也不同。当盐浓度过高或在盐溶液中浸泡时间过长时，细胞膜破损，细胞内外成一体，染色浅，观察不到红色球团。 杨树叶表皮细胞质壁分离临界盐浓度的确定 把从叶片上剥离下来的叶表皮放在0. 5M、1. 0M、2. 0M和4. OM的NaCl溶液中处理10-15分钟，O. 03%中性红溶液中染色IO分钟，然后把染色后的表皮放在在15X10倍的光学显微镜下观察。0. 5M NaCl溶液处理的表皮细胞质壁分离程度较轻；盐浓度越高，相同处理时间内的细胞质壁分离程度越严重。2. OM和4. OM NaCl溶液处理的表皮细胞出现大量的死亡，死亡细胞因膜丧失选择透性而无法被中性红染色，耐盐品种的表皮细胞死亡率明显较低(图1，2) 。 4M NaCl处理时，107杨比中天杨细胞死亡率明显增加，而且对时间长短的灵敏性较低，可重复性较好。因此，我们把4M作为NaCl胁迫的临界盐浓度。
叶表皮细胞死亡率与耐盐性的相关性研究 叶表皮细胞死亡率试验的结果表明，在4. OM NaCl溶液中放置10-15分钟，耐盐品种中天杨的叶表皮细胞出现明显的质壁分离现象，盐胁迫引起的细胞死亡率在75%以内；杨树107的叶表皮细胞大部分丧失活力，细胞死亡率在95%以上。说明杨树植株的耐盐能力和叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，用4. 0M NaCl溶液进行叶表皮细胞死亡率试验，能快速、准确地筛选出耐0. 6%以上NaCl溶液的杨树植株。 施例1从中科院弓l进的中天杨PoulusXxiaozhuanica 'zhongtian，禾口 107号杨"populus Xeuranericana cL ， 74/76"，。 中天杨是由中国科学院、山东农业大学、山东金水木抗逆植物研究院在重大科技攻关项目支持下，采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱杨树新品种。目前"中天杨"已获得国家专利和植物新品种保护权，国家林业局也将其列为盐碱干旱地区优良品种和重点推广新品种。 欧美杨107起源于意大利，是卡萨歹"蒙费拉托杨树栽培研究所SekaWain博士于 1973年进行人工控制杂交选育出来的。107号是中国林科院承担的国家〃 七五〃 科技成 果〃 国外杨树引种及区域化试验〃 中重点推出的新品种，又名〃 美丽天使〃 杨。该项目曾 获得1991年能源部科技进步三等奖，1993年林业部科技进步二等奖，1996年国家科技进步 三等奖殊荣。经近十年的苗期、无性系对比林测试和区域化试验，欧美杨107号表现良好， 适合我国黄河流域、淮河流域及辽河以南流域广泛栽植，成为我国北方包括西北地区防护 林带、用材林的主要造林树种之一。 取中天杨和107杨相同大小枝条，在不同海盐条件下水培，通过生长表现和根系 发育状况进行了对比试验研究，中天杨能在0. 6%海盐条件下，107杨在0. 4%条件下能正 常生长。 首先从中天杨和107杨的叶片上轻轻剥下表皮细胞，放在4. OMNaCl溶液中处理10 分钟，然后转移到0. 03%的中性红溶液中处理10分钟。在15X 10倍的光学显微镜下，观察 到中天杨的表皮细胞中，一部分呈现出粉红色的活细胞，而107的表皮细胞中，只有极少数 个别粉红色活细胞。说明4. OM的NaCl溶液能够把耐盐基因型鉴别出来。
权利要求
一种用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法，其特征在于1)耐盐能力不同的杨树基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大的差异；在高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映基因型的耐盐能力；细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高；2)以对植物无毒的活体染料中性红为指示剂，在微碱性环境中对杨树植株的叶表皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。
2. 根据权利要求1所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定杨树耐盐植株方法，其特征在于选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以4M为宜，处理时间10-15分钟；杨树叶表皮细胞对盐胁迫的灵敏度在基因型间有明显差异；以对细胞无害的0. 03%活体染料中性红为指示剂，对在盐溶液中处理一定时间杨树的叶表皮细胞染色8-10分钟，活细胞呈樱桃红色，统计细胞死亡率，从而判断耐盐能力不同的杨树基因型。
3. 根据权利要求2所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定杨树耐盐植株方法，其特征在于染色时间10分钟；叶表皮厚度应均匀一致。
全文摘要
一种用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法。杨树的叶表皮细胞在高盐环境中，发生质壁分离，不同耐盐能力的细胞发生质壁分离的程度不同，质壁分离程度大的不能恢复，即死亡；以染料中性红为指示剂，对杨树的叶表皮细胞进行染色，活细胞、死细胞的着色不同，从而判断耐盐能力不同的杨树基因型。在高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映基因型的耐盐能力。利用叶表皮细胞的死亡率鉴定技术，只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高，具有非常广阔的应用前景。
文档编号G01N21/25GK101726576SQ20081015247
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者刘仲齐, 周祥明, 宋建, 张越, 王珠, 聂莉莉, 薛俊, 郏艳红, 郝志愚, 金凤媚 申请人:天津市农业生物技术研究中心