检测用于诊断和表征障碍的自身抗体的方法

专利名称：：检测用于诊断和表征障碍的自身抗体的方法
技术领域：
：本申请公开的主题涉及通过检测自身抗体诊断和表征受试者中的障碍。具体而言，本申请公开的主题涉及利用抗原(在一些实施方案中包括从细胞产生的外来体分离的抗原)来检测受试者中的自身抗体，用于诊断或表征所述受试者中的癌症和/或不孕症(infertility)和/或其他障碍。
背景技术：
：许多疾病如果在早期阶段被诊断出，则它们可以被更为有效地治疗和/或预防。对于癌症而言，这一点尤其的正确。例如，卯％的1期卵巢癌病例可治愈，而对于晚期疾病(ffl期和IV期)患者而言，存活5年的几率低于21%。因此，显著提高癌症存活率的希望在于早期诊断。类似地，如果有更加敏感的早期诊断试验，其他障碍也有可能被更早地诊断并且/或者治疗的预后被更好地确定。作为另一个具体的实例，比起被报道的难以产生或维持足月的活妊娠，不孕障碍更以难以预先诊断和确定而众所周知。更加敏感和特异的诊断测定能够提供对不孕障碍的更好诊断和对不孕治疗的更好预后。现行对多种障碍(包括例如癌症)的诊断测定是以抗原为基础，并依赖于对与所述障碍相关的循环系统蛋白质的检测。这些测定依赖于由细胞(例如肿瘤细胞)主动分泌或流出或者因细胞死亡(坏死或凋亡)而产生的特定蛋白质的表达、合成及释放。这些抗原蛋白质必须"逃离，，疾病的原始位点，使个体免疫组分的抗原加工容量饱和，进入循环系统并达到足以由以酶或放射性标记为基础的免疫测定进行检测的稳态浓度。这些事件通常在疾病最初确立(例如致瘤性转化事件和肿瘤灶发生)后才出现。因此，现行的基于抗原的测定无法真正地检测目标障碍的早期阶段。为了显著改善对目标障碍的诊断测定，尚未获得满足的需求是需要一种在障碍确立早期对于疾病标记物的存在更加敏感的检测该障碍的新方法。
发明内容
发明内容部分列出了本申请公开的主题的数个实施方案，并且在许多情况中列出了这些实施方案的调整方案及变化方案。该
发明内容部分只是数目众多的不同实施方案的示例。提及一个给定实施方案的一个或多个代表性特征时同样也是示例。这样的实施方案一般可以以具有或不具有所提及的一种或多种特征而存在；同样，这些特征可适用于本申请公开的主题的其他实施方案，而不管其是否在该
发明内容部分中列出。为了避免过度重复，该
发明内容部分不再列出或显示这些特征的所有可能的组合。在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种用于检测受试者中的自身抗体水平并且/或者对该水平定量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供一个来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的生物样品，并将一种抗原与所述样品相接触。所述抗原可包括一种分离自一种外来体的自身抗体免疫反应肽。所述方法进一步包括检测样品中对所述抗原产生免疫反应的所述自身抗体的水平并且/或者对该水平定量。在一些实施方案中，所述自身抗体与一种癌症或不孕障碍相关。在一些实施方案中，在本申请公开的主题进一步提供了一种用于诊断与受试者中自身抗体产生相关的障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供一个来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的生物样品，并将一种抗原与所述样品相接触。所述抗原可包括一种分离自一种外来体的自身抗体免疫反应肽。所述方法进一步包括检测所述样品中对所述抗原产生免疫反应的自身抗体，并将自身抗体对所述抗原的免疫反应性水平与一个参考水平比较，以诊断所述受试者中的所述障碍。在一些实施方案中，在本申请公开的主题还进一步提供了一种用于表征受试者中的一种与自身抗体产生相关的障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供一个来自受试者的包含自身抗体的生物样品，并将一种抗原与所述样品相接触。所述抗原可包括一种分离自一种外来体的自身抗体免疫反应肽。所述方法进一步包括检测所述样品中与所述水"^定量，从而丄征所述受试者中的所述障碍。'、^在用于诊断或表征障碍的方法的一些实施方案中，所述障碍为一种癌症或一种不孕障碍。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述障碍为一种上皮癌或一种腺癌。另外，在一些实施方案中，所述抗原包括一种选自以下的癌抗原肽p53、p63、p73、mdm-2、亲组织蛋白酶-D(procathepsin-D)、B23、C23、PLAP、cerB/HER2、NY-ESO-l、SCP1、SSX画1、SSX國2、SSX-4、HSPIO、HSP27、HSP60、HSP90、GRP78、HoxA7、HoxB7、EpCAM、c國ras、间皮素(mesothelin)、生存素(survivin)、粘蛋白(mucin)、EGF激酶、c-myc、核磷蛋白(nucleophosmin)和TAG72。在所述方法的一些实施方案中，所述障碍为一种选自以下的不孕障碍卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症、先兆子痫、早产、子宫内发育受限和反复妊娠丢失。在所述方法的一些实施方案中，所述生物样品包括乳汁、血液、血清、血浆、腹水、嚢内液、胸膜液、泪液、尿液、唾液、组织或它们的结合物。另外，在一些实施方案中，所述受试者为一种哺乳动物。在本申请公开的方法的一些实施方案中，所述外来体分离自一种细胞，所述细胞在一些实施方案中可为一种培养的细胞。在一些实施方案中，所述细胞为一种癌细胞，例如卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或绒毛膜癌细胞。在一些具体的实施方案中，所述细胞为UL-1细胞、UL-2细胞、UL-3细胞或UL-6细胞。在一些具体的实施方案中，所述细胞为胎盘细胞。在本申请公开的方法的一些实施方案中，所述检测包括一种选自以下的技术ELISA、RIA、多重免疫测定、免疫沉淀法和蛋白质印迹法。在一些实施方案中，本申请公开的主题还进一步提供了一种用于检测一个样品中的自身抗体的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种自身抗体免疫反应肽抗原及一个用于容纳所述抗原的容器。在一些实施方案中，所述抗原可分离自一种外来体。在一些实施方案中，所述抗原附着于一种支持物上。在一些实施方案中，所述支持物为微量滴定板、膜(硝酸纤维素、PVDF或类似材料)、聚苯乙烯珠子、试管或浸渍片(dipstick)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种结合一种自身抗体的抗体制品。进一步，在一些实施方案中，所述抗体制品包含一种可检测的标记。更进一步，在一些实施方案中，所述可检测标记包括放射性标记、酶、生物素、染料、荧光标签标记、半抗原或发光标记。因此，本申请公开的主题的一个目标为提供检测用于诊断和表征障碍的自身抗体的方法。通过本申请公开的主题完全地或部分地实现了该目标。本领域普通技术人员在研读以下的对本申请公开的主题的说明、附图和非限制性的实施例后，上文已陈述的本申请公开的主题的目标(可通过本申请公开的主题完全地或部分地实现)、其他目标和优点对于他们来说将是显而易见的。图l的图显示了，与正常不携带肿瘤的对照对比，癌症患者中肿瘤反应性免疫球蛋白与疾病阶段的相关情况。图2A和2B的照片显示了存在于代表性卵巢癌患者(2A=II期，2B-IV期)的血清中的免疫球蛋白与源自正常卵巢上皮(NO)和3个卵巢肿瘤细胞系(UL1、UL3和UL6)的细胞抗原的免疫反应性。框指示目的区域。图3A-3D的系列照片显示了在对顺铂(cisplatin)应答的患者中，识别模式差异的2-维电泳分析结果。图3A-3D显示了部分的2D印迹，使用来自UL-6的抗原作为靶标和来自mc期卵巢嚢腺癌的患者的血清。患者A和B(分别为图3A和3B)对顺铂应答，而患者C和D(分别为3C和3D)无应答。图4A和4B的柱状图显示了来自2名卵巢癌患者的蛋白质阵列谱。通过RP-HPLC分离来自UL-1卵巢肺瘤细胞系的免疫沉淀的细胞蛋白质，并将蛋白质结合于MAGNAGRAPH膜。通过将所述孔与来自卵巢癌患者的血清孵育来鉴定免疫反应性蛋白质，以光密度计测定的像素表示。图5显示了源自患者的肿瘤反应性自身抗体的免疫反应性模式。图6的图显示了来自正常女性自愿者(对照)、患有良性卵巢疾病的女性和患有侵袭性卵巢癌的女性的血清与一个蛋白质阵列中的抗原(在表l中列出)呈现自身抗体反应性的百分数。图7的系列照片所示的原始蛋白质微阵列示出患有早期和晚期卵巢癌的女性中的反应性IgG。图8A的系列照片显示了宫颈癌患者抗血清与细胞性抗原的反应性。图8B的图显示了源自宫颈癌细胞系的抗原与患者血清的反应性。图9的系列照片和图显示了视黄酸对从宫颈癌细胞释放的可溶性抗原的反应性的作用。图10的系列照片和图显示了视黄酸对从宫颈癌细胞释放的细胞相关抗原的反应性的作用。图ll的系列图显示了来自患有不同期的癌症、良性疾病的不同患者或正常对照的血清对不同的自身抗体免疫反应肽抗原的免疫反应性。图12的系列图显示了来自对照受试者和患有不同类型癌症的患者的血清对不同自身抗体免疫反应肽抗原的免疫反应性。图13的系列照片显示了重组抗原和源自天然外来体的抗原中对抗来自不同癌症患者的血清的抗原表位的差异。图14的图所示的ELisA结果为被诊断为i期、n期或ni期子宫内膜异位症的患者和正常对照的血清对源自子宫内膜亚细胞区室的细胞抗原的免疫反应性。抗原分离自子宫内膜细胞的膜、核和胞质溶胶部分，并3皮偶联至微量滴定板的孔中。图15的系列照片显示了来自子宫内膜和卵巢且被自体反应性体液应答识别的细胞抗原的蛋白质免疫印迹。图16A-i6c的系列照片显示了对患有n期和m期子宫内膜异位症的患者血清进行二维电泳所分离的子宫内膜膜抗原的部分代表性免疫识别。蛋白质分离自Hec-1A(子宫内膜肿瘤细胞系)。将溶解的膜蛋白质(100mg)加载至PH3-10等电聚焦带上(strip),在电泳后，将该等点聚焦带加至10-20%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上部。经过SDS-PAGE后，将蛋白质转移至硝酸纤维素并进行免疫印迹。图17的系列照片显示了获自被诊断为不孕障碍的女性的血清对源自子宫内膜的细胞抗原的血清学反应模式。图18的系列照片所示的蛋白质免疫印迹表明了在正常足月分娩和反复妊娠丢失的妊娠过程中产生的自身抗体的存在。具体实施例方式在如下附随的说明中将详细地给出本申请公开的主题的一个或多个实施方案。通过该详细说明、实施例和权利要求书，本申请公开的主题的其他特征、目标和优点将是显而易见的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用的方式全文纳入本文。在出现冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。按照长期形成的专利法惯例，术语"a(—种)"、"an(—个)"和"the(该)"在用于本申请(包括权利要求书)中时是指"一个或多个"。除非另外指出，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下都被术语"约"修饰。因此，除非相反指出，否则在本说明书和附随的权利要求书中列出的数值参数是可依赖于本申请公开的主题意欲获得的所需性质而变化的近似值。在提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分率的值或量的时候，本文使用的术语"约"的意思是涵盖偏离所述指定量如下区间以内的变化范围，即在一些实施方案中为±20%,在一些实施方案中为±10%，在一些实施方案中为±5%,在一些实施方案中为±1%，在一些实施方案中为±0.5%,以及在一些实施方案中为±0.1%，只要这样的变化适合于实施本申请7>开的方法。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有等同于本申请公开的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。任何类似于或等价于本文所述的方法、设备和材料均可用于实施或测试本申请公开的主题，尽管在此只描述代表性的方法、设备和材料。现有技术中已确定，某些障碍的特征在于在患病的受试者中产生自身抗体。也就是说，该受试者的免疫系统被刺激产生抗自身抗原(与外源抗原例如侵入微生物所特有的抗原相对)的抗体。与自身抗体产生免疫反应的该抗原在一些情形下可具有由于一级序列或翻译后加工中的变化造成的改变的表位(例如这可发生在癌症中)，但也可以是与正常抗原在免疫学上相同。在这两种情形下，均已发现自身抗体的产生可与障碍的存在相关，乃至可提供用于表征所述障碍的信息。本申请公开的主题提供了用于检测受试者中自身抗体水平并且/或者对该水平定量的新方法，所述自身抗体水平可与所述受试者中一种障碍的存在力或对所述障碍的表征相关。例如，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了用于诊断和/或表征受试者中与自身抗体产生相关的一种癌症或不孕障碍的方法。L用于检测自身抗体水平并对该水平定量的方法在一些实施方案中，本申请公开的主题提供了用于检测并/或定量受试者中的自身抗体水平并且/或者对该水平定量的方法。在一些实施方案中，这些方法可被用于诊断和/或表征受试者中与自身抗体产生相关的障碍。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的一个生物样品，然后将一种抗原与所述样品接触。所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽。所述方法接着包括检测样品中与所述抗原发生免疫反应的所述自身抗体的水平并对该水平定量。在一些实施方案中，所述生物样品可包括例如乳汁、血液、血清、血浆、腹水、嚢内液、胸膜液、唾液、泪液、尿液、组织或它们的结合物。此外，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种用于诊断受试者中的一种与自身抗体产生相关的障碍的方法，该方法是基于检测所述受试者中的自身抗体。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的一个生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；检测所述样品中对所述抗原产生免疫反应的自身抗体；并将自身抗体对所述抗原的免疫反应性水平与一个参考水平相比较，以诊断所述受试者中的所述障碍。本文使用的术语"作诊断"和"诊断"是指这样的方法，即本领域技术人员通过这些方法可估计乃至确定受试者是否患有一种给定的障碍或病症。本领域技术人员经常以一种或多种诊断指示物为基础进行诊断，所述指示物例如一种自身抗体，其量(包括存在或不存在)可指示所述病症的存在、严重性或不存在。除了诊断，临床的预后也是一个很受关注和注意的方面。为了设计最有效的治疗，知晓障碍的严重性(例如癌细胞的侵袭力及肿瘤复发的可能性)很重要。自身抗体的测量可被用于将具有良好预后、不需要进一步治疗的受试者与那些更可能受益于更强烈治疗的受试者分开。由此，本文使用的"进行诊断"或"诊断"还涵盖进行预后，基于对诊断性自身抗体的测量，预后可提供对临床结果的预测(进行或未进行医学治疗)、对合适疗法的选择(或疗法是否有效)或者对现行疗法的监测及可能的疗法改变。而且，在本申请公开的主题的一些实施方案中，可以随时间多次进行对所述自身抗体的测定以有利于诊断和/或预后。所述自身抗体水平的时间性变化可用于预测临床结果、监测所述障碍的进展和/或针对所述障碍的适当疗法的效果。在一个这样的示例性实施方案中，可能会有以下预期，即生物样品中自身抗体(以及有可能的一种或多种其他生物标记物，条件是它(们)被监测)的量在有效治疗的过程中会随时间减少。将自身抗体的水平(例如升高的水平)与参考水平或"正常水平"相关联，以诊断和/或表征一种障碍是指，将自身抗体水平(定量的l或存不存在)与无该障碍的受试者中的预期水平(包括但不限于没有检测到自身抗体)相比较。相对于正常水平的变化(例如提高)是指这样的结果，即所述样品与在其他相当条件下的类似无疾病样品相比较时，变化(例如升高)幅度超过测量技术固有的误差。在一些实施方案中，在所述测试受试者中检测到的自身抗体的水平比基线"正常"存在量升高约10%或更多。在一些实施方案中，在所述测试受试者中检测到的自身抗体的水平升高约20%或更多，在一些实施方案中，在所述测试受试者中检测到的自身抗体的水平升高约25%或更多，以及在一些实施方案中，在所述测试受试者中检测到的自身抗体的水平升高约50%或更多，上述这些情形是自身抗体存在量的升高，这种升高可与所述受试者中存在所述障碍相关联。而且，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种用于表征受试者中的一种与自身抗体产生相关的障碍的方法。本文使用的"表征"可指，检测一种障碍的存在或测定一种障碍的严重度，例如确定一种癌症的阶段。在一些实施方案中，所述方法包括提供一个来自受试者的包含自身抗体的生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；检测所述样品中对所述抗原产生免疫反应的自身抗体；并对自身抗体针对所述抗原的免疫反应性水平定量，从而表征所述受试者中的所述障碍。本文使用的术语"免疫反应"和"免疫反应性"在用于抗体结合时是指，抗体的可变区与抗原的特定表位的特异性结合。术语"肽"、"多肽"和"蛋白"在本文中可互换使用，是指20种蛋白氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，而不考虑其大小或功能。虽然"蛋白"经常被用于言及相对较大的多肽，"肽，，经常被用于言及较小的多肽，但是这些术语在本领域中的用法可有重叠及变化。除非另外指出，否则本文使用的术语"肽"是指肽、多肽和蛋白。本文中的术语"蛋白"、"多肽"和"肽"在提及基因产物时可互换使用。因此，示例性的多肽包括基因产物、天然存在的蛋白、前两者的同源物、直系同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)、片段以及其他等价物、变体和类似物。在本文公开的方法的一些实施方案中，检测所述样品中的所述自身抗体可包括，将所述自身抗体与一种抗原结合，然后检测分离自所述生物样品的自身抗体的结合事件或者存在情况。用于检测所述自身抗体的示例性技术包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、免疫沉淀法和免疫印迹法(包括例如蛋白质印迹法和斑点印迹法)。多种有用的免疫检测方法已被记载于科学文献中，例如Nakam腦etal.(见HandbookofExperimentalImmunology(4thEd.)，Weiretal.(eds).Vol.1，Chapter27，BlackwellScientificPubl"Oxford,1987;通过引用的方式将其纳入本文)。最简单直接层面上的免疫测定是指结合测定。示例性免疫测定包括多种类型的ELISA、RIA和多重免疫测定。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，容易理解的是，检测并不限于这些技术，蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析、沉淀素反应等也可以用于本申请公开的主题。关于本申请的方法，免疫结合方法通常包括，获得疑似包含一种抗体的一个样品，并将所述样品在使免疫复合体有效形成的条件下与一种15根据本申请主题的抗原(例如一种自身抗体免疫反应肽)相接触。将所选生物样品在使免疫复合体(一级免疫复合体)形成的有效条件和足够时长下与所述抗原相接触，通常是将所述组合物添加至所述样品中，并将所述混合物孵育这样的一段时间，即在该时间段内所述抗体与存在的抗原足以形成免疫复合体。在这之后，可将所述抗原-抗体混合物洗涤，以去除任何非特异性结合的抗体分子，使得仅那些特异性结合于所述一级免疫复合体中的抗体被检测。通常，对免疫复合体形成的检测可通过应用多种方法实现。这些方法通常基于对一种标签或标记物的检测，例如本领域中标准使用的任何放射性的、荧光的、生物的或酶的标签或标记。有关这些标记的使用的美国专利包括3，817，837;3，850，752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;4,302,534;4,366,241;4，637，988;4,786,594;5，108，896;5，229，302;5,629,164和5,691,154，以上每一篇文献均通过引用的方式纳入本文。当然，如本领域中公知的，通过使用二级结合配体例如第二抗体或生物素/亲和素配体结合方案可实现另外的优点。在一些实施方案中，对所述一级免疫复合体的检测可通过一种这样的二级结合配体实现，即该二级结合配体具有与存在于所述样品中的抗原或抗体的结合亲和性(特异性或非特异性(例如对所述自身抗体Fc区的反应性))。在这些情况下，所述二级结合配体可连接一个可检测的标记。所述二级结合配体自身常为一种抗体，因此所述抗体被称为"二级，，抗体。在使二级免疫复合体形成的有效条件和足够时长下，将所述一级免疫复合体与所述标记的二级结合配体或抗体相接触。然后，通常将所述二级免疫复合体洗涤，以去除任何未结合的标记的二级抗体或配体，然后检测剩下的所述二级免疫复合体的标记。其他方法包括通过两步法检测一级免疫复合体。如上述，对所述抗原或自身抗体有结合亲和性的二级结合配体(例如一种抗体)被用于形成二级免疫复合体。所述二级结合配体包括一种这样的酶，即该酶能够将底物加工成可检测产物，从而随时间放大信号。在洗涤后，将所述二级免疫复合体与底物相接触，使得可进行检测。竟争性免疫检测也可以被用于检测对所述测试抗原特异的自身抗体的存在。在该技术中，一种标记的抗体首先在溶液中与所述抗原一起孵育。所述标记发出的信号被测量。然后将该抗原/抗体复合体与含有或疑似含有目的抗体的样品相接触。如果所述样品含对所述抗原特异的抗体，那么它们将结合所述抗原并竟争性置换所述的标记的抗体。这可检测为所述标记的信号强度的下降。在本申请公开的主题的一些但非全部实施方案中，用于捕获来自所述生物样品的所述自身抗体的抗原分离自外来体。术语"分离的"在用于多肽时是指该多肽基本上脱离它在天然状态所联系的其他细胞部分或外来体部分。外来体是内体源的小泡，在晚期内体多泡体与质膜融合后分泌至细胞外环境中。来自多种组织类型的细胞已经被发现可分泌外来体，例如树突细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞和肥大细胞。不同来源的外来体呈现出多个独立系列的蛋白质和脂质部分。值得注意的是，它们均包含参与抗原呈递和免疫调节的蛋白质，表明外来体在引起免疫反应调节的细胞-细胞通讯中起作用。事实上，来自以源自肿瘤抗原的肽脉冲的树突细胞(DC)的外来体可在使用匹配肺瘤的动物模型中诱发抗肺瘤反应。然而，源自包含癌抗原的癌细胞的外来体已经显示包含免疫抑制性多肽，使得源自肿瘤的未修饰外来体直接用在疫苗中是不适宜的并有可能是不安全的。本申请公开的主题的外来体十分适合于产生可与自身抗体发生免疫反应以从受试者的生物样品捕获出所述自身抗体的抗原，这是因为它们由细胞产生而不是由人工合成，从而可提供"天然的"抗原。也就是说，由这些细胞产生并存在于所述外来体中的抗原可以是这样的全长肽，即它由所述细胞加工(如糖基化等)并折叠成类似于受试者中免疫细胞经历过的抗原。由此，所述外来体抗原可用于这样的测定中，即该测定用于检测可能存在于患有障碍(例如癌症和不孕障碍)的患者中的自身抗体。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种抗原的每一种均可以包含一种癌细胞抗原和/或不孕障碍抗原。用于提供在本申请公开的方法中使用的抗原的外来体可分离自产生外来体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞为一种培养的细胞，即一种在培养基中离体繁殖的细胞。所述培养的细胞可以(但不必须)是被永生化的，以利于连续繁殖。在一些实施方案中，所述细胞为癌细胞，例如最初从肿瘤分离、然后在培养物中繁殖的癌细胞，这在本领域中通常是公知的。在一些实施方案中，所述癌细胞可为一种上皮癌或一种腺癌。例如，在一些实施方案中，所述癌细胞可为卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或绒毛膜癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为原代培养细胞，例如一种从受试者中分离的胎盘细胞。在具体的实施方案中，所述细胞为选自但不限于UL-1细胞、UL-2细胞、UL-3细胞和UL-6细胞的培养细胞系。在本发明人的实验室中，已经从卵巢具有mc期囊腺癌的女性建立了所有这些原代的人卵巢肿瘤细胞系(被命名为UL-1、UL-2、UL-3和UL-6)。UL-2和UL-3来自遗传性卵巢癌，而UL-l和UL-6来自自发癌。UL-1细胞来自一位63岁女性患者，UL-2细胞来自一位34岁女性患者，UL-3细胞来自一位42岁女性患者，且UL-6细胞来自一位72岁女性患者。这些细胞系在棵鼠中是致肺瘤的，在棵鼠中可产生与嚢腺癌一致的肿瘤。这些细胞系的EpCAM、PLAP、FasL、PD-L1和II类MHC都是阳性。在一些实施方案中，可通过以下方式将所述抗原分离用于本文公开的方法中收获培养所述细胞的培养基，并从所述培养基选择性取出所述外来体，例如通过离心。然后，根据需要，可通过常规的蛋白质分离和纯化的方法进一步分离所述抗原，这在本领域中是^^知的。进一步，对于本申请公开的主题的诊断方法，优选的受试者是脊推动物受试者。优选的脊推动物是温血动物；优选的温血脊推动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选人。如本文中使用的，术语"受试者"包括人受试者和动物受试者。因此，根据本申请公开的主题提供了兽医的治疗用途。由此，本申请公开的主题提供了对哺乳动物的治疗，所述哺乳动物例如人以及那些由于濒临灭绝而重要的哺乳动物，例如东北虎(Siberiantiger);具有重要经济学价值的哺乳动物，例如在农场中饲养用于人消费的动物；以t或者在社会关系上对人来说重要的动物，例如作为宠物或在动物园中的动物。这些动物的实例包括但不限于食肉动物例如猫和狗；猪类(swine)，包括猪(pig)、阉猪(hog)和野猪(wildboar);反刍动物及/或有蹄动物例如牛(cattle)、公牛(ox)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；以及马。还提供了对鸟类的治疗，不但包括对禽类特别是家养禽(即家禽，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡(guineafowl)等)的治疗方法，而且包括对那些濒临灭绝和/或在动物园中的鸟种类的治疗方法，这是因为它们对人也有着重要的经济学价值。因此，还提供了对家畜的治疗方法，所述家畜包括但不限于家养的猪、反刍动物、有蹄动物、马(包括竟赛马)、家禽等。iL用于it断癌症的方法本申请公开的主题进一步提供了一种用于诊断和表征受试者的癌症的方法。在美国，癌症是第二大死亡原因。在1999年，据估计有563,100例癌症死亡，并且每年诊断出约1,222,000例新的癌症病例。其中，实体瘤癌症例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌最为常见。癌症的诊断和分类依赖于对通过肉眼获得的临床和组织病理学信息的主观解释，从而基于肿瘤的起源组织将肿瘤分成公认的类别。然而，临床信息可能是不完备的或者有误导的。现行对癌症的诊断测定最常见的是以抗原为基础。这些测定依赖于由肿瘤细胞主动分泌或流出或者因细胞死亡(坏死或凋亡)而产生的特定蛋白质的表达、合成及释放。这些抗原蛋白质必须"逃离"疾病的原始位点、使个体的免疫组分的抗原加工容量饱和、进入循环系统并达到足以由基于酶或放射性标记的免疫测定进行检测的稳态浓度。这些事件通常在致瘤性转化事件和肿瘤灶发生最初确立后才出现。对于更早检测癌症的改善主要集中在提高敏感性和高通量能力；然而，这些诊断测定表现出数个基本的局限。循环系统抗原直至肿瘤确立后才出现；现行的抗原不是特异地针对癌症；以及没有单个抗原在100%的癌症病例中都表达。最近，以对患者血清的蛋白组学模式的分析作为早期的检测方法被研究(Liottaetal.，GynecolOncol88:S25-S28,2003.)。令人遗憾的是，这种基于质谱(MS)的方法具有数个缺陷。除了与基于抗原的测定系统相关的循环系统抗原延迟出现之外，MS蛋白组分析的敏感性居中，且随蛋白质分子量增大效果逐渐降低，它不能识别这些标记物蛋白质，并且必须要使用高端先进的分析仪器，例如SELDI-TOF质谱仪和生物信息学工具。除了癌症相关的蛋白质差异之外，血清蛋白组学模式可能呈现出个体差异，并且这种"MS-诊断指紋法，，的结果依赖于与血清的"训练集，，的比较及随后对所产生的模式的解析。因此，在MS蛋白组学分析可临床应用之前，需要解决可行性、再现性和标准化的问题。对癌症患者的免疫能力的评估已被用于确定肿瘤是否已危害宿主的免疫性，从而识别出具有预后价值的特定免疫参数并为免疫疗法评估提供一个基准(Hellstrometal"见DeVitaVT，HellmanS，andRosenbergSA，eds.Biologictherapyofcancer.NewYork:Lippincott，1991:35-52.)。虽然许多癌症(包括例如卵巢癌)患者中的免疫细胞的功能受到损害——这通过无法根除所述肿瘤确定——，但是研究表明对肿瘤抗原的免疫识别仍完好。肿瘤反应性自身抗体可在肿瘤发生和进展的早期被检测到。研究已表明在癌症患者中存在肿瘤反应性免疫球蛋白，所述患者包括黑色素瘤患者(Merimskyetal.,TumourBiol15:188-202，1994)、肺癌患者(Niklinskaetal"FoliaHistochemCytobiol39:51-56，2001;Brichoryetal"CancerRes61:7908-7912，2001)、乳腺癌患者(Conroyetal"Lancet345:126，1995;Barboucheetal"EuropJClinChemClinBiochem32:511-514，1994)、头颈癌患者(Vlocketal，CancerRes49:1361-1365，1989)和卵巢癌患者(Kuttehetal"JSocGynecolInvest3:216-222，1996;Tayloretal"AmJR印rodImmunol6:179-184,1984;Vogletal"BritJCancer83:1338-1343，2000)。谦导体液应答背后的机制在癌症患者中似乎是多方面的，包括引起氨基酸序列变化的点突变(JungandSchluesener,JExpMed173:273-276，1991;Winteretal"CancerRes52:4168-4174，1992;Lubinetal.，CancerRes53:5872-5876，1993)、扩增或蛋白质稳定性增加引起的过表达(Peoplesetal"ProcNatlAmerSciUSA92:432-436，1995;Labrecqueetal"CancerRes53:3468-3471，1993)、翻译后#"饰的变化(Koteraetal"Humoralimmunityagainstatandemrepeatepitopeofhumanmucinmuc-1inserafrombreast,pancreaticandcoloncancerpatients,C"wcer54<i/>:2S56-6<,7994;AnderssonE.HenderikxP.KrambovitisE.HoogenboomHR.BorrebaeckCA.AtandemrepeatofMUC1coreproteininducesaweakinvitroimmuneresponseinhumanBcells.CViwce尸7iim6>/0§j，47(5,*2^^-56，795^5Chinnietal.，ClinCancerRes3:1557-1564，1997)或加工中的错误。细胞内蛋白质的细胞外出现通常可引起自身抗体的生成。抗异常细胞抗原(例如c-myb、c-myc、p53和p21ras)的自身抗体已经在显著比例的癌症患者中被发现，即便在循环系统中不存在可检测的抗原(Canevarietal.,AnnalsOncol7:227-232,1996;Yamamotoetal"Oncology56:129-133，1999;Abu-Shakraetal"AnnalsRheumDis60:433-440，2001.)。在诊断时检测到对抗这些细胞内蛋白质的抗体似乎与不良预后相关。在以前的分析p53的自体抗体的诱导的研究中，与蛋白质过表达相关的自身免疫反应倾向于针对氨基端和羧基端。相反，抗相关蛋白质p73的自身抗体似乎针对内部的突变热点。在使用化学诱导的或可移植的自发肺瘤的实验动物研究中，可证明循环系统肿瘤反应性IgG先于可触知肿瘤或循环系统肿瘤抗原出现。本发明人及同事以前开发了"自体分型，，，以鉴定肿瘤反应性IgG的存在，并且将癌症患者的抗原识别模式确定为一种诊断工具(TaylorandDoellgast，AnalyticalBiochemistry,98:53-59，1979.)。然而，直至最近，对诱发这种体液应答的特定抗原的分子鉴定仍不清楚。现在，可将最近改进的"自体分型，，用于分析肿瘤抗原。这种被命名为SEREX的改进版本是使用对人肺瘤的重组cDNA表达库的血清学分析鉴定免疫识别的耙标(Old,JExpMed187:1163-1167，1998)。这种技术具有数个局限，包括与细菌或噬菌体组分的高交叉反应性、源自存在于原始肿瘤中的正常组织(包括淋巴样细胞)的cDNA的共表达，以及由于该cDNA在细菌系统中表达，因而不存在出现于肿瘤细胞中的癌症相关的翻译后修饰和加工，这会引起这些"基因工程的"蛋白质靶标的免疫反应性丧失。血清学分析技术已被用于为癌症诊断确定新的靶抗原，但仍有限制其应用的缺陷。现在用于检测自身抗体的抗原靶标是重组野生型蛋白质——例如p53的自身抗体的检测已仅使用野生型p53蛋白质。野生型蛋白质的使用排除了对抗突变热点的自身抗体的检测。对于p53而言，大多数研究表明，自身抗体结合于氨基端或羧基端。重组野生型p53与针对突变位点的自身抗体无反应性可能说明，在卯巢癌中p53自身抗体频率低于p53突变频率。本申请公开的主题提供了一种诊断癌症的新方法，所述方法克服了上文详述的现有技术的局限。使用源自"天然"肿瘤细胞的蛋白质抗原(例如源自癌症细胞的外来体)，癌症患者的肺瘤反应性体液应答在本文公开的蛋白质阵列中的新应用提供了一种创新性的快速方法，来鉴定受试者中与癌症发病和进展相关的变化(例如突变、截短和翻译后修饰)的出现情况。患有恶性疾病的患者可形成自身免疫样现象，这是抗多种自身21抗原的自身抗体生成的结果，所述自身抗原包括癌蛋白、肺瘤抑制基因、增殖相关抗原和癌症/睾丸抗原。具有同样肿瘤类型的患者共有的特定蛋白质中的异常可代表基本的新生物的通路，且这些共有的变化可被用于诊断和表征癌症，包括确定肿瘤的类型和阶段。由此，在一些实施方案中，本申请公开的主题提供了一种诊断受试者的一种癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的一个生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；检测在所述样品中对所述抗原产生免疫反应的自身抗体；并将自身抗体对所述抗原的免疫反应性水平与一个参考水平对比，以诊断所述受试者的所述癌症。而且，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种用于表征受试者中与自身抗体产生相关的癌症的方法。例如，对所述癌症的进一步表征可通过检测来自所述受试者的样品中的自身抗体并且/或者对该自身抗体定量来进行，例如通过基于定量测量存在于所述样品中的特定自身抗体的水平来确定癌症阶段。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含自身抗体的一个生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；检测在所述样品中对所述抗原产生免疫反应的自身抗体；并对自身抗体针对所述抗原产生的免疫反应性水平定量，从而表征所述受试者中的所述癌症。实施例部分将提供另外的用于表征存在于受试者的癌症阶段的示例性实施方案的细节。在用于诊断和/或表征受试者的癌症的方法的一些实施方案中，所述自身抗体免疫反应肽可分离自一种外来体。本文使用的术语"癌症"是指动物中出现的所有类型的癌症、新生物或恶性肺瘤，包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤。癌症的实例有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。"白血病"是指造血器官的广泛进行性恶性疾病，其特征通常在于血液和骨髓中的白细胞及其前体异常的增殖及发育。白血病包括，例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞性白血病、非白血性白血病(aleukemicleukemia)、白细胞不增多性白血病(aleukocythemicleukemia)、嗜威性白血病(basophylicleukemia)、母细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎白血病(embryonalleukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilicleukemia)、格罗斯白血病(Gross，leukemia)、毛细胞性白血病、成血性白血病(hemoblasticleukemia)、成血细胞性白血病(h柳ocytoblasticleukemia)、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴白血病(lymphaticleukemia)、成'淋巴细胞性白血病(lymphoblasticleukemia)、'淋巴细胞性白血病、成'淋巴性白血病(lymphogenousleukemia)、淋巴样白血病(lymphoidleukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞性白血病、巨核细胞性白血病、小成髄细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髄性白血病(myeloblastsleukemia)、髓细胞'性白血病、髓样粒细胞'性白血病(myeloidgranulocyticleukemia)、髓单核细胞性白血病(myelomonocyticleukemia)、Naegeli白血病、浆细胞'性白血病(plasmacellleukemia)、浆细胞'性白血病(plasmacyticleukemia)、前髓细胞'性白血病、李德尔细胞小生白血病(Riedercellleukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。术语"癌"是指由倾向于浸润周围组织并发生转移的上皮细胞组成的恶性新生物。示例性的癌包括，例如腺泡癌(acinarcarcinoma)、腺泡癌(acinouscarcinoma)、腺嚢性癌(adenocysticcarcinoma)、腺样嚢性癌(adenoidcysticcarcinoma)、腺癌(carcinomaadenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底细胞样癌(basaloidcarcinoma)、基底鳞状细胞癌(basosquamouscellcarcinoma)、细支气管肺泡癌(bronchioalveolarcarcinoma)、支气管癌(bronchiolarcarcinoma)、支气管源性癌(bronchogeniccarcinoma)、脑样癌(cerebriformcarcinoma)、胆管细胞癌(cholangiocellularcarcinoma)、绒毛膜癌(chorioniccarcinoma)、股样癌(colloidcarcinoma)、粉刺状癌(comedocarcinoma)、子宫体癌(corpuscarcinoma)、篩状癌(cribriformcarcinoma)、胸廓癌(carcinomaencuirasse)、皮跌癌(carcinomacutaneum)、柱状细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌(cylindricalcellcarcinoma)、导管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚胎性癌(embryonalcarcinoma)、體样癌(encephaloidcarcinoma)、epiennoid癌(epiennoidcarcinoma)、腺样上皮癌(carcinomaepithelialeadenoides)、夕卜植癌(exophyticcarcinoma)、溃疡性癌(carcinomaexulcere)、硬癌(carcinomaf!brosum)、股状癌(gelatiniformcarcinoma)、股样癌(gelatinouscarcinoma)、巨大细胞癌(giantcellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandularcarcinoma)、颗粒细胞癌(granulosacellcarcinama)、毛母质癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoidcarcinoma)、肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、大嗜酸细胞癌(Hurthlecellcarcinoma)、透明质癌(hyalinecarcinoma)、hypemephroid癌(hypemephroidcarcinoma)、幼稚型胚月台性癌(infantileembryonalcarcinoma)、原位癌、表皮内癌(intraepidermalcarcinoma)、上皮内癌(intraepithelialcarcinoma)、克龙》泉切尔癌(Krompecher'scarcinoma)、Kulchitzky细胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大细胞癌(large-cellcarcinoma)、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinomalenticulare)、月旨瘤癌(lipomatouscarcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓样癌(carcinomamedullare)、號样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌(melanoticcarcinoma)、软癌(carcinomamolle)、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液细胞癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮样癌(mucoepidermoidcarcinoma)、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucouscarcinoma)、粘液瘤样癌(carcinomamyxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngealcarcinoma)、燕麦细胞癌(oatcellcarcinoma)、骨化性癌(carcinomaossificans)、类骨质癌(osteoidcarcinoma)、乳头状癌(papillarycarcinoma)、门脉周癌(periportalcarcinoma)、原位癌(preinvasivecarcinoma)、棘细胞癌(pricklecellcarcinoma)、软糊状癌(pultaceouscarcinoma)、肾的肾细胞癌(renalcellcarcinomaofkidney)、储备细胞癌(reservecellcarcinoma)、肉瘤样癌(carcinomasarcomatodes)、施奈德癌(schneideriancarcinoma)、硬癌(scirrhouscarcinoma)、阴嚢癌(carcinomascroti)、印戒细胞癌(signet-ringcellcarcinoma)、单纯癌(carcinomasimplex)、小细胞癌(small-cellcarcinoma)、硬癌(solanoidcarcinoma)、球状细胞癌(spheroidalcellcarcinoma)、梭形细胞癌(spindlecellcarcinoma)、號样癌(carcinomaspongiosum)、鳞癌(squamouscarcinoma)、蜂状细胞癌(squamouscellcarcinoma)、绳捆癌(stringcarcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangieetatieum)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌(transitionalcellcarcinoma)、结节性皮癌(carcinomatuberosum)、结节性皮癌(tuberouscarcinoma)、疾状癌(verrucouscarcinoma)和绒毛状癌(carcinomavillosum)。术语"肉瘤"通常是指这样的肺瘤，即这种肿瘤由胚胎结締組织之类的物质构成，并且通常由嵌于纤维物质或同质物质中压实的细胞组成。肉瘤包括，例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、月旨肪肉瘤(adiposesarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡状软组织肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma)、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤(botryoidsarcoma)、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤(embryonalsarconm)、Wilns肺瘤肉瘤(Wilns'tumorsarcoma)、子宫内膜肉瘤(endometrialsarcoma)、间质肉瘤(stromalsarcoma)、尤因肉瘤(Ewing'ssarcoma)、筋膜肉瘤(fascialsarcoma)、纤维母细胞肉瘤(fibroblasticsarcoma)、巨细胞肉瘤(giantcellsarcoma)、粒细胞肉瘤(granulocyticsarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin'ssarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathicmultiplepigmentedhemorrhagicsarcoma)、B细胞免疫母细胞肉瘤(immunoblasticsarcomaofBcells)、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤(immunoblasticsarcomaofT-cells)、詹森肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡》皮西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、肝巨喧细胞肉瘤(Kupffercellsarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病'性肉瘤(leukosarcoma)、恶'性间叶肉瘤(malignantmesenchymomasarcoma)、骨膜外肉瘤(parostealsarcoma)、网织红细胞肉瘤(reticulocyticsarcoma)、劳斯肉瘤(Roussarcoma)、浆液嚢'性肉瘤(serocysticsarcoma)、滑膜肉瘤和毛细血管扩张'性肉瘤(telangiectaticsarcoma)。术语"黑色素瘤"用以指一种起源于皮肤和其他器官的黑色素细胞体系的肿瘤。黑色素瘤包括，例如肢端雀斑样痣黑色素瘤25(acral-lentiginousmelanoma)、无黑色素性黑色素瘤(amelanoticmelanoma)、良性幼年黑色素瘤(benignjuvenilemelanoma)、克劳德曼黑色素瘤(Cloudman'smelanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding画Passeymelanoma)、幼年黑色素瘤(juvenilemelanoma)、恶性雀斑样痣黑色素瘤(lentigomalignamelanoma)、恶性黑色素瘤(malignantmelanoma)、结节性黑色素瘤(nodularmelanoma)、曱下黑色素瘤(subungalmelanoma)和浅表扩散性黑色素瘤(superflcialspreadingmelanoma)。另外的癌症包括例如，霍奇金病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin'sLymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横紋肌肉瘤、原发性血小板增多症(primarythrombocytosis)、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌肿瘤(small-celllungtumors)、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛素瘤(malignantpancreaticinsulanoma)、恶性类癌(malignantcarcinoid)、癌前皮跌病变(premalignantskinlesions)、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌(genitourinarytractcancer)、恶性高钓血症、宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。在一些实施方案中，所述癌症为一种上皮癌或一种腺癌。例如，在一些实施方案中，所述障碍可为起源自上皮组织的卵巢癌或宫颈癌。再例如，在一些实施方案中，所述障碍可为选自但不限于卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和胰腺癌的一种腺癌。在一些实施方案中，可选择一种或多种用于检测已与癌症(以及在一些实施方案中，癌症的具体阶段)关联的自身抗体的抗原。与癌症相关的自身抗体发生免疫反应并且可与本申请的方法一起使用的抗原的非限制性实例在下文的表中列出。作为一个实例，可应用癌症抗原肽，例如凋亡蛋白抑制物(IAP)家族的成员(例如生存素)。生存素在大多数胰脏腺癌中表达(Sarelaetal.Expressionofsurvivin，anovelinhibitorofapoptosisandcellcycleregulatoryprotein,inpancreaticadenocarcinoma.BrJCancer.2002Mar18;86(6):886-92)。可用于本申请方法的其他抗原包括粘蛋白(例如CA125(MUC-16)、TAG-72和MUC-1)。许多腺癌中会出现粘蛋白产生的增多，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等。肿瘤相关的抗原MUC-1在多种来源的人腺癌中过表达且糖基化不足，所述多种来源例如乳房、卵巢和结肠(Henderikxetal.Humansingle-chainFvantibodiestoMUC-1corepeptideselectedfromphagedisplaylibrariesrecognizeuniqueepitopesandpredominantlybindadenocarcinoma.CancerRes.1998Oct1;58(19):4324-32)。另外，肿瘤相关的糖蛋白TAG-72在大多数人腺癌中表达，但^艮少在大部分正常组织中表达(Yoonetal.Construction,affinitymaturation,andbiologicalcharacterizationofananti-tumor-associatedglycoprotein-72humanizedantibody.JBiolChem.2006Mar17;281(ll):6985-92)。可用于本申请方法的其他抗原包括癌-睾丸抗原(例如NY-ESO-l、SSX-1、SSX-2、SSX-4和SCP-1)。作为一个实例，现已证明癌-睾丸抗原在卵巢浆液性新生物中的表达可与其恶性的程度直接相关。可用于本申请方法的其他抗原包括热休克蛋白(例如HSP27、HSP60、HSP卯和GRP78)。例如，现已证明HSP在肺腺癌中的表达较高。而且，HSP70和HSP90可能与子宫内膜癌的发生和预后相关联。亦见例如Crouteetal.Expressionofstress-relatedgenesinacadmium-resistantA549humancellline.JournalofToxicology&EnvironmentalHealthPartA.68(9):703-18,2005;Liangetal.Mislocalizationofmembraneproteinsassociatedwithmultidrugresistanceincisplatin-resistantcancercelllines.CancerResearch.63(18):5909醫16，2003;Lee.GRP78inductionincancer:therapeuticandprognosticimplications.CancerResearch.67(8):3496-9，2007;和Leeetal.GRP78asanovelpredictorofresponsivenesstochemotherapyinbreastcancer.CancerResearch.66(16):7849画53，2006。可用于本申请方法的抗原另一实例包括间皮素，它是存在于正常间皮细胞上并在多种人肿瘤中过表达的分化抗原，所述人肺瘤包括间皮瘤、卵巢腺癌和胰腺癌(Hassanetal.Mesothelin:anewtargetforimmunotherapy.ClinCancerRes.2004Jim15;10(12Pt1):3937-42;Baruchetal.lmmunocytochemicalstudyoftheexpressionofmesothelininfine-needleaspirationbiopsyspecimensofpancreaticadenocarcinoma.DiagnosticCytopathology.35(3》143-7，2007Puetal.UtilityofWT-l，p63，MOC31,mesothelin,andcytokeratin(K903andCK5/6)immunostainsindifferentiatingadenocarcinoma,squamouscellcarcinoma,andmalignantmesotheliomaineffusions.DiagnosticCytopathology.36(1):20國5，2008;Arganietal.Mesothelinisoverexpressedinthevastmajorityofductaladenocarcinomasofthepancreas:identificationofanewpancreaticcancermarkerbyserialanalysisofgeneexpression(SAGE).ClinicalCancerResearch.7(12》3862-8，2001;和Dennisetal.Markersofadenocarcinomacharacteristicofthesiteoforigin:developmentofadiagnosticalgorithm.ClinicalCancerResearch.11(10):3766誦72，2005)。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>HSP-90胞质GRP-78胞质前溶酶体酶家亲组织蛋胞质族的酶前体白酶-DPLAP质膜粘附分子EpCAM质膜粘蛋白TAG-72胞质和质膜CA125质膜Muc-1Mel誦CAM质膜Muc-16质膜粘附相关的蛋间皮素质膜白质(糖蛋白)激酶家族EGF激酶胞质监用于诊断不孕障碍的方法本申请公开的主题进一步提供了用于诊断和表征受试者中的不孕障碍的方法。不孕障碍是常见的医学病症，每年有大约730万美国人患此症。据估计，约10%-15%的尝试怀孕的已婚夫妇在一年后仍没有怀孕。不孕障碍包括女性不孕症，这是一个由健康保健提供者针对如下这样的女性所使用的术语，即这些女性在尝试至少一年后仍不能怀孕或者能怀孕但不能维持妊娠至足月。女性不孕症的大多数病例由排卵的问题引起。一些影响生育能力(fecundity)和生育(fertility)的不孕障碍包括卵巢功能早衰(POF)，其中卵巢在自然绝经前停止工作；多嚢性卵巢综合征(PCOS)，其中卵巢不能有规律地释放卵子或不能释放活的健康卵子；以及由子宫内膜异位症引起的生殖病理。其他不孕障碍可包括子宫内膜异位症、先兆子痫、早产、子宫内发育受限和反复妊娠丢失。目前，健康保健专家通过以下方式诊断不孕症进行由评估排卵状态组成的病情检查，进行鉴定子宫或输卵管病理学或者其他成因性因素的检查。在许多情况下，经排除常见的根本病因学并且在两个月经周期后完成临床诊断。生殖衰竭，一一包括反复自然流产和其他不孕障碍一一可由多种原因引起。29自身免疫机制参与到不孕障碍中，例如子宫内膜异位症和卵巢衰竭，并且可能是先兆子痫或自然流产的病理生理学的原因。在33-61%的原因不明性不孕症患者中已检测到抗卵巢的自身抗体，表明该病理学可代表早期阶段的自身免疫性卵巢衰竭。如在其他自身免疫病理学(例如l型糖尿病和曱状腺炎)中那样，抗卵巢的抗体可在发生临床症状之前数月或数年出现，因此它们可在患有原因不明性不孕症的女性中预测未来的卯巢衰竭。子宫内膜异位症是一种折磨多达10%的育龄女性的疾病，其特征在于激素调节的子宫外的子宫内膜组织生长。已知子宫内膜异位症可造成30-50%患病女性的女性不孕障碍。已表明自身免疫机制可能参与其中，抗不同候选自身抗原的抗体在这些患者中已被证实。虽然子宫内膜异位症中的不孕机制还不完全清楚，但是在多达三分之二的患者中已发现子宫内膜异位症与自身抗体和/或其他自身免疫疾病有关。已有报道，在患有子宫内膜异位症的患者中100%的存在抗子宫内膜的抗体，62%的存在抗卵巢的抗体。已在POF中研究了自身免疫的参与，自身免疫形式的POF的总比例估计为20-70%。在多种情形下，人卵巢可作为自身免疫攻击的靶标，所述情形包括多种器官特异性或全身性自身免疫疾病。在临床上，随后的卵巢功能障碍经常会引起POF,而涉及卵巢的其他病理学例如原因不明性不孕症、PCOS和子宫内膜异位症已与抗卵巢的自身免疫相关联。对这些病理学中的自身免疫机制的诊断有赖于对抗卵巢的自身抗体的检测，但最近特别的关注还集中在自身免疫反应的细胞组分上。然而，对自身免疫效应物的分子靶标的了解很少，并且真正被鉴定的自身抗原很少。对针对多种卵巢靶标的自身抗体的检测可支持POF的自身免疫病因学的假设。对抗卵巢的抗体的最初报道主要包括患有POF和相关的肾上腺自身免疫疾病的患者。这些患者具有这样的抗体，即该抗体可识别肾上腺皮质、睾丸、胎盘和卵巢的产生类固醇的多种类型细胞，并且被称为类固醇细胞抗体(SCA)。SCA的流行依赖于这样的临床特征它们可在大约60%的APS-I患者和25-40%的APS-II患者中被检测到，但最常(78-100%)出现于患POF的患者中。还已表明，33-43%的患多内分泌病和SCA的正常周期的女性将在8-15年内发生卵巢衰竭。生殖衰竭的另一种常见原因是PCOS，其特征在于与多种临床症状相关的高雄激素长期无排卯状态，并影响5-10%的生育年龄的女性。虽然PCOS以及无该综合征的多嚢卵巢与激素失调有关，但是已表明有自身免疫失调。已报道了具有与抗卵巢的血清抗体相关的嚢方面的自身免疫卯巢炎的组织病理学特征。多位研究人员已描述了非器官特异性和器官特异性自身抗体的普遍存在，并且已在50-60%的PCOS患者中证明有抗卵巢的抗体。Timg报道了在鼠模型中产生卵母细胞自身抗体可引起卵巢衰竭。无临床症状的患者中的自身免疫功能障碍还可引起反复的自然流产。事实上，某些反复流产者具有一种或多种异常自身抗体。在反复流产中已涉及抗磷脂的抗体、抗DNA的抗体和抗核的抗体。一种自然流产的机制被认为是胎盘血管的血栓形成和胎盘梗死，它们由自身抗体抗p2-糖蛋白I、凝血酶原(prothrombin)和/或膜联蛋白V(annexinV)的反应所致。另一个可能的原因是自身抗体直接结合于细胞滋养层细胞，通过阻止分化成合体滋养层减少滋养层侵入至母体蜕膜和植入。免疫系统已显示在卵巢功能早衰、多嚢卵巢综合征、子宫内膜异位症、反复妊娠丢失和其他不孕障碍的发病机制中起到重要作用。本申请公开的主题提供了免疫反应性的标记物(例如与一种不孕障碍相关的自身抗体)作为不孕障碍诊断辅助工具的用途，所述不孕障碍包括但不限于POF、PCOS、子宫内膜异位症、先兆子痫、早产、子宫内发育受限和反复妊娠丢失。而且，如本申请公开的主题提供的，对于抗生殖道上特定组分的自身免疫的评估是一种用于不孕症治疗的预后工具。由此，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种诊断受试者中的不孕障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含或疑似包含自身抗体的一个生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；在所述样品中检测对所述抗原产生免疫反应的自身抗体；并将自身抗体对所述抗原的免疫反应性水平与一个参考水平比较，以在诊断所述受试者中的所述不孕障碍。而且，在本申请公开的主题的一些实施方案中，提供了一种用于表征受试者中的与自身抗体产生相关的不孕障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供来自受试者的包含自身抗体的一个生物样品；将一种抗原与所述样品接触，其中所述抗原包括一种自身抗体免疫反应肽；在所述样品中检测对所述抗原发生免疫反应的自身抗体；并对自身抗体针对所述抗原产生的免疫反应性水平定量，从而表征所述受试者中的所述不孕障碍。例如，在一些实施方案中，所述不孕障碍选自但不限于卵巢功能早衰(POF)、多嚢性卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症、先兆子痫、早产、子宫内发育受限和反复妊娠丢失(自然流产)。而且，在一些实施方案中，所检测的自身抗体对源自卵巢、子宫内膜、胎盘或它们的结合的抗原有免疫反应性。在用于诊断和/或表征受试者中的不孕障碍的方法的一些实施方案中，所述自身抗体免疫反应肽可分离自一种外来体。在一些实施方案中，所述自身抗体免疫反应肽为选自以下的肽抗原分子量约50kD和80kD的核抗原以及分子量约10kD、30kD、45kD、90kD和125kD的膜抗原。膜蛋白质识别由所有不孕症共有；然而，核蛋白质识别似乎是子宫内膜异位症所特有的。IL用于检测自身抗体的试剂盒在另一些实施方案中，本申请公开的主题提供了用于检测生物样品中的自身抗体的免疫试剂盒。这类试剂盒一般可包含一种或多种本文公开的可与测试自身抗体发生免疫反应的抗原。在一些实施方案中，所述抗原分离自外来体，正如本文所公开的那样。因此，更具体地，所述免疫检测试剂盒将在合适的容器中包含一种或多种自身抗体免疫反应性肽抗原。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含与所述抗原结合的抗体和/或经例如Fc部分与其他抗体(例如目标自身抗体)结合的抗体。在某些实施方案中，所提供的抗原可结合于一种固体支持物上，例如柱基质或微量滴定板的孔、膜(例如硝酸纤维素、PVDF或类似材料)、珠子或者浸渍片。或者，所述支持物可作为所述试剂盒的单独组分提供。所述试剂盒的免疫检测试剂可包含与所给定的检测抗体或所述32抗原本身相关联或者连接的可检测标记。与一种第二结合配体相关联或者连接的可检测标记也被考虑。这种可检测标记包括染料、半抗原、化学发光分子或荧光分子(罗丹明、荧光素、绿色荧光蛋白、萤光素酶)、生物素、放射标签(3H、35S、32P、"C、1311)或酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)。所述试剂盒可进一步包含合适的设定量的标准品，同时包括抗体和抗原。它们可用于制备检测测定的标准曲线。不管本申请公开的主题的试剂盒的类型如何，它通常均可包含装有合适分装的所述生物试剂的一个或多个容器。所述试剂盒的组分可以水性介质的形式或以冻干的形式包装。本申请公开的主题的组合物可被有利地包装于这样的一个试剂盒中，即该试剂盒包含所述一种或多种活性试剂、一个合适的容器以及还有使用所述试剂盒的说明书。所述试剂盒的一种或多种试剂可以一种附着于一种固体支持物的液体溶液形式提供或以一种干粉形式提供。如果以一种液体溶液形式提供所述试剂，那么所述液体溶液可以是一种水性溶液。如果所提供的试剂附着于一种固体支持物，那么所述固体支持物可为层析介质(chromatographmedia)、具有多个孔的测试板或显微镜载玻片。如果所提供的试剂为干粉，那么通过添加一种合适溶剂可将所述粉体复水，所述溶剂可被提供。所述试剂盒的容器一般可包括所述抗原可置于其中且可根据需要适当地分装的至少一个微量滴定板孔、载玻片、玻璃瓶、试管、烧瓶、瓶子、或者甚至注射器或其他容器。如果提供了第二或第三结合配体或另外的組分，那么所述试剂盒通常还可包含这种配体或组分可置于其中的第二个、第三个或其他另外的容器。本申请的主题试剂盒一般还可包含一种结构，用于在商业销售时以密封方式包含所述抗原容器及任何其他试剂容器。这种结构可包括注模或吹模塑料包装体，所需容器被保持于其中。实施例引入以下的实施例来说明本申请公开的主题的实施方式。考虑到本申请的公开内容及本领域中的一般技术水平，本领域技术人员应了解，以下的实施例仅旨在示例，并且只要不偏离本申请公开的主题的范围进行多种改变、修饰和修改。实施例1反应性抗体与癌症关联自身反应性抗体已被证明普遍存在于所有受测试的癌症患者中。在卵巢癌患者(11=28)和无肿瘤的年龄匹配女性志愿者(n=32)中分析了肿瘤反应性自身抗体的出现情况。通过ELISA定量测定了卵巢癌患者血清中IgG的存在及其与源自卵巢肿瘤的细胞抗原的反应性。将来自对数生长期的UL-1卵巢肿瘤细胞的肿瘤来源细胞抗原以1:25稀释到由100mM碳酸钠和0.5MNaCl组成的偶联緩冲液(pH8.3)中。将等份试样添加至96-孔Immulon4微量滴定板的孔中，并在37。C下孵育过夜。将所述板以5%脱脂奶粉封闭，然后在4。C下与来卵巢癌患者和年龄匹配的正常对照的以1/200稀释的200jil血清孵育过夜。将所述板洗涤并与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体(以1/5000稀释)孵育，通过以下方式测量存在的结合抗体将所述孔与含OPD(0.4mg/ml)的50mM柠檬酸盐緩冲液孵育，在490nm测量吸光度。所有卵巢癌患者都表现出识别出卵巢肿瘤来源蛋白质的自身抗体水平，该水平显著高于其不携带癌的对应者(p<0.0001)。对照群体血清中观察到的IgG结合水平代表背景水平。在所述癌症患者和对照組之间在IgG与肿瘤抗原结合方面没有出现重叠。由于癌症患者呈现了一个升高的肿瘤反应性抗体水平，并且这些自身抗体的水平呈现了显著的差异性，所以在这些肿瘤反应性IgG的相对吸光度和疾病阶段之间进行统计学比较。关于与UL-1卵巢肿瘤分开(图1)。反应性i:G的水平随疾病阶段的发展出、现升高。来自I期癌症患者(n=8)的血清在如下背景之上呈现出显著的升高正常血清的背景(n=32，p<0.001)或患良性卯巢疾病女性的血清的背景(n=8，p<0.01)。在来自I期卵巢癌和低恶性可能性的卵巢肿瘤的血清中检测的免疫反应性没有出现显著差异。11期患者(11=10)中出现的免疫反应性水平显著高于I期患者中出现的水平(p<0.001),并显著低于m期患者(n=8)的血清中检测的水平(P<o.oi)。m期患者中出现的免疫反应性水平显著低于IV期患者(n=8)中出现的水平(p<0.001)。因此，卵巢癌患者呈现了与疾病阶段相关的肿瘤反应性抗体。实施例2肿瘤反应性IgG的特异性抗原耙标识别由于获自卵巢癌患者血清的自身抗体对卵巢肺瘤抗原的反应性基于疾病的阶段可表现出量的差异，由此也使用蛋白质免疫印迹和密度测定研究了性质上的差异。使用来自对数生长期的3个卵巢肺瘤细胞系(UL-1、UL-3和UL-6)的细胞蛋白抗原，通过蛋白质免疫印迹评估了与卵巢癌患者的体液免疫应答反应的组分的存在(图2,代表性的印迹)。使用患者血清(1:100稀释)作为第一抗体源进行蛋白质免疫印迹。先使用过氧化物酶缀合的人IgG的抗体，然后使用ECL显示源自患者的抗体与源自肿瘤细胞的抗原的结合。通过密度测定定量测定免疫反应性。分析了所识别的抗原及该识别的强度上的差异。分析了十(10)个I期血清、十(10)个II期血清、十(10)个m期血清和十二(12)个IV期血清。对于所有卯巢癌患者，这些蛋白质免疫印迹鉴定了分子量介于10-140kD的多条带，但在患者中免疫相互作用的数量和强度是不同的。信号在所述免疫印迹上的强度变化与疾病的阶段有关(每条带的总像素，相关系数r-0.906)。虽然，晚期癌症患者通常识别更大强度的更多条带，但是来自卵巢癌患者的IgG在这些蛋白质免疫印迹上出现了阶段特异性的差异识别模式。除了阶段相关的定量差异之外，早期阶段的患者还呈现出对分子量大于100kD的数种抗原所特有的强烈识别(图A中的框示出)，而晚期患者还呈现出对分子量小于40kD的抗原所特有的识别(图B中的框示出)。作为一个对照，还测试了正常血清对这些蛋白质的反应性，以及所述癌症患者血清对正常卵巢上皮的反应性。通过蛋白质免疫印迹没有发现来自正常(不携带肿瘤)女性对照的血清会识别蛋白质，而癌症患者的血清仅呈现与正常卵巢上皮的几个条带的反应性。由于一些抗原可被早期血清识别，并继续被来自晚期患者的血清35识别，这可表明这些抗原性蛋白质在早期表达并且其表达在整个肿瘤进展中得以保持。一些蛋白质似乎仅在肿瘤进展的晚期被识别，表明它们在后来发生改变和/或后来才出现。然而，由于它们在患者中的识别情况相同，因此在这些患者中它们可代表共同的变化。一些抗原性蛋白质似乎优先在早期被识别，表明早期肿瘤发生的关键蛋白质出现了改变。对这些阶段特异性改变的蛋白质的鉴定提供了对肿瘤发生和进展的每个阶段均很重要的改变的进一步了解。其他研究人员使用蛋白质印迹或基于源自肿瘤的抗原的ELISA的工作已在所有受试患者中检测到了肿瘤反应性抗体:然而，对特异性抗原蛋白质的识别的评估还没有在100%的患者中鉴定出单一组分，大多数单一蛋白质仅在10-40%的患者#皮识别出。这种有限的识别可能是由于大多数肺瘤反应性自身抗体的研究使用了重组蛋白质(在许多情况中是野生型蛋白质)，所述蛋白质缺乏可修改抗原表位的癌症相关的翻译后修饰，这可能会低估真实的免疫反应性水平。自身抗体对在正常及癌症组织中广泛表达的抗原的应答似乎可归因于肿瘤特异性突变或翻译后修饰。虽然在所有癌症中均可检测到肿瘤反应性自身抗体，但是肿瘤反应性IgG识别这些来自不携带癌症的志愿者的特异性抗原的事件很罕见(<1%),并且在本申请公开的测定系统中没有检测到这种事件。实施例3标记物鉴定的治疗响应由于在晚期疾病的患者中出现了反应性模式的差异，因而检查了这种差异和化学抗性之间的相关性。通过2维电泳分离细胞组分并随后进行蛋白质免疫印迹，使得这些差异中的一些可被评估。使用来自对顺铂治疗无最初响应的患者及呈现最初响应并>12个月保持无疾病的患者的血清，鉴定了对与顺铂抗性相关的3个点的一簇的识别(图3)。利用这些细胞抗原作为本文公开的诊断阵列的一部分可使抗性肿瘤被及早地鉴定。实施例4对体内识别的抗原蛋白质进行鉴定36由于患者的体液应答是针对与卵巢肿瘤相关的特定阶段相关的蛋白质，所以对这些免疫反应性抗原的鉴定通过开发一种蛋白质阵列开始。为了使分析的总蛋白质的数目最少，通过免疫沉淀将免疫反应性蛋白质分离。IgG分离自3名患晚期卵巢癌的女性的血清，分离使用的是lmlHITRAPPROTEING-SEPHAROSE⑧柱(GEHealthcare)。将结合的IgG级分以IMMUNPURE⑧洗脱緩冲液(GEHealthcare)洗脱，在280nm监测。将含IgG的级分合并并浓缩，然后依照生产商的说明书偶联至HITRAPNHSTM柱(GEHealthcare)。将来自UL-1卵巢肺瘤细胞的细胞蛋白质溶解并澄清。将固定的患者IgG的等分试样在4。C与所述细胞蛋白质制品孵育过夜，然后将结合的复合物洗脱。将这些免疫纯化的细胞蛋白质在4.6x250mmC8(300fi)柱上通过RP-HPLC色谙法分级分离。将所得到的级分通过speed-vac干燥，用于开发蛋白质阵列。将所述蛋白质溶液(2.5nl)手工加载至单个斑点上。将一个过氧化物酶缀合的Ig样品点至每个膜上作为阳性对照并用于所述阵列的定位(在图4A和4B中显示为C道)。将来自晚期卵巢癌患者的血清(1:100稀释)在4。C与所述膜孵育过夜，然后将膜与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体孵育，通过ECL显像。将所形成的膜成像，并使用用于斑点识别和定量的柯达分析软件(Kodakanalysissoftware)分析。每个被分析的卵巢癌患者均识别了多个蛋白质；然而，所有患者都识别一些蛋白质。使用该阵列系统，对照(非癌症患者)血清(11=10)未识别任何蛋白质靶标。为了鉴定引起这种观察到的与患者自身抗体的免疫反应的特异性蛋白质，将对应于这些被卵巢癌患者的体液免疫应答所识别的蛋白质的一部分进行基质辅助激光解吸-飞行时间(MALDI-TOF)质谱，接着进行胰蛋白酶消化。将所产生的肽在熔融二氧化珪微细管柱(75x200nm，PolymicroTechnologies,Inc.)上通过HPLC分级分离，并使用0-80%线性梯度乙腈的0.1M乙酸溶液(140B溶剂送递系统)直接洗脱至三重四极质镨仪(TSQ70，FinnigaiiMAT)的电喷雾离子源中。获得每个峰的质谱并将对每种蛋白质产生的分子量片段与其他已知蛋白质的数据库比较，用于鉴定蛋白质。还分析了另外的常见峰(11、19、44和49);然而，这些本申请的方法可鉴定一组仅被患卵巢癌的患者识别的抗原(图5)。本文公开的数据表明与疾病的存在、阶段和化学抗性相关的反应性组分的存在。数个小组已提出，蛋白质在癌症发生早期表达，以及它们中的多种已被发现可诱发自身抗体。Disis等人(Globalroleoftheimmunesysteminidentifyingcancerinitiationandlimitingdiseaseprogression.0/C7/w/c/(9"co/ogj;'23(35"S9Z-5，2卵5Z)ec.)证明，癌症患者在疾病早期阶段出现对肿瘤相关抗原的血清抗体反应。抗p53的自身抗体已在患早期阶段的卵巢癌、结直肠癌和口腔癌的患者中被报道。本申请的结果表明免疫反应性相对于阶段的显著差异，甚者，在早期阶段癌症中的识别也不同于正常和良性卵巢疾病。这些差异表示出定量的差异(结合强度或效价)，而不是定性的差异；然而，本申请公开的诊断阵列的设计使得能同时地鉴定自身抗体的存在并且对它们的结合(强度)定量。因此，本发明人已证明在肿瘤反应性抗体结合(强度)中存在的定量差异可充分区分癌症状态和阶段，从而用于诊断。实施例5对具有确立的蛋白质靶的蛋白质阵列进行评估使用抗本发明人以前鉴定的自身抗原蛋白质的市售抗体(表1)，通过免疫沉淀从溶解的UL-1卯巢癌细胞分离蛋白质。将这些分离的蛋白质用于确立一个蛋白质阵列，以确定本申请的方法的效力。将这些免疫纯化的细胞蛋白质用于开发一个蛋白质阵列，所述蛋白质阵列由1.5x2cm的总尺寸上的12个点组成。将12种蛋白质溶液的每一种(2.5jU)手工加载至单个的点上。将过氧化物酶缀合的IgG点至每张膜上作为阳性对照并用于所述阵列的定位。将以1:100稀释的来自正常女性对照(n=20)、患良性卵巢疾病的女性(n=20)和患侵袭性卵巢癌的女性(n=20)的血清在4。C与所述膜孵育过夜。然后将膜与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体孵育，通过ECL显像。将所形成的膜成像，并使用用于斑点识别和定量的柯达分析软件分析。将大于900像素的吸光度设置为阳性，并比较免疫反应性阳性的血清的百分数。来自所有患侵袭性卵巢癌的女性的血清识别至少2/12的受测抗原；然而，来自对照和患良性疾病的女性的血清也表现出对至少一种抗原的显著识别。相反，对4种或更多种的这些抗原的识别局限于来自患侵袭性卵巢癌的女性的血清。将对4种或更多种抗原的识别设置为截止值产生了一种这样的测定，即该测定具有区分患侵袭性卵巢癌和患良性卵巢疾病的患者的能力，并且敏感性=100%、特异性=76%且阳性预测值=100%。见图6。表l:从卵巢癌细胞分离、用于所述阵列的细胞抗原，以及具有抗所述阵列中每种蛋白质的自身抗体的卵巢癌患者的百分比。;抗原蛋白靶标i具有自体反应性IgG的患者(％);同源框基因家族<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>A114(EGFR激酶)固(22.2%)其他胎盘型碱性磷酸酶19/36(52.8%)NY-ES0117/36(47.2%)EpCAM27/36(75.0%)为了确定另外的参数，在区分良性和恶性卯巢结块之外，检查了另外的源自肺瘤的蛋白质。图7显示的图像来自一个36种蛋白质的阵列。基于这些结果，该阵列形式可区分与早期和晚期卵巢癌相关的抗原识别。图7中显示的数据基于来自单个卵巢细胞系(UL-1)的抗原。来自其他肺瘤细胞系的某些抗原可呈现更强的反应性。在所有卵巢癌患者中呈现最大交叉反应性的来自不同卵巢肺瘤系的最佳抗原可被特别地测定，用在早期疾病的诊断中。实施例6对分离自不同癌症的蛋白质的阵列进行评估下表显示了一个阵列的布局，显示从4种不同卵巢癌分离的20种抗原(产生一共80Ag)，与对照比较评估了这些抗原检测癌症患者中自身抗体的能力。所使用的4种卵巢癌细胞系为A-UL-1、B=UL-2、C-UL-3和D-UL-6，它们在具体实施方式中被详细公开。表2:用于检测自身抗体的抗原阵列的布局<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(其中procathD为亲组织蛋白酶-D)对于宫颈癌，对以下16名受试者的每一名的血清进行评估，以检测对分离自所述宫颈癌细胞系的蛋白质应答的抗体的存在。这包括12名患宫颈癌(腺鳞、鳞状细胞和腺癌)的受试者和4名对照者(无宫颈癌的受试者)。还在以视黄酸处理细胞培养物后评估所述反应性。大多数反应性在所有细胞系(ME180、SiHa、CaSki和C33A)的可溶级分中被检测到，并且是统计学显著的(p<0.05)(图8A和8B)。最少反应性在所有细胞系的膜级分中被检测到。所述反应性以像素定量。总体来说，CaSki(HPV16和18)表现最大反应性，并且在与其他细胞系相比时，在所述外来体级分和溶解级分中有最大反应性(p<0.05)。无HPV的细胞系C33A在膜级分中表现最大反应性。Mel80(HPV-39)表现最小量的反应性。相似的抗原识别跨各个细胞系被检测到。在不同细胞系之间有着有差异的抗原识别。对照血清没有表现出任何反应性。在以视黄酸处理的血清中，可溶的细胞相关抗原在所有细胞系中的反应性均降低(p<0.05)(图9)。用所述细胞相关抗原记录到了升高的反应性。这在以下级分中被检测到所有细胞系的膜级分(p<0.05)、C33A和SiHa细胞系的核级分(p<0.05)及SiHa细胞系的胞质溶胶级分(p<0.05)(图10)。实施例7对跨多个不同癌症的诊断测定进行评估实施例7的方法肿瘤反应性IgG对特异性抗原靶标的识别。由于获自卵巢癌患者血清的自身抗体对卵巢肿瘤抗原的反应性基于疾病的阶段表现出有定量差异，所以随后使用ELISA免疫印迹研究定性的差异，以定量测定与特异性抗原免疫反应的水平。外来体分离自3个对数生长的卵巢肿瘤细胞系(UL-1、UL-3和UL-6)条件培养基。特异性反应性抗原的制备。通过免疫吸附色谱从纯化的外来体分离用于测定靶标的反应性蛋白质。获得每种目的蛋白质的市售抗体。将这些抗体依照生产商的说明书固定于lml的HITRAPNHSTM柱(GEHealthcare)。在以lOO，OOOxg离心外来体后，将沉淀物溶解于在水上的含以下成分的50mMTris-HCl(pH7.5)中0.3%SDS、2mM原钒酸钠、200mMDTT、lmM氟化钠、lmM焦磷酸钠、1jig/ml亮肽素(leupeptin)、ljig/ml抑肽酶(aprotinin)、1pg/ml胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)和1mMPMSF。所述裂解物经声处理，并以lOO，OOOxg离心15分钟。所溶解的蛋白质通过与蛋白质G-琼脂糖(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)孵育1小时使之澄清。将该澄清的溶解蛋白质材料应用于免疫吸附柱并在4。C下孵育过夜。将结合的材料以含1%TritonX-100的PBS洗涤3次，所述特异性抗原蛋白质由0.1M甘氨酸-HCl(pH2.8)释放，由lMTris中和。将该抗原制品应用于在TBS中平衡的MACROSPHEREGPCTM150/60柱(4.6x500)(Grace,Deerfield，IL)并进行无梯度洗脱。通过蛋白质免疫印迹评估洗脱物的等分试样，以确证合适的分子级分。在4.6x250mmC8(300n)柱上通过RP-HPLC色谱进一步分离合适的抗原级分。将蛋白质峰通过真空离心干燥、重新悬浮于TBS中并通过蛋白质测定定量。ELISA确定的自身抗体反应性。为了确定源自患者的自身抗体对源自肿瘤的外来体的反应性的水平，进行了ELISA测定。将从每个免疫吸附制品分离的蛋白质以1:25稀释于由100mM碳酸钠和0.5MNaCl组成的偶联緩冲液(pH8.3)中。将等分试样(2jig/孔)添加至96-孔IMMULON4TM微量滴定板(Chantilly，VA)的孔中，并在37。C孵育过夜。将所述板以5%脱脂奶粉的PBS液封闭1小时，随后以PBS加0.2。/oTweeii-20和5。/o脱脂奶粉洗涤3次。然后，将所述板与来自患者和正常对照的以1/100稀释的200jil血清在4。C孵育过夜。将所述板洗涤并与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体(1/5000稀释)醉育1小时。在洗涤后，通过以下方式测量存在的结合抗体将所述孔与含邻苯二胺二盐酸盐(0.4mg/ml)(OPD，SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)的50mM柠檬酸盐緩沖液孵育，在490nm测量吸光度。实施例7的结果使用免疫吸附纯化的抗原，构建了用于每个测定的微量滴定板。将以1:100稀释的来自正常女性对照(n=10)、患良性卵巢疾病的女性(n=10)和患卵巢癌的女性(1-1￥期各11=10)的血清在4。C下与平行双孔孵育过夜。将所述孔以TBS洗涤3次，然后与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体孵育。在490nm测量每个孔的吸光度。确定每个患者的平均吸光度并对其作图。正常对照和患良性疾病的女性的免疫反应性都处于基线水平，并被认为相对于所有测试抗原是阴性的(图11)。图ll中曲线上的每个点均代表每个患者的平均值。在所有病例中，整个组的平均值与对照和良性病例是有统计差异的。为了评估本申请公开的方法作为一般性癌症诊断的方法的可用性，重复进行这一研究，所不同的是使用来自患晚期胰腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌的女性的血清。所有受测癌症患者似乎都生成识别核磷蛋白、组织蛋白酶D(cathepsinD)、p53和SSX抗原的自身抗体。仅患卵巢癌的女性识别胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)。患有肺癌和结肠癌的患者更强地识别生存素(图12)。实施例8对重组蛋白质与天然蛋白质上的抗原表位进行确定通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将一份(20jig)每种特异性天然抗原及其重组对应物分离。在电泳后，通过考马斯蓝染色法显示条带并将每个条带切下。以SDS电泳緩冲液平衡凝胶。将包含所述特定蛋白质的凝胶块应用至20%丙烯酰胺凝胶的孔中。将所述凝胶块切成更小的小块，并插入至SDS-PAGE浓缩胶的样品孔中。将100jU电极溶液加入至干的凝胶块上。在孵育1h后，将含溶于去离子水的10jil金黄色葡萄球菌(Aa/7卸/ococc附fl""ws)V8蛋白酶(Pierce，Rockford，IL，USA)(0.1ug/mL)的20fil稀释的SDS样品緩冲液加于所述样品溶液上。进行电泳至所述样品和蛋白酶在上层凝胶中堆积，中断1h以消化所述蛋白质。然后继续电泳，并将所分离的消化物电印迹于PVDF膜上。然后，将所述膜与1:100稀释的患者血清孵育过夜。在以TBS洗涤3次后，将所述膜与作为二抗的过氧化物酶缀合的人IgG的抗体孵育1小时。通过增强的化学发光显示所结合的免疫复合体(ECL，AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)。对于p53,患者l和3都识别所述源自肺瘤的蛋白质中的一条中间肽条带，所述肽条带不出现于所述重组蛋白质的肽中(图13)。对于GRP78，所有患者都识别所述源自肿瘤的蛋白质中的3-5条另外的肽条带，所述肽条带不出现于所述重组蛋白质的肽中(图13)。对于核磷蛋白，所有患者都呈现出与所述源自肺瘤的蛋白质的反应性强于与所述重组体蛋白质的反应性(图13)。患者2识别所述源自肺瘤的核磷蛋白中的3条另外的条带，患者3识别与所述重组蛋白质相比分子量更低的l条条带。这些结果表明，这些源自外来体的天然肿瘤来源的蛋白质与重组蛋白质相比呈现了另外的抗原表位。43实施例9对不孕障碍的诊断测定为了定量测定源自不孕障碍患者的自身抗体的免疫反应性水平，通过ELISA定量测定了患子宫内膜异位症的患者血清中的IgG的存在及其对源自子宫内膜、核和胞质溶胶的细胞抗原的反应性。将从每种亚细胞级分分离的蛋白质以1:25稀释于由100mM碳酸钠和0.5MNaCl组成的偶联緩冲液(pH8.3)中。将等分试样添加至96-孔IMMULON4TM微量滴定板(Chantilly，VA)的孔中，并在37'C孵育过夜。将所述板以5%脱脂奶粉的PBS液封闭1小时，随后以PBS加0.2。/。Tween-20和5。/。脱脂奶粉洗涤3次。然后，将所述板与来自患者和正常对照的以1/100稀释的200jil血清在4。C孵育过夜。将所述板洗涤并与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体(1/5000稀释)孵育1小时。在洗涤后，通过以下方式测量结合抗体的存在将所述孔与含邻苯二胺二盐酸盐(0.4mg/ml)(OPD，SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)的50mM柠檬酸盐緩冲液孵育，并在490nm测量吸光度。血清样品获自年龄在21-34岁并且被诊断为不孕的女性，所述不孕由子宫内膜异位症、卵巢功能早衰(POF)和反复妊娠丢失引起。对照受试者为年龄匹配的无痛症状、无骨盆异常且以前无骨盆手术的女性。依照修订的美国生殖医学协会(rASRM)分类确定子宫内膜异位症的阶段。样品获自格里维尔健康系统(GreenvilleHealthSystem)和路易斯维尔大学(UniversityofLouisville)的生殖内分泌学和不孕症系(DivisionsofReproductiveEndocrinologyandInfertility)。25个标本获自对照、25个均来自II期子宫内膜异位症和m期子宫内膜异位症的女性患者、18个经历反复妊娠丢失的患者以及11个患卵巢功能早衰的患者。样品的收集经GHS和路易斯维尔大学的人类研究委员会(HumanStudiesCommittee)的知情同意审查。将静脉血样品收集至肝素化的管中并在凝固后分离血清。将血清保存于-70'C至使用。虽然有变化，但是所有具有不孕障碍的测试患者与正常对照患者相比都表现出了显著的自身抗体水平(p<0.0001)。由于患者呈现出提高的自身抗体水平，且这些自身抗体的水平呈现出显著的变化性，所以在这些IgG的相对吸光度和疾病的阶段之间进行了统计学比较。反应性IgG的水平随疾病的阶段出现升高，来自ii期患者的血清呈现出显著高于正常血清(p<0.001)(图14)。对于所有来源的抗原，在m期中存在的免疫反应性水平显著高于在n期患者的血清中检测的水平(p<0.01)。为了表征这些自身抗体与来自子宫内膜的抗原的反应性，通过蛋白质免疫印迹进一步分析了来自正常对照和患子宫内膜异位症(n期和m期)的女性的血清样品。所述患者组的代表性免疫印迹显示于图15中。对照患者(无子宫内膜异位症)对任何细胞抗原均未表现出显著的识别。患n期子宫内膜异位症的患者与来自子宫内膜和卵巢的细胞抗原都呈现出强反应性。在这些組织中，最强的反应出现于来自子宫内膜的膜级分的抗原，接下来是来自卵巢的膜抗原。来自患ni期子宫内膜异位症的患者的血清呈现出类似的反应性模式；然而，与所有来源的膜抗原呈现出更大的强度。在子宫内膜膜抗原中，所有患子宫内膜异位症的患者均识别80和140kD的蛋白质，而患m期疾病的患者识别另外的IO、28和40kD的条带。共同识别的140kD膜蛋白质为卵巢膜抗原所共有。通常，患子宫内膜异位症的患者还呈现出强的对90和iookD蛋白质的共同识别，而患ni期疾病的患者还识别另外的50和78kD的条带。与源自胞质溶胶的抗原几乎没有出现反应性。由于所述反应性的强度，通过以二维电泳分离子宫内膜膜抗原进一步分析了所述抗体结合(图16A和16B)。该方法使得膜抗原被进一步分离。与ii期相比，在m期子宫内膜异位症患者中出现的反应性水平升高似乎是由于升高的与相同组分的反应性和对另外的组分的识别两者所致。基于该研究的结果，针对特定细胞蛋白质的子宫内膜自身抗体及/或对nk激活的抑制的评估可作为子宫内膜异位症的诊断指示物。与特定子宫内膜膜抗原存在反应的自身抗体的存在似乎是子宫内膜异位症发生所特有的，并且与疾病的阶段有关。单独对nk激活进行评估对于诊断标记物的使用可能不具有特异性，但可与自身抗体的存在相结合；它们可为子宫内膜异位症的确诊提供挣异性和敏感性。为了评估该方法对不孕症病因的区分，所述蛋白质阵列模板由4x8cm的总尺寸上的34个斑点组成，宽度上4个斑点及长度上80个斑点。该模板被用作标杆，以将溶液点于MAGNAGRAPH膜(MSI)上。为了将捕获的蛋白质点至所述膜上，将所述模板至于光盒上，并将MAGNAGRAPH膜置于所述模板之上。外来体分离自Hec-1A子宫内膜细胞的培养物。将所分离的外来体溶解，然后使用0.25%SSA沉淀。然后，将所沉淀的外来体蛋白质重新悬浮于TBS中，并进行声处理。然后以如下方式将该蛋白质溶液分级分离使用C18反相HPLC柱，以0-100%的乙腈梯度洗脱。将所产生的32个蛋白质峰浓缩，并通过真空离心去除溶剂。将每种蛋白质重新悬浮于TBS中，并测定蛋白质浓度。将每种蛋白质溶液(0.25nl)手工上样至单斑点上。将每种蛋白质溶液在溴酚蓝(用于示踪)中稀释成100网/ml的初始浓度。对于每种蛋白质，制备2ng的斑点。以5。/。BSA的0.1MTris-HCl(pH7.6)、0.15MNaCl溶液(TBS)将所述膜在室温下封闭1小时。然后将膜以TBS加0.1%Tween-20洗涤3次，并以TBS洗涤2次。然后将所述膜保存于封口袋中并冷冻至使用。对于诊断测试，以血清进行测定。使用本申请公开的蛋白质阵列测试了来自已知患者和有正常生育能力的非妊娠对照的稀释血清(1:100)，以确定最佳的血清稀释度，与靶蛋白质的稀释液结合，以鉴定具有特定病因学的不孕症的患者。在使用所述阵列膜之前将其以TBS-Tween-20洗涤，并且在TBS中制备10倍连续稀释的患者血清。将所稀释的血清在4。C与膜孵育过夜。以TBS加0.1%Tween-20洗涤所述膜3次。然后将膜与过氧化物酶缀合的人IgG的抗体孵育，以TBS洗涤3次，并通过ECL显像。将所形成的膜以柯达D290相机成像，并使用用于斑点识别和定量的柯达分析软件分析(图17)。出现了不同的免疫反应性模式。基于这种对子宫内膜的蛋白质抗原的差异识别，可区分并诊断子宫内膜异位症引起的不孕障碍的患者与卵巢功能早衰引起的不孕障碍的患者。以类似的方法，使用蛋白质免疫印迹，还对经历反复妊娠丢失的女性检查了抗胎盘来源抗原的自身抗体的存在情况(图18)。妊娠可引起自身抗体的产生，这来自于从Thl至Th2免疫应答的正常偏移。然而，经历反复妊娠丢失的女性同时呈现出增加的总体免疫反应性和对特有组分的识别。以后经历反复妊娠丢失的无症状患者可识别分子量小于45,000道尔顿且大于130,000道尔顿的另外的蛋抗原。参考文献Abu-Shakraetal.，Cancerandautoimmunity:autoimmuneandrheumaticfeaturesinpatientswithmalignancies.AnnalsRheumDis60:433-440,2001.Barboucheetal.，Prognosticsignificanceofautoantibodiestolamininintheseraofbreastcancerpatients.EuropJClinChemClinBiochem32:5"-514'1994.Brichoryetal.'Proteomics-basedidentificationofproteingeneproduct9.5asatumorantigenthatinducesahumoralimmuneresponseinlungcancer.CancerRes61:7908-7912,2001.serologicalresponse:Biologicalsignificanceandclinicalimplications.AnnalsOncol7:227-232，1996.Chinnietal.,CathepsinDandglucose-regulatedprotein78recognizedbythehumoralresponseofovariancancerpatients.ClinCancerRes3:1557-1564，1997.Conroyetal.'Autoantibodiesto90kDheat-shockproteininseraofbreastcancerpatients.Lancet345:126，1995.Hellstrometal.，Principlesoftumorimmunity:Tumorantigens.In:DeVitaVT，HellmanS，andRosenbergSA，eds.Biologictherapyofcancer.NewYork:Uppincott，1991:35-52.JungandSchluesener,JExpMed173:273-276，1991.KoteraYetal"Humoralimmunityagainstatandemrepeatepitopeofhumanmucinmuc-1inserafrombreast,pancreaticandcoloncancerpatients.Kuttehetal.，Immunologiccharacterizationoftumormarkersinhumanovariancancerce卄lines.JSocGynecolInvest3:216-222，1996.Labrecqueetal"Analysisoftheanti國p53antibodyresponseincancerpatients.CancerRes53:3468-3471，1993.Liottaetal.,Proteomicpatternsinseraserveasbiomarkersofovariancancer.GynecolOncol88:S25-S28,2003.Lubinetal.，Analysisofp53antibodiesinpatientswithvariouscancersdefineB-cellepitopesofhumanp53:Distributiononprimarystructureandexposureonproteinsurface.CancerRes53:5872-5876，1993.Merimskyetal.,Antigensandantibodiesinmalignantmelanoma.TumourBiol15:188-202，1994.Nakamuraetal.HandbookofExperimentalImmunology(4thEd.)，Weiretal.(eds).Vol.1，Chapter27，BlackwellScientificPubl"Oxford,1987.Niklinskaetal"Strongassociationbetweenp53proteinaccumulation,serumantibodies,andgenemutationinnon-smallcelllungcancer.FoliaHistochemCytobiol39:51-56,2001.Oldl_J,ChenYT:Newpathsinhumancancerserology.JExpMed187:1163-1167，1998.Peoplesetal"BreastandovariancancerspecificcytotoxicTlymphocytesrecognizethesameHER2/neU"derivedpeptide.ProcNatlAmerSciUSA92:432-436,1995.TaylorandDoellgast,Quantitationofperoxidase國antibodybindingtomembranefragmentsusingcolumnchromatography.AnalyticalBiochemistry,98:53-59'1979.Tayloretal.，Identificationofantigeniccomponentsrecognizedby"membranebound"antibodiesfromovariancancerpatients.AmJR印rodImmunol6:179-184,1984.美国专利3,817,837。美国专利3,850,752。美国专利3,939,350。美国专利3，996，345。美国专利4,275,149。美国专利4,277,437。美国专利4,302,534。美国专利4，366，241。美国专利4,637,988。美国专利4,786,594。美国专利5,108,896。美国专利5，229，302。美国专利5,629,164。美国专利5,691,154。Vlocketal,Incidenceofserumantibodyreactivitytoautologousheadandneckcancercelllinesandaugmentationofantibodyreactivityfollowingaciddissociationandultrafiltration.CancerRes49:1361-1365，1989.Vogletal.,Autoimmunityagainstp53predictsinvasivecancerwithpoorsurvivalinpatientswithovarianmass.BritJCancer83:1338-1343，2000.Winteretal"Developmentofantibodiesagainstp53inlungcancerpatientsappears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