微腔板及其制造方法

专利名称：微腔板及其制造方法
技术领域：
本发明涉及微腔板(micro-chamber plate)及其制造方法，更具体地涉及一种便 于实时测量和分析从包含引物(primer)或探针的多个反应溶液(选择性地绑定到每个对 应的基因)的反应获得的荧光以便分析包含多个基因的生物样本而不会交叉污染的微腔 板及其制造方法。
背景技术：
微腔板是这样一种容器，其中发生了多达数微升的微小反应。这种微腔板可以由 硅晶片、玻璃、金属或塑料构成。微腔板是一种其中所述微腔以2维形式排列的板。在该板 中，用于样本输入的入口位于一侧，而另一侧由透明材料制成以便观察内部反应。为了测量基因量，开发出了实时聚合酶链反应(PCR)与PCR共同执行，PCR方便了 对与基因量成比例增加的荧光的测量。在实时PCR中，在每个周期内测量从PCR产品产生的荧光，并且确认给出至少所需 荧光的特定周期，这导致对某一具体基因的早期浓度的量化。当PCR完成时，实时PCR不需要电泳(electrophoresis)，而是随着PCR —起进 行，并且有助于产品的量化，准确来讲，其实现了具有至少109浓度范围中的具体核酸序列 的基因的量化(“A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004—2006 International University, " RealtimePCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group)。已经开发了用于分析多个样本的实时PCR的多种装置，通过使用标准96孔板或 384孔板(Roche Light cycler 480, ABI 7500,7900)来分析96个或384个基因的设备对 它们进行举例说明。Roche提供的实时PCR设备要求10_50微升的样本量，这是一个很大的量。为了解决以上问题，提出了不同的方法，通过利用MEMS (微电子机械系统)技术减 少样本量在短时间段内分析多个样本。一个例子是使用微腔阵列板的方法。使用微腔阵列板的方法由以下步骤组成在微腔中加载反应样本；密封每个微腔 以隔离每个反应溶液；诱发反应并对其进行分析。具体地讲，样本溶液被添加到微腔中。用于细胞培养的透明微腔板被覆盖了半 透明隔膜以将微腔彼此隔离开。在每个微腔中仅培养一个细胞。接着，培养基(culture medium)被去除，向其添加Taqman反应溶液，并用清油进行密封以防止蒸发。用温度循 环(temperature cycling)来测量板底部上的荧光(YASUDA, Kenji EP 1，541，678 Al, JP 2002245900NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER)。根据上述方法，要使用微量吸管将不同的溶液加载到每个微腔中，这耗费了很 长的时间。具体地讲，为了将样本注入到至少1536个微腔中，必须有微型自动分配器 (dispenser) 0在注入每种溶液之后，必须清洗该微型自动分配器，这将消耗很长时间。因 此，实际上很难使用超过384个板。
第二，为了克服上述问题，E.Tamiya集团的Hdenori Nagai提出了一种反应器， 其中通过光刻和化学蚀刻由硅晶片构成了微腔阵列(Anal. Chem. 2001 73，1043-1047， Development of a Microchamber Array forPicoliter PCR)。所述反应器使用显微镜载物片盖玻片来防止PCR溶液的蒸发。但是，当盖玻片被 拿开时，存在反应溶液发生交叉污染的机会。因此，防水隔膜被插入在盖玻片和晶片之间。 接着，首先去除盖玻片，然后在反应溶液干燥之后去除抗水隔膜，之后进行分析。上述处理 是比较麻烦的。因此，该反应器在实时基因量化放大方面的可用性是有限的。第三，为了克服根据上述量化放大的问题，同一实验室的Y. Matsubara等人开发 了一种微腔阵列，其通过以下步骤来制备使用微阵列装置在晶片上的凹形微腔中加载每 禾中引物；以及使其干燥(7thInternational Conference on Miniaturized Chemical and BiochemicalAnalysis Systems October 5-9,2003, Squaw Valley California USA)。在该微腔阵列中，芯片的上部被覆盖了矿物油以完全密封该微腔，接着使用纳米 喷射分配器将PCR反应混合物加载在矿物油上。根据该方法，通过光刻和化学蚀刻用硅晶 片(1x3英寸)制成了 1248个容量为50纳升(0. 65X0. 65X0. 2mm)的微腔阵列芯片。使 用纳升分配器在微腔中分配引物和Taqman探针溶液，之后进行干燥。整个芯片用矿物油涂 敷，因此每个微腔都被分开和密封。根据上述第三种方法制成的微腔阵列对于PCR是有利的，反应成分之间没有交叉 污染。具体地讲，根据该方法，将Taq DNA聚合酶和样本DNA的混合溶液喷洒在矿物油(分 配在每个微腔中)的顶部，引起微腔中的每个反应成分的PCR而没有交叉污染。然而，以上方法还存在以下问题。该方法需要微阵列纳升分配器来注入溶液。分 配要花费很长时间。而且由于在移动板的过程中矿物油的流动，反应溶液之间发生交叉污 染的可能性很高。另外，温度循环过程中在高温下形成了气泡。由于油和水溶液的疏水性 而引起的透镜效果将水溶液变为球形，这是另一个问题，造成了在光学测量期间激发光的 散射和色散并且发光，从而使得测量误差更大。第四，开发了有助于比以上第三示例多得多的反应的PicoTiterPlate，尽管该 微腔也是通过类似于第三示例的化学蚀刻制成的(John H. Leamonet al. , A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discretepico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003,24,3769-3777)。根据该方法，以39. 5pl的量同时发生了 300，000个独立的PCR反应。但是，该方法需要用于固定引物/探针的载物片，这使得它不适于进行要求平坦 光学特性的实时量化PCR。第五，提出了“膜反应器(或DNA卡)”(美国专利第5948673号)以对微样本起反应。膜反应器由三层薄膜组成。准确地讲，下层膜形成了反应器的底部，中间膜形成了 反应器的侧部，而上层膜形成了样本入口。在使用吸液管注入了微样本溶液之后，入口必须 被完全密封以便进行反应。如果入口没有被完全密封，在PCR过程中反应溶液就可能蒸发。 为了同时处理上千个样本，所述膜反应器必须变得很复杂。因此，这种反应器很难在实际中 使用。第六，在W0 02/40158和US 6，232，114中描述了具有标准ELISA板尺寸并且有助
5于1536个荧光分析反应的反应板。对于板而言，在板中穿透了多个孔，并且在板上附接了具有弱荧光的透明膜，从而 形成了多个反应容器。试剂被加载在这些容器中，并且用透明膜来密封这些容器，之后进行反应。该反应 板具有清洁的上部和下部。在一侧照射激励光，在另一侧测量荧光。然而，该第六示例也有问题。为了分析多个基因，必须将不同的引物和探针加载到 每个微腔中。即，为了分析多个样本，必须将数千个不同的溶液注入这些微小的微腔内。因 此，需要类似于纳升分配器的特殊设备并且此项任务要花费很长时间。另外，样本注入故障 的高可能性是另一问题。由于微腔不能被完全充满反应混合物，所以在温度上升过程中会 在微腔的顶部产生水蒸汽，从而导致光学测量难以进行。因此，需要一种新颖的微腔板，其有助于均勻地将样本注入到多个微腔中，排除了 反应溶液之间的交叉污染，防止在光学测量件的侧面形成气泡和凝结水蒸汽，由此有助于 对从反应产品产生的光进行实时分析。

发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的是提供一种微腔板及其制造方法，其有助于 用少量样本进行准确分析，其特征在于防止了反应溶液从用于实时PCR、恒温酶反应或 LCR(连接酶链反应)的微腔进行蒸发；溶液的注入变得简单，明显减少了注入时间；防止了 不同微腔中的反应溶液之间的混合；并且排出了反应溶液中的微气泡以便对光学值进行准 确测量。本发明的微腔板的构成如下主体，其具有位于一侧的可实现光学测量的光学测 量部分，位于另一侧的用于样本注入的入口部分，以及具有多个空间的微腔；透明层，用于 密封位于主体的一侧的光学测量部分；以及注入层，用于在遮挡(block) 了另一侧的入口 部分的情况下将包含样本的试剂注入到微腔中。此处的微腔的特征在于在形成注入层之前，加载包含诸如用于核酸分析的引物 或探针的特定成分(A)的分析试剂。所述微腔还包括核酸放大酶、dNTP或缓冲剂。当完成注入包含样本的公共试剂时，用粘性膜、水基包皮形成成分(water-based envelope forming component)、油或在常温下为固体的固体成分对所述注入层(130)进行 密封。注入层由可打孔膜构成。即，注入层的特征在于被打孔以便与每个微腔相连接。 孔的优选数量是每微腔l-io个。注入层的特征还在于是用多孔材料制成的。透明层是由在0°C -100°C温度下不变形的材料制成的，该透明层允许或阻挡特定 波长的光穿过。在该微腔板上，主体上的入口部分区域的突起在所述上部上形成了开放空间，试 剂或样本被直接加载到微腔的上部的开放空间中。该微腔板的特征还在于在一侧上形成有借以加载包含样本的公共试剂的供应部 分，另外还在其上形成有样本供应层以通过密封的开放空间来排出气体。微腔优选地是圆柱体或长方体，但绝不限于此。微腔的大小优选地是宽度0. 3-3mm、深度 0. 5-5mm。该微腔板被放置在容纳(harbor)包含样本的公共试剂的单独容器中以使包含试 剂的样本可以被加载到微腔中。该微腔板的特征在于是由保护透明层的第一保护部分或保护注入层的第二部分 构成的。第一保护部分或第二保护部分是用可分离的粘性膜或可附着材料制成的。该微腔板的特征在于是由多个微腔构建成的。本发明的微腔板的制造方法包括以下步骤a)制备主体，该主体具有形成在一侧 的用于光学测量的光学测量部分和形成在另一侧的用于样本注入的入口部分以及被多个 开放空间彼此分开的微腔(Sa) ；b)在主体上的光学测量部分上形成透明层(Sb) ；c)通过 主体上的入口部分来分配特定成分(A)以将不同的特定成分(A)加载到微腔板中(Sc)；以 及d)在微腔板的另一侧形成注入层(Sd)。该微腔板的制造方法还可以包括以下步骤e)在d)形成注入层(Sd)之后形成保 护注入层的第一保护部分或保护透明层的第二保护部分(Se)。使用本发明的微腔板来分析样本的方法使用了通过以上制造方法而制备出的微 腔板，并且严格来讲包括以下步骤i)通过微腔板的注入层向微腔中注入包含样本的公 共试剂(Si) ；ii)当完成注入包含样本的公共试剂之后密封该注入层的上部(Sii)；以及 iii)使包含样本的公共试剂与特定成分发生反应(Siii)。在该方法中，根据形成注入层的 材料，密封注入层的上部的步骤可以省略。在注入包含样本的公共试剂的步骤(Si)中，将包含样本的公共试剂注入到微腔 中是在离心力的作用下以及在减小或增大的压力下进行的以便进行有效注入。在注入包含样本的公共试剂的步骤(Si)中，如果多个样本或试剂被依次注入，则 在每次注入之间还要包括调节微腔板的压力的步骤(Siv)。调节压力的步骤(Siv)由用于将残留气泡从微腔中排出的解除(cancelation)减 压或加压处理构成。在密封步骤(Sii)中，当完成注入包含样本的公共试剂时，使用粘性膜、水基包皮 形成成分、油或在室温下为固体的固体成分来执行注入层的密封。由于该方法仅仅要求很少量的样本，所以本发明的微腔板及其制造方法能够减少 反应溶液的量，并且由于温度调节很容易(因为微腔板很薄)，所以减少了分析时间，以及 由于通过防止分离的微腔中的溶液通过彼此接触而被污染以及防止微腔中产生的气泡残 留在其中而造成光学测量的不准确测量，所以提高了分析效率。本发明的微腔板及其制造方法还具有容易将样本溶液注入到微腔中的优点，这有 助于对大量样本进行同时处理，并且得到了使分析程序简单而容易的简单处理过程。另外，根据本发明，多微腔板被形成为一体，但每个微腔板都可以具有不同的试 剂，从而能够在短时间内进行大量样本的同时比较和分析。


本发明的以上和其他目的、特征和优点将从随后结合附图对优选实施方式的描述 中变得明了，其中图1是例示本发明的微腔板的斜视图2是例示图1所示微腔板的截面图；图3是例示本发明的微腔板的另一截面图；图4是例示本发明的微腔板的另一斜视图；图5是例示图4所示微腔板的截面图；图6是例示本发明的微腔板的另一斜视图；图7是例示本发明的微腔板的另一斜视图；图8是例示本发明的微腔板的另一斜视图；图9是例示图8所示微腔板的截面图；图10是例示本发明的微腔板的另一截面图；图11是例示本发明的微腔板的另一斜视图；图12是示出本发明的用于实时PCR的分析系统的图；图13是示出本发明的微腔板制造方法的流程图；图14是示出本发明的微腔板制造方法的流程图；图15是示出使用本发明的微腔板的分析方法的流程图；图16是示出使用本发明的微腔板的分析方法的另一流程图；而图17是示出使用本发明的微腔板的分析方法的另一流程图。**对图中主要部分的标号的描述#1000 本发明的用于实时PCR的分析系统100:微腔板110:主体111 微腔Lm 微腔板的宽度Dm 微腔板的深度112:入 口部分113:光学测量部分114:开放空间部分115:分隔壁部分120 透明层130:注入层140 样本供应层141 供应部分150 第一保护部分160 第二保护部分170 主体连接部分200 压力调节装置300 温度调节装置400 旋转装置A 特定成分Sa Se 本发明的微腔板制造方法的每个步骤
Si Siv 使用本发明的微腔板的分析方法
具体实施例方式下面结合附图来详细描述本发明的微腔板(100)及其制造方法。图1是例示本发明的微腔板(100)的斜视图；图2是例示图1所示微腔板(100) 的截面图；图3是例示本发明的微腔板(100)的另一截面图；图4是例示本发明的微腔板 (100)的另一斜视图；图5是例示图4所示微腔板(100)的截面图；图6是例示本发明的微 腔板(100)的另一斜视图；图7是例示本发明的微腔板(100)的另一斜视图；图8是例示本 发明的微腔板的另一斜视图；图9是例示图8所示微腔板的截面图；图10是例示本发明的 微腔板的另一截面图；图11是例示本发明的微腔板的另一斜视图。图1-图6是例示本发明的微腔板(100)的图。本发明的微腔板(100)的构成如 下包括具有光学测量部分(113)和入口部分(112)的多个微腔(111)的主体(110)；分别 形成在主体(110)每一侧的透明层(120)；以及注入层(130)。主体(110)是形成微腔板(100)的基本结构，其包括用于加载样本、反应溶液或溶 剂的多个微腔(111)。主体(110)可以由硅晶片、玻璃、金属或塑料制成。微腔(111)具有形成在腔的一 侧以便进行光学测量的光学测量部分(113)以及形成在另一侧的借以加载分析必需的材 料的入口部分(112)。透明层(120)用于密封主体(110)的形成有光学测量部分(113)的一侧，优选地 由对于光学测量透明的材料制成。此处，微腔板(100)在分析过程中被加热。因此，板优选地用具有阻热性的材料制 成。透明层(120)优选地用在0°C -100°C不发生变化的材料制成。透明层(120)阻挡特定波长的光以便进行光学测量或仅仅允许特定波长的光透 过，假设透明层被设计为用于更准确的光学测量。注入层(130)形成在主体(110)上形成有入口部分(112)的一侧以遮挡入口部分 (112)。通过注入层(130)将包含样本的公共试剂加载到微腔(111)中。注入层(130)通过遮挡入口部分(112)来防止内部材料蒸发，并且优选地由可打 孔材料或多孔材料制成以将试剂加载到微腔(111)中。可打孔材料可以是膜型材料，膜型注入层(130)被打孔以与微腔(111)相连接。孔的数量是每个微腔(111) 1-10个。膜的材料从由Teflon、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、 PVC和PET构成的组中选择。孔的宽度是10 u m-lmm,更多情况下100-500 u m。优选地调节压力以便通过注入层(130)成功注入。注入层(130)可以使用多孔材料而无需进行打孔。在此通过微孔隔膜、网孔型材 料以及非编制织物来举例说明多孔材料。多孔材料的小孔大小优选地是0. 1-100 ym。当通过注入层(130)完成样本注入时，用粘性膜、水基包皮形成成分、油或在室温 下为固体的固体成分来覆盖注入层(130)以防止样本蒸发或排出，并防止不同微腔(111) 中的样本之间发生混合。如果注入层(130)由可打孔膜材料制成，则优选地用诸如乙烯基 胶带(vinyl tape)的粘性膜带来覆盖注入层(130)的上部。如果注入层(130)由多孔材 料制成，则对注入层(130)涂抹目前销售的用于PCR的矿物油(Sigma)以通过注入层(130)穿透油成分。本发明的微腔板(100)在形成注入层(130)之前还可以在其微腔(111)中包含特 定成分(A)(如包含用于核酸分析的引物或探针的荧光分析试剂)，如果需要，还可以包含 核酸放大酶、dNTP、缓冲剂或稳定剂(与反应溶液、引物和酶良好混合以使其稳定并减少在 容器上的粘附的材料，例如多羟基化合物、碳水化合物、牛白蛋白和PEG)。该特定成分(A) 根据其构成以干燥相、半干燥相或液相被使用。因此，在形成透明层(120)之后一侧被密封的微腔(111)包含了样本特定成分 (A)。S卩，在形成注入层(130)之前预先加载具有独特功能的材料，从而制成了微腔板。为了用微腔板来分析样本，通过离心力或在减小或增大的压力下将包含样本的公 共试剂注入到微腔(111)中(下文将详细说明)。附图中例示了本发明的微腔板(100)的实例。图1和图2例示了由主体(110)上具有规则间距(Lm)的圆形截面的多个微腔 (111)组成，其中注入层(130)和透明层(120)与主体(110)分离地附接。微腔(111)具有0. 3-3mm(Lin)的宽度以及0. 5-5mm(Din)的深度。本发明的微腔板 (100)可以具有数量巨大的微腔，意味着可以对大量样本进行同时分析。另外，深度(Dm) 非常浅，意味着其可以具有很高的热导率，减少了分析时间而增大了分析精度。事实上，可以在标准的80x125mm板的主体(110)上形成24，576个宽度(Lm)为 0. 3-2. 25mm的微腔(111)，这适用于0. 1_5 y m微样本的反应。因此，本发明的微腔板(100) 的特征在于，用少量的反应溶液进行大量基因的同时量化分析。图3是例示本发明的微腔板(100)的另一示例的截面图。在图3(a)所示的微腔 板(100)中，主体(110)和透明层(120)是一体的，省略了形成分离的透明层(120)的处理。 尽管透明层(120)和主体(110)是一体的，但是透明层(120)必须被适当地形成以便进行
光学测量。在图3(b)中，在主体(110)的形成有光学测量部分(113)的一侧上形成了台阶结 构，而透明层(120)形成在该台阶区域上。在生成透明层(120)的过程中，需要注意不要生 成突起。本发明的微腔板(100)的微腔(111)除了以上图中提出的圆形形状之外，还可以 具有不同类型的截面形状，如方形、多边形等，而且宽度(Lm)也可以做大小修改。可以通过不同方法将包含样本的公共试剂加载到之上形成了注入层(130)的微 腔板(100)的微腔(111)中。首先，将微腔板(100)自身放置在填充有包含要加载样本的公共试剂的容器中。第二，本发明的微腔板(100)在上部通过主体(110)的入口部分(112)区域的突 起而具有开放空间(114)，并且还生成了样本供应层(140)。因此，包含样本的公共试剂被 直接提供到该开放空间(114)中。第三，如图4和图5所示，该微腔板在一侧具有借以提供包含样本的公共试剂的供 应部分(141)，并且形成了样本供应层(140)以遮挡该开放空间(114)。因此，在形成样本 供应层(140)之后，通过供应部分(141)将包含样本的公共试剂加载到注入层(130)的上 部中并递送到每个微腔(111)中。第四，如图6所示，样本供应层(140)是按照以上第三实例中所述那样形成的，但供应部分(141)位于主体(110)的一侧。在额外形成了样本供应层(140)的情况下，可以保护包含样本的公共试剂，并且 可以精确地调节供应量，从而实现了保护注入层(130)的效果。样本供应层(140)由不排出包含样本的公共试剂但排出内部生成的气体的材料 制成，这样，样本供应层就起到了防止从微腔(111)排出包含样本的公共试剂而是排出残 留气泡的作用。如果微腔(111)中残留了气泡，则光由于残留气泡而色散，导致光学测量的准确 度下降。本发明的微腔板(100)被设计为将残留气泡从微腔(111)中排出，从而有利于克 服常规问题。微腔板(100)不仅可以被用于实时PCR而且可以用于恒温酶反应或LCR(聚合酶 链反应)。通过改动微腔板中加载的特定成分(A)，其应用可以被扩展。图7例示了本发明的微腔板(100)的另一示例。微腔(111)在必要时可以被运输， 其可以额外地具有用以保护透明层(120)的第一保护部分(150)和用以保护注入层(130) 的第二保护部分(160)。如果有必要，第一保护部分(150)和第二保护部分(160)可以有多个。在额外形 成了样本供应层(140)的情况下，第二保护部分(160)形成在注入层(130)或样本供应层 (140)的上部。第一保护部分(150)由可分离的粘性膜或可附接的材料制成以便进行光学测量。 第二保护部分(160)可以由粘性膜制成以防止内部溶液的排出以及防止污染。作为保护 膜，优选地使用具有适当强度以保护基底膜不被损坏，且易于分离而不会损坏基底膜，并且 分离时不留下杂质的粘性膜。板的盖子可以使用可附接材料。图8-图11例示了本发明的多微腔板(100)的示例。这些多微腔板包括在本发明 的微腔板的范围内。为了更好地理解，当一个单位微腔板(100)被复数地形成并组合到一 起时，其被称为多微腔板(100')，用附图标记100'来表示。如图8和图9所示，本发明的多微腔板(100')由多个微腔板(100)组成，每一个 微腔板(100)都包括主体(110)，具有均包括光学测量部分(113)、入口部分(112)的多个 微腔(111)；形成在主体(120)的每一侧的透明层(120)；以及注入层(130)。由多个微腔板(100)组成的多微腔板(100')也具有与微腔板(100)相同的特 性，在下文中参照附图进行说明。如图8和图9所示，多微腔板(100')配备有用于将相邻的微腔板(100)连接到 主体(110)上形成有注入层(130)之处的主体连接部分(170)。在此，透明层(120)和主 体(110)是一体的。主体连接部分(170)的形状并不受限制，能将主体连接部分(170)连 接到相邻微腔板(100)即可。多微腔板(100')是通过集成多个微腔板(100)而制成的。也就是说，微腔板 (100)是作为一个单位而起作用的。多微腔板(100')的每个微腔板都包含4-16个微腔 (111)，而多微腔板包含8-96个微腔板(100)。形成多微腔板(100')的每个微腔板(100)都包含特定成分(A)并通过注入层 (130)被提供了不同的公共试剂。优选地多微腔板(100')的每个微腔板(100)都通过入 口部分(112)区域的突起在上部具有开放空间(114)。因此，包含样本的公共试剂被直接提供到形成在注入层(130)的上部的开放空间(114)中。为了形成开放空间(114)，如图8和图9所示，可以生成突起到主体(110)的入口 部分(112)的顶部的分隔壁部分(115)。图8和图9例示了在其微腔板(100)中加载了相同的特定成分㈧的微腔(111) 的示例，其中分隔壁部分(115)和主体(110)是一体的。可以配备一个分隔壁部分(115) 来划分微腔板(100)，其可以是多种形式，只要它能够形成开放空间以便将试剂注入到每个 微腔板(100)中即可。S卩，本发明的多微腔板(100')具有这样的优点通过在主体(100)的微腔(111) 中加载特定成分(A)而此时每个微腔板(100)被加载了不同的特定成分(A)，可以同时分析 不同的样本。如图10所示，本发明的多微腔板(100')由侧面开放的主体(110)中包含特定成 分(A)的多个微腔(111)组成。透明层(120)形成在一侧，注入层(130)形成在另一侧。本发明的微腔板(100)通过主体(110)的入口部分(112)区域的突起而在上部中 具有开放空间(114)，并且额外生成了样本供应层(140)以遮挡开放空间(114)。因此，公 共试剂被直接提供到开放空间(114)中。在样本供应层(140)中，可以形成供应部分(141)来提供样本。可以通过使主体 连接部分(170)的一侧突起来生成开放空间(114)。图10例示了保护透明层(120)的第一保护部分(150)和保护样本供应层(140) 的第二保护部分(160)的生成。图8-图10例示了成行连接的微腔板(100)的示例。如图11所示，本发明的多微 腔板(100')可以具有成行连接的多个微腔板(100)。多微腔板(100')通过可借以加载不同试剂的主体(110)的入口部分(112)区域 的突起而在该入口部分的顶部具有开放空间(114)，并且其特征在于，通过直接将公共试剂 或样本注入到形成在入口部分(130)的顶部的开放空间(114)中而最终将样本递送到微腔 (111)中，能够一次分析多种样本。本发明的用于实时PCR的分析系统(1000)的特征在于，使用具有上述特征的微腔 板(100)。图12是例示了本发明的用于实时PCR的分析系统(1000)的图。如图12所示，用 于实时PCR的分析系统(1000)配备了压力调节装置(200)或旋转装置(400)，并且还可以 配备温度调节装置(300)或光学测量装置(500)。图13是例示了本发明的微腔板(100)的制造方法的流程图。本发明的微腔板 (100)的制造方法由以下步骤组成:a)制备主体(110) (Sa) ；b)形成透明层(120) (Sb) ；c) 分配特定成分(A) (Sc)；以及d)形成注入层(130) (Sd)。在步骤a)制备主体(110) (Sa)中，在一侧形成用于进行光学测量的光学测量部分 (113)，在另一侧生成用于样本注入的入口部分(112)，而且还在主体(110)上形成被多个 开放空间划分开的微腔(111)。在步骤b)中，形成了遮挡主体(110)的光学测量部分(113)区域的透明层(120)。 根据制备条件，主体(110)制备步骤(Sa)和透明层(120)形成步骤(Sb)可以统一且作为 一个程序来执行。
在步骤c)分配特定成分(A) (Sc)中，将特定成分(A)加载到一侧被透明层(120) 密封的微腔(111)中。此处的特定成分(A)除了引物或探针以外还可以包括核酸放大酶、 dNTP、缓冲剂或稳定剂。在步骤d) (Sd)中，形成注入层(130)以遮挡包含特定成分(A)的微腔(111)的入 口部分(112)。在此，为了防止特定材料之间的交叉污染，形成注入层(130)以遮挡入口部 分(112)，从而防止内部材料排出。此时，使用多孔材料或可打孔材料将包含样本的公共试 剂一次提供到微腔(111)中。如图14所示，本发明的微腔板(100)的制造方法还可以在形成注入层(130) (Sd) 的步骤之后包括步骤e)形成保护注入层(130)的第一保护部分(150)或保护透明层(120) 的第二保护部分(160) (Se)。本发明的微腔板(100)的制造方法可以增大分析效率，因为得益于形成在板上的 注入层(130)，它不需要诸如纳米喷射分配器这样的用于分配的特殊设备，并且该制造方法 有助于快速生产这种用于分析的微腔板(100)，因为它可以提供公共成分而没有交叉污染。 在额外地配备了压力调节装置(200)或旋转装置(400)的情况下，本发明的方法还可以缩 短微腔板(100)的生产时间。图15是例示了使用本发明的微腔板(100)的分析方法的流程图。使用如上文描 述的本发明的微腔板(100)的该分析方法使用微腔板(100)，并且特征在于包括以下步骤 i)通过注入层(130)将包含样本的公共试剂注入到微腔(111)中(Si)；以及ii)使包含样 本的公共试剂与特定成分(A)发生反应(Sii)。在注入包含样本的公共试剂的步骤(Si)中，将包含样本的公共试剂注入到微腔 板(100)的微腔(111)中。如果必要，可以重复该注入包含样本的公共试剂的步骤(Si)。在注入包含样本的公共试剂的步骤(Si)中，优选地利用离心力在减小或增大的 压力下快速进行这种注入以使得包含样本的公共试剂被高效地加载到微腔(111)中。如果 注入层(130)在其顶部具有用来保护注入层(130)的第一保护部分(150)，则在消除第一保 护部分(150)之后进行通过注入层(130)注入包含样本的公共试剂的步骤。在使包含样本的公共试剂发生反应的步骤(Sii)中，包含样本的公共试剂与对应 的特定成分㈧发生反应。在该步骤(Sii)中，反应是通过从PCR(聚合酶链反应)、LCR(连 接酶链反应)以及RT-PCR(实时聚合酶链反应)中选择的方法来诱导的。不同于通常的PCR，实时PCR需要在放大过程的每个循环中进行光学测量处理。因此，如果使用本发明的微腔板(100)的样本分析是用实时PCR进行的，则在每个 循环中光学测量(荧光测定)都是必需的，这意味着可能要增加适用于每个反应的额外步 马聚o如图16所示，当完成注入包含样本的公共试剂时，使用本发明的微腔板(100)的 样本分析方法可以额外地包括步骤iii)根据注入层的材料来密封注入层(130)的上部 (Siii)0在密封注入层(130)的步骤(Siii)中，在注入了包含样本的公共试剂之后，对注 入层(130)的上部进行密封。当完成注入包含样本的公共试剂时，用粘性膜、水基包皮形成 成分、油或在室温下为固体的固体成分来密封注入层(130)，以保持微腔的内部状态(诸如 引物或探针、特定成分和包含样本的公共试剂的混合物的条件或状态)。
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如图17所示，根据使用本发明的微腔板(100)的分析方法，如果在注入包含样本 的公共试剂的过程中，微腔(111)中残留气泡而未被排出，则残留气泡在光学测量过程中 会使光发生散射，从而降低分析准确度。因此，当携带公共试剂的多个样本被依次注入时 (Si)，该分析方法可以额外地包括每次完成注入每个样本时调节微腔板(100)的压力的步 骤(Siv)。在调节压力的步骤(Siv)中，进行减压-解除或加压以排出微腔(111)中残留的 气泡，如果必要可以重复该步骤。在此，压力解除或加压包括减压_解除、加压、减压_解除_加压的全部处理。本领域技术人员将理解以上描述中公开的概念和具体实施方式
可以被容易地利 用作为修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他实施方式的基础。本领域技术人员还 将理解这种等同的实施方式并不背离所附权利要求书中阐述的本发明的实质和范围。
权利要求
一种微腔板，该微腔板包括主体(110)，其具有位于一侧的可实现光学测量的光学测量部分(113)和位于另一侧的用于样本注入的入口部分(112)，并且容纳了通过多个开放空间彼此隔开的微腔(111)；透明层(120)，其用于密封位于所述主体(110)的一侧的所述光学测量部分(113)；以及注入层(130)，其被设计为遮挡位于所述主体(110)的另一侧的所述入口部分(112)而将包含样本的公共试剂加载到所述微腔板(111)中。
2.根据权利要求1所述的微腔板，其中，在形成所述注入层(130)之前，所述微腔 (111)加载了包含用于核酸分析的引物或探针的特定成分(A)。
3.根据权利要求1所述的微腔板，其中，当完成注入包含样本的公共试剂时，用粘性 膜、水基包皮形成成分、油或在常温下为固体的固体成分来密封所述注入层(130)。
4.根据权利要求2所述的微腔板，其中，所述微腔(111)还被加载了核酸放大酶、dNTP 或缓冲剂。
5.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述注入层(130)由可打孔膜制成，并且所述 注入层(130)被打孔以与所述微腔(111)相连接。
6.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述注入层(130)由多孔材料制成。
7.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述透明层(120)由在0°C 100°C温度下不 变形的材料制成。
8.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)通过所述主体(110)上的 所述入口部分(112)区域的突起而在上部包含开放空间(114)，并且公共试剂或样本被直 接加载到形成在所述注入层(130)顶部上的所述开放空间(114)中以被递送到所述微腔 (111)中。
9.根据权利要求8所述的微腔板，其中，在板的一侧形成有供应部分(141)用于引入 包含样本的公共试剂，并且还形成有样本供应层(140)以便排出气体和遮挡所述开放空间 (114)。
10.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)被浸泡在填充有包含样本 的公共试剂的分离容器中以使所述包含样本的公共试剂被加载到所述微腔(111)中。
11.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔(111)的宽度(L111)是0.3 3mm。
12.根据权利要求11所述的微腔板，其中，所述微腔(111)的深度(D111)是0.5 5mm。
13.根据权利要求3所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)还包含用于保护所述透明 层(120)的第一保护部分(150)或用于保护所述注入层(130)的第二保护部分(160)。
14.根据权利要求13所述的微腔板，其中，所述第一保护部分(150)或所述第二保护部 分(160)由可分离的粘性膜或可附接的材料构成。
15.根据权利要求1至14中任意一项所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)由作为一 个单元的多个微腔板构成。
16.一种微腔板(100)的制造方法，该制造方法包括以下步骤a)制备主体(110)，该主体具有形成在一侧的用于光学测量的光学测量部分(113)和 形成在另一侧的用于样本注入的入口部分(112)以及通过多个开放空间彼此区分开的微 腔(111) (Sa)；b)在所述主体(110)上的所述光学测量部分(130)上形成透明层(120)(Sb)；c)通过所述主体(110)上的所述入口部分(112)来分配特定成分(A)以将不同的特定 成分(A)加载到所述微腔板(100)中(Sc)；以及d)在所述微腔板(100)的另一侧形成注入层(130)(Sd)。
17.一种使用权利要求1所述的微腔板(100)来分析样本的方法，该包括以下步骤 i)通过所述微腔板(100)的所述注入层(130)向所述微腔(111)中注入包含样本的公共试剂(Si)；以及 )使所述包含样本的公共试剂与所述特定成分(A)发生反应(Sii)。
18.根据权利要求17所述的使用所述微腔板(100)来分析样本的方法，其中，所述方法 还包括以下步骤iii)在完成注入包含样本的公共试剂之后密封所述注入层(130)的上部 (Siii) ο
19.根据权利要求17所述的使用所述微腔板(100)来分析样本的方法，其中，注入包含 样本的公共试剂的步骤(Si)是在离心力的作用下以及在减小或增大的压力下进行的以便 有效地将所述包含样本的公共试剂注入到所述微腔(111)中。
20.根据权利要求17或18所述的使用所述微腔板(100)来分析样本的方法，其中，所 述方法还包括以下步骤iv)如果多个样本被依次注入，则在每次注入之间调节所述微腔 板(100)的压力(Siv)。
21.根据权利要求20所述的使用所述微腔板(100)来分析样本的方法，其中，调节所述 微腔板(100)的压力的步骤包括减压-解除或加压处理以排出所述微腔(111)中残留的 气泡。
全文摘要
本发明涉及微腔板及其制造方法，更具体地涉及一种便于实时测量和分析从包含引物或探针的多个反应溶液(选择性地绑定到每个对应的基因)的反应获得的荧光以便分析包含多个基因的生物样本而不会交叉污染的微腔板及其制造方法。
文档编号G01N33/48GK101878427SQ200880118304
公开日2010年11月3日 申请日期2008年9月22日 优先权日2007年11月30日
发明者宋邱永, 朴翰浯 申请人:株式会社百奥尼