专利名称：抗人淀粉样蛋白单克隆抗体重轻链可变区基因及其应用的制作方法
技术领域：
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本发明涉及抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，具体涉及寡聚体高 亲和性抗人Af3单克隆抗体A8的重链和轻链可变区基因编码的多肽。本发明还涉及所述 基因和多肽在制备诊断试剂和药物的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)患者脑内产生P-淀粉样斑块沉积是此病的典型病变。
针对淀粉样蛋白(AP)分子的免疫疗法来治疗或预防阿尔茨海默病，是治疗的一个重 要途径。目的'已有人进行了一些工作，取得了不同程度的疗效。但目前还不能特异性识别 A卩寡聚体，因此免疫效果不理想，需要有特异性识别和结合A(3寡聚体的单克隆抗体。
而发现高亲和性，特异性好的单克隆抗体基因，是进一歩研制Ap寡聚体的单克隆抗 体的关键。
已知可溶性apl42寡聚体是最主要的阿尔茨海默病早期致病因子，对神经元的毒性最
强。关于诊断和治疗用途的针对16.5-25KDAPm2寡聚体単抗，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供抗人AP单克隆抗体基因及其编码的多肽，所述基因具有特异性 识别和结合A(3寡聚体的抗体活性片段，用于制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物。
本发明应用5'RACE技术通过基因特异引物和锚定引物成功的从培养的寡聚体高亲 和性单抗A8杂交瘤细胞中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基 因可以正确编码小鼠抗体可变区。所述轻链、重链可变区基因及其编码的多肽可用于制备 抗人淀粉样蛋白单克隆抗体。
基于上述已经克隆到的A8抗体轻链、重链可变区基因，采用基因重组的方法，构建 和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体，以期用于阿尔茨海默病的诊断和治疗目的。
本发明内容详述如下
本发明制备了寡聚体高亲和性抗人A(3m2単克隆抗体，取名为A8。由北京交通大学 生命科学与生物工程研究院建立和保存。本发明人发现了抗A(5寡聚体的单克隆抗体A8 重链和轻链可变区基因，重组后可表达出特异性识别和结合AP寡聚体的抗体活性片段。
单抗A8可以特异性识别表观分子量为16.5-25KD的ApM2寡聚体和快速老化痴呆模 型小鼠(Senescence Accelerated Mouse, SAM)脑组织的A卩寡聚体。A8对A卩i-42寡聚体 的结合能力高于单体、APw、 A(3w2、和A(3w8A(3。其亚类为IgG3，抗原识别位点在A卩 多肽N端l-6位氨基酸，用于ELISA、蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1:106、 1:4,000。 Morris水迷宫结果提示，腹腔注射A8可以改善SAMP8的学习记忆能力。
本发明人使用5' RACE的方法克隆到AP寡聚体高亲和性单抗A8轻链、重链可变区 基因。根据抗体恒定区CH-1区的最保守的一段序列设计引物，进行反转录，在cDNA产 物的5'端加上Poly(C)尾巴，然后使用针对多聚脱氧核苷酸尾巴设计的锚定引物与基因特 异性引物通过PCR方法将目的基因扩增出来。序列分析表明，A8抗体轻链和重链可变区 序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达卯％与92%。可以确定所得到的序列为 抗体轻链和重链可变区序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小 鼠抗体可变区。
A8重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性寡聚体高亲和性抗AP单抗 的杂交瘤细胞株中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为450bp，所述的轻链可变区 基因全长为429bp，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合A(3寡聚体的抗体活性 片段。
所述抗人A卩k单克隆抗体A8的重链与轻链可变区如SEQ ID NO:l SEQ ID NO:4 所示。其中
SEQ ID NO:l是抗人ApM2单克隆抗体重链可变区DNA序列； SEQ ID NO:2是抗人ApM2单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。 SEQIDNO:3是抗人A(3m2单克隆抗体轻链可变区DNA序列； SEQ ID NO:4是抗人A(3M2单克隆抗体轻链可变区氨基酸序
抗A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的克隆。
分泌产生上述抗阿尔茨海默病单克隆抗体的细胞株为北京交通大学生命科学与生物 工程研究院采用传统的骨髓瘤与脾细胞融合的方法获得的一株A(3寡聚体高亲和性的鼠源性抗人AP单抗杂交瘤细胞株，命名为A8，其抗原为A(M-42聚集物，其分泌的抗体分子 亚型为IgG3。
所述A8杂交瘤细胞己经在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。
本发明在制备抗人AP单克隆抗体及其性质和功能鉴定中进行了如下实验
1、 抗原制备及抗体性质的鉴定
A卩寡聚混合物(即本发明所用的免疫抗原)的制备(见实施例1， "1.A(3寡聚混合物 的制备")。其亚类为IgG3，抗原识别表位在AP多肽N端l-6位氨基酸。
可溶性A卩m2寡聚体是最主要的AD早期致病因子，对神经元的毒性最强。目前，关 于诊断和治疗用途的针对16.5-25KDAPm2寡聚体単抗，目前尚未见报道。
2、 间接ELISA实验
结果表明A8可以很好识别以碱性包被液包被于96孔板的AP寡聚混合物。最低检 测限为0.625吗/ml (见实施例2)。 用于ELISA的最佳稀释度为1:106。
3、 免疫印迹(Western blot)实验
结果表明A8可以很好识别以SDS-PAGE分离，转移在硝酸纤维素膜的Ap寡聚混 合物，主要识别16.5-25KD的寡聚物(见实施例3)。 用于蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1:4,000。
4、 免疫组化实验
单抗A8可以特异性识别快速老化痴呆模型小鼠(Senescence Accelerated Mouse P8， SAMP8)脑组织的A卩寡聚体。结果显示染色清晰，定位准确，基本没有背景干扰。在 进行免疫组化过程中，无须抗原修复(见实施例4)。
5、 Morris水迷宫检测
结果显示A8可以改善SAMP8的学习记忆能力(见实施例5)。
6、 单抗A8可变区基因的克隆
利用5'RACE的方法扩增抗A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因(见实施例6)。
用本发明获得的抗人Af3单克隆抗体，利用双抗体夹心ELISA法(酶联免疫吸附试验)、 Western blot实验、免疫组化等实验方法，可以分别制备三种不同方法的检测阿尔茨海默 病的试剂。基于上述已克隆到的抗人AP寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因，可以采用基因工程 方法，构建和/或表达多种小分子基因工程抗体的载体、细胞株和抗体，如单链抗体、嵌 合抗体、Fab抗体等，以便用于AD诊断、预防和治疗的基础与临床研究和应用。因此， 所述抗人A(3单克隆抗体还可以制备成为药物，用于诊断、预防和治疗阿尔茨海默病。
所述的基因核酸序列克隆至相应的表达载体，转染/转化相应的受体细胞(包括细菌、 哺乳动物细胞以及酵母等)，得到高表达所述抗体分子的细胞株。
此外，本发明的抗人A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因还有如下用途
构建基因工程单克隆抗体表达体系将所述的抗人AP寡聚体单抗A8轻、重链可变区 基因的核苷酸序列克隆至相应的表达载体，转染/转化相应的受体细胞(包括细菌、哺乳 动物细胞以及酵母等)，可以得到高表达所述抗体分子的细胞株。
表达后所获得的蛋白产物晶体用于新药开发研究将所述的抗人AP寡聚体单抗A8 轻、重链可变区基因在不同表达体系进行表达，所获得的蛋白或多肽产物纯化后，可制成 晶体。该晶体在新药的研究开发中，可作为药物靶点，用于新药的结构设计。
注本申请文件中所述的抗人A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因，均表示SEQID NO:l禾口/或SEQ IDNO:2;所述由这两个基因编码的多肽，均表示SEQ IDNO:3禾口/或SEQ ID NO:4序列的多肽。
本发明的优点
首先，本发明用于免疫的抗原为APm2寡聚体混合物，免疫效果好，小鼠免疫血清效 价高。这一点优于常用的"多肽偶联载体蛋白方法"。
其次，提供的抗阿尔茨海默病单克隆抗体A8特异性识别16.5-22KD的A(3寡聚体， 具有AD早期诊断的应用前景。由于A8特异性识别可溶性A卩寡聚体，在免疫治疗实验 中，有可能避免与纤维结合，从而降低脑出血等副反应。
图1为抗AP寡聚体单抗A8纯化后的重、轻链。图中1为蛋白质分子量标记(Marker)， 2为单抗A8的重链和轻链。
图2为单抗A8的检测灵敏度。
图3为单抗A8和商品化单抗6E10对A P寡聚体识别的差异。1:蛋白质分子量Marker; 2:检测抗体为A8; 3:检测抗体为6E10。图4为单抗A8特异性识别快速老化痴呆模型小鼠大脑皮层及海马区AP的情况。
图5为Morris水迷宫检测结果，图中，横坐标为治疗后的时间(第1， 2， 3， 4， 5 天)，纵坐标为各组找到平台小鼠的数目(单位只)。
图6为RT-PCR扩增的抗AP寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图， 图中M为DL-2000DNA分子量Marker, 1为A8重链可变区基因，2为A8轻链可变区基 因。
生物材料保藏信息
培养物名称杂交瘤细胞株A8 保藏编号 CCTCC一C200926
保藏单位中国典型培养物保藏中心
保藏时间2009年4月15日
具体实施例方式
实施例1寡聚体高亲和性抗人AP单克隆抗体A8的制备
1. A(3寡聚混合物的制备
A卩M2肽由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。参照文献(Lambert M, 1998)
方法，并且进行必要的调整，将其在近似天然的条件下体外组装得到A(3,-42寡聚混合物。
先将ApM2肽lmg溶于冰预冷的六氟异丙醇(l，U3,3,3-hexafluoro-2-propannol, HFIP) (Sigma),使AI3M2肽单体化，室温，lh后使HFIP挥发殆尽。然后用无水二甲基亚砜 (DMSO) (Sigma) 20^1溶解Ap 1-42单体，最后将其置于F12培养基(Sigma)或磷酸盐
缓冲体系(体积相应补足lml)、置4。C， 24 h，使其自然聚合，用Western blot检测A卩M2
寡聚混合物的制备情况。
2. 小鼠的免疫接种
取6-8周龄雌性BALB/c小鼠5只。分别用A(3寡聚混合物共进行4次免疫首次按 50吗/只剂量将AP寡聚混合物与等体积福氏完全佐剂(Sigma)混匀后，腹腔注射。间隔 2周后重复注射，使用福氏不完全佐剂(Sigma)，偶联多肽剂量为30pg/只。间隔2周后 重复一次；再间隔两周，用纯抗原50吗进行脾内加强免疫，3-4d后取脾融合。
3. 饲养细胞的制备取6-8周龄BALB/c小鼠，引颈处死，无菌条件下RPMI 1640 培养液(Sigma)冲洗腹腔数次，将冲洗液2000rpm，离心10min。弃上清，用含20%小 牛血清的RPMI 1640培养液悬浮沉淀，细胞计数，调整细胞浓度为1()S个/ml，加入96孔板中，100-孔，置于37'C， 5%(202培养箱中孵育。
4. 细胞融合取强化免疫3-4d的小鼠，眼球放血后，收集血清，拉颈处死，无菌取出 脾脏，制成单细胞悬液后，按10:1的比例将脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞(经 8-氮鸟嘌呤，即8-Azaguanine，简称8-AG筛选)混合，1000rpm离心10min，弃上清，轻 弹管底使沉淀细胞呈糊状，37。C水浴中加入0.7ml 50% PEG 4000 (polyethylene glycol, Sigma)，边加边旋转离心管，使细胞保持混匀状态，lmin加完，37。C水浴中静置90s,立 即缓慢加入20ml RPMI 1640液，800rpm离心8min，弃上清，加入含20%小牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司)、2%HAT (Sigma)、 1%青链霉素(Sigma)的1640培养 液，轻轻混匀，调整细胞浓度为2xl(^个/ml，加入已备有词养细胞的96孔板中，10(^1/ 孔，置于37'C， 5%<:02培养箱中孵育，逐日观察细胞生长情况，1周后补加含20%小牛 血清、1%HT (Sigma)、 1%青链霉素的RPMI 1640培养液，按下列公式计算克隆生长率。
克隆生长率(％)=(细胞克隆生长孔/接种孔)xl00%
5. 阳性克隆的筛选及亚克隆
待细胞克隆长至视野的1/3时(显微镜放大倍数4X10)，小心吸取细胞上清液，10 y g ml"A(3寡聚混合物为包被抗原，ELISA方法检测上清中的抗体，具体方法及判断标 准见"4.细胞融合"，按下列公式计算克隆阳性率。
克隆阳性率(％)=(抗体阳性孔/检测的细胞克隆生长孔)X100% 采用有限稀释法对抗体分泌阳性的孔进行反复克隆化，至所有单克隆孔上清抗体阳性 率为100%。
6. 杂交瘤细胞株的建立
将克隆化的阳性克隆移入24孔板、6孔板和T25细胞培养瓶，扩大培养60-90d并建株。
7. 单克隆抗体的亚类鉴定
按照Sigma公司的小鼠IgG亚类鉴定试剂盒(Sigma)操作杂交瘤细胞株分泌单抗A8 的IgG亚类为IgG3。
8. 单克隆抗体的表位分析
使用竞争ELISA法测定单克隆抗体的抗原识别表位将单克隆抗体与浓度梯度的各 个肽段(Apl-6， A(31-11， Apl2-28)孵育lh后加入到包被有A卩寡聚体的酶标板上进行 间接ELISA检测。结果表明其表位为N端多肽Api-6。
9. 单抗的大量制备及纯化接种杂交瘤细胞至降植垸(Sigma)预处理的BABL/c小鼠腹腔，^107个杂交瘤细胞 /只，7-10天后抽取腹水，使用AKTA explore100蛋白层析系统通过Protein A亲和层析柱 纯化单克隆抗体，见图1 。用BCA试剂盒(美国PIERCE公司)测定抗体浓度，为3mg/ml。
实施例2间接ELISA实验
1. 方法
(1) 包被10iig'ml"Ap寡聚混合物为包被抗原，加入酶标板(SUNRISE公司)中， 每孔100yl， 4"过夜。
(2) PBS-T (NaC18g， KC1 0.2g， Na2HP04. 1.44g， KH2P04. 0.44g， Tween-20 0.05ml， 补ddH20至1L， pH7.2 7.4)洗板3次，每次5min。
(3) 封闭加含0.2。/oBSA的PBS-T，每孑Ll00ul。 37°C， 2h。
(4) 将倍比稀释的单抗A8，加入96孔板中，每孔100ul。 37°C， 2h。同时设空白对 照、阴性对照和阳性对照(分别用小鼠抗人A(3血清、Calbiochem公司的抗人Apl-17)。
(5) PBS-T洗板3次，每次5min。
(6) 加1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司)，每 孔100 yl。 37°C， lh。
(7) PBS-T洗板3次，每次5min。
(8) 加底物TMB，每孔100 u 1， 20 min后，450nm波长检测爿值。 阳性判断标准如下
(样品孔J值-空白对照^值)/ (阴性对照孔^值-空白对照^值)》2 检测的最大稀释度为该抗体的效价。
2. 结果与结论
应用我们制备的单抗A8能够识别包被的A卩寡聚混合物。最低检测限为0.625 pg/ml。 见图2。
上述结果说明单抗A8能够有效识别体外组装的A(3寡聚混合物，其反应灵敏度较好。
实施例3 免疫印迹(Western blot)实验
1.方法
取50 100略样品，5x样品缓冲液，混匀后上样，先以100V电压使蛋白通过浓縮胶。当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，结束电 泳，取下凝胶，常规用考马斯亮蓝R-250染色法染色；将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装 有印迹缓冲液的容器里平衡10min，依次在放入滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，成"三明治" 状，倒入转膜缓冲液，胶面朝负极，NC膜面朝向正极，小心避免并赶去气泡。接通电源， 使恒流80mA连续转移2h，切断电源。
转膜结束后，用丽春红S染色液(10X丽春红S贮存液配制方法为称取丽春红S2g， 三氯乙酸30g,璜基水杨酸30g,加水至100ml;用时按照1: 10的比例用用去离子水稀 释)确定蛋白条带位置，做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜(称取脱脂奶粉5g， 溶于0.1mol/L PBST (NaCl 8g， KC1 0.2g，Na2HPO4. 1.44g， KH2P04. 0.44g， Tween-20 0.05ml， 补ddH20至1L， pH7.2 7.4) 100ml)， 4。C封闭过夜。用封闭液液稀释单抗A8，浓度一 般为0.2,g/ml,于4。C孵育12 14 h，或于20 37。C孵育2 h。用O.lmol/L PBST洗涤硝 酸纤维素膜4次，每次5 10min。用PBS稀释HRP标记的二抗，稀释度为1: 1000，室 温孵育1 h。用O.lmol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5 min。按照P正RCE化学发 光试剂盒说明，将A液和B液等体积混合，加在硝酸纤维素膜上，2 5min后，用X光片 曝光显影，观察结果。用Quantity One software (BIO-RAD)软件进行条带半定量。
2.结果与结论
Western Blot结果，纯化的A8主要识别低分子量寡聚体(以识别寡聚混合物中16.5KD 左右成分)，此外与单体、高分子量寡聚体和原纤维又交叉反应。6E10对单体、低分子量 寡聚体、高分子量寡聚体和原纤维的识别没有差异。见图3。
上述结果说明，单抗A8对AP寡聚混合物中16.5KD左右成分反应最强，与6E10对 寡聚混合物的识别效果明显不同。单抗A8可以利用WestemBlot进行样本的Ap检测。
实施例4免疫组化实验 1.方法
(1) 脱蜡、水化。
(2) PBS洗两次各5分钟
(3) 用蒸馏水或PBS配置新鲜的3y。H202，室温封闭5 10分钟，蒸馏水洗3次。
(4) 抗原修复。
(5) PBS洗5分钟。
(6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。(7) 滴加单抗A8，室温1小时或者4'C过夜或者37t:i小时(4'C过夜后在37。C复温 45分钟)。
(8) PBS洗三次每次2分钟。
(9) 滴加生物素化二抗(山羊抗小鼠IgG)， 20。C 37。C20分钟。
(10) PBS洗3次每次2分钟。
(11) 滴加试剂SABC， 20'C 37'C20分钟。
(12) PBS洗4次每次5分钟。
(13) DAB显色DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
(14) 蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
(15) 脱水、透明、封片、镜检。 2.结果与结论
结果显示，皮质与海马区染色清晰，定位准确，背景较低。见图4。单抗A8可以作 为脑皮质与海马区AP检测的抗体。
实施例5 Morris水迷宫检测
1、 实验目的检测单抗A8对快速老化痴呆模型小鼠的治疗作用
2、 实验动物
实验动物SAMP8购自北京维通利华实验动物技术有限公司，委托北京大学医学部医 学实验动物中心饲养。分组情况如下
按照注射药物不同分为抗体A8治疗组、小鼠非特异性IgG注射组、生理盐水注射组、 SAMP8空白对照组，每组12只。
3、 实验方法
参照文献(Lee EB, 2006)的方法，以单抗A8腹腔注射8月龄雄性SAMP8小鼠(400吗/ 只)，每周1次，治疗8周以后，进行Morris水迷宫检测(在北京大学医学部医学实验动 物中心完成)。
Morris水迷宫检测步骤
(1) 设计特制的水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的平台组成。水池高 70cm，直径80cm，平台直径8cm，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。
(2) 预先在水池中注入清水，水深15cm，池壁及池底均为黑色，使池水变为不透明的 黑色，平台表面为黑色，使小鼠不能看到，水面高出平台表面0.5cm。(3) 水温控制在22i0.5T:，在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。每个 象限对应的侧壁上粘贴不同形状的标志。平台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保 持平台位置不变。
(4) 每次实验在隔音的房间内进行，水池，光源，鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。
(5) 治疗结束后第3天开始训练，如果动物在120s内找到平台，让其在平台上停留 20s，如果动物没有找到平台，将其放在平台上使其停留20s。
(6) 每次实验以120s为限，纪录每次各组动物能够到达平台的小鼠只数。若设定时间 内未找到平台，计算机停止跟踪，记录时间为120s。
(7) 于治疗结束后4、 5、 6、 7、 8天继续学习和测试，记录每组小鼠找到平台的情况。
4、 结果
A8治疗组学习记忆改善情况明显优于小鼠非特异性IgG注射组、生理盐水注射组、 SAMP8空白对照组。各组找到平台小鼠的数目情况，测试第1天至第5天分别为A8治 疗组(0、 2、 3、 4、 4只)；非特异性IgG注射组(1、 1、 0、 0、 0)、生理盐水注射组、 SAMP8空白对照组(0、 0、 1、 1、 0)见图5 (横坐标为治疗后的天数，纵坐标为各组找 到平台小鼠的数目)。
5、 结论
单抗A8有改善快速老化痴呆模型小鼠学习记忆能力的作用。 实施例6单抗A8可变区基因的克隆
取处于对数生长期的A8杂交瘤细胞(5xl06)，采用Trizol试剂法提取杂交瘤细胞株 A8的总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。利用 5'RACE的方法扩增抗A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因。分别跟据小鼠IgG轻链和 重链恒定区CH-1区基因序列设计基因特异性引物L-GSP1: ACTGGATGGTGGGAAGATGG禾B H-GSP1: CAGTGGATAGACCGATGGGGG。根据试齐U 盒说明书以总RNA为模板，分别以L-GSP1和H-GSP1为引物，使用SuperScripII反转录 酶合成cDNA第一链。反转录反应方案为总RNA5吗，GSP 100n mol/L，补加无Rnase 水至18nL， 70。C孵育10min后立即置冰浴上；继续向反应液中加入10xbuffer2.5pL， 25m mol/L MgCl2 2.5pL， 10m mol/L dNTP lpL， 42。C孵育lmin后加入l^L 200U/pL SuperScrip II 反转录酶，42。C反应50mm， 70。C孵育10 min。反转录完毕后加入RNase水解RNA，使 产物中只含有cDNA第一链。使用S.N.A.P离心柱纯化cDNA第一链，然后通过末端脱氧核苷酸转移酶TdT以dCTP为底物向cDNA第一链5'端加上Poly(C)尾巴。
分别用 以 AAP:GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 与 L-GSP2:GGGGAA GATGGATACAGTTGGTGCAGC 禾Q AAP 与 H-GSP2 GATAGCCGATGGGGGTGTTGTTT TGG两对引物以已经加上Poly(C)尾巴的cDNA第一 链为模板扩增抗体轻链和重链(VL、 VH)可变区基因。扩增产物VH (约450bp)和VL (约429bp)经琼脂糖凝胶(1.5%)电泳鉴定，见图6。用PCR产物纯化试剂盒(Omega) 回收纯化后，将目的片段克隆至T载体，测序分析(见序列表l-4)。
PCR扩增反应按照常规方法进行以上述产物为模板，分别用重链和轻链引物扩增抗 体轻、重链可变区基因。反应体系为cDNA5yL，上下游引物(10mmol/L)各1 y L， 10m mol/L dNTP 2 u L， 10 Xbuffer 5 U L，补加双蒸水至50 u L， Ex Taq DNA聚合酶1.25^1， 加水至50pd，混匀，瞬时离心后，置PCR仪内反应。PCR条件为95预变性5min，循 环参数为94变性40 s， 55退火40 s， 72延伸1 min，共30个循环，最后72延伸51 min。
目的片段T载体克隆测序方案如下将PCR产物以试剂盒(Omega)纯化回收后， 连入pMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体lpl， PCR产物纯化重链(或轻链) 4^1，连接缓冲液5pl，混匀后置4r过夜，转化大肠杆菌DH5a，筛选重组克隆并测序。
抗A(5寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因在制备用于诊断、预防和治疗AD的试剂(盒) 及药物中的应用
抗Ap寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因应用方面的研究主要有(1)建立可用于分 析AP寡聚体的夹心ELISA法；(2)AD的预防及早期治疗研究:用于低龄SAMP8或Tg2576 转基因鼠等AD动物模型，静脉、腹腔或颅内注射抗A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基 因相关的多肽或抗体，通过观察学习记忆行为学、组织病理学以及分子细胞生物学改变， 得到实验室数据；(3) AD的治疗研究用于高龄或老年SAMP8或Tg2576转基因鼠等 AD动物模型，静脉、腹腔或颅内注射抗A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多 肽或抗体，通过观察学习记忆行为学、组织病理学以及分子细胞生物学改变，得到实验室 数据；(4); A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体用于各期临床试验 研究；(5) A(3寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体应用的副作用及并发 症研究。(脑膜脑炎、出血)。
以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可以直接用于AD
的诊断及免疫治疗。
以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式(1)嵌合抗体是用鼠MAb的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗
体。由于其完整地保存了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故
在免疫治疗中显示出良好的效果。(2)人源化抗体针对可变区基因结构的人源化改造，
包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而 不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体 主要有由VH-CH1和VL-CH1组成的Fab抗体、用一条多肽(Gly4Ser) 3接头连接VH 基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH 或VL—个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价 微型抗体主要有双链抗体(ScFv) 2、 Flex微型抗体、LD微型抗体、F (ab，) 2、 F (ab，) 3、 (ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，在肾脏中的清除 率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体是一类具有双重特异性和 双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白把Fab或Fv等基因片段， 与非抗体的核酸或酶等其它生物功能分子连接形成的具有靶特定的生物活性重组蛋白。
(7)噬菌体抗体把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转 染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多 轮相关抗原的亲和吸附，从中筛选出所需的特异性抗体。
以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽，以及重构成一定形式的抗体，进 行各种酶、生物素、荧光(Cy3、 Cy5等)等标记。
在上述研究的基础上，利用合成或原核表达的A(3及寡聚化的A(3作为标准抗原样品， 建立夹心ELISA法分析最适的包被抗体及浓度，最适的生物素化的检测抗体(Ap寡聚体 特异性单克隆抗体)及浓度，同时以辣根过氧化物酶标记的亲和素和TMB为检测系统， 获得可溶性A(3寡聚体夹心ELISA分析方法，建立AD早期诊断方法的实验室标准。
以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子组装的AD以及AD 相关疾病诊断试剂盒。抗人淀粉样蛋白序列表.txt
〈110〉北京交通大学
<120>抗人淀粉样蛋白单克隆抗体重轻链可变区基因及其应用 <160〉 4
<170〉 Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1039 <212〉 DNA
<213〉 人(Homo sapiens) <400> 1
GGGCTCGTAG TGCAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCGACGATT TATGCGGCCG CATGGACAGG 60 CTTACTTCTT CATTCCTGCT GCTGATTGTC CCTGCATATG TCTTGTCCCA AGTTACTCTA 120 AAAGAGTCTG GCCCTGGGAT ATTGAAGCCC TCACAGACCC TCAGTCTGAC TTGTTCTTTC 180 TCTGGGTTTT CACTGAGCAC TTCTGGTATG GGTGTAGGCT GGATTCGTCA GCCTTCAGGG 240 AAGGGTCTGG AGTGGCTGGC ACACATTTGG TGGGATGATG ATAAGTACTA TAACCCATCC 300 CTGAAGAGCC GGCTCACAAT CTCCAAGGAT ACCTCCAGAA ACCAGGTATT CCTCAAGATC 360 ACCAGTGTGG ACACTGCAGA TACTGCCACT TACTACTGTG CTCGAAGGGG GATCTACTAT 420 GATTACGACA ACTTTAACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGCCAAA 480 ACAACACCCC CATCGGTCTA TCGGATCCCT CAATCTCTAG AGGATCCCCG GGTACCGAGC 540 TCGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT 600 CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC 660 TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC 720 CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT 780 TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 840 GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 900 ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTA嵐AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 960 TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAMATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 1020 CGAAACCCGA CAGGACTAT 1039
<210〉 2
〈211〉 346
<212> PRT
〈213〉 人(Horao sapiens) 〈400〉 2
Leu Ala Cys Leu Gin Val Asp Asp Leu Cys Gly
10 化 Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala
25 30 Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu
40 45 Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
55 60 Met Gly Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly 70 ' 75 80
Leu Ala His lie Ti'p Trp Asp Asp Asp Lys Tyr
90 95 Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser
' 105 110
Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
120 125 Ala Arg Arg Gly lie Tvr Tyr Asp Tyr Asp Asn
135 _ 140
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys 150' 155 160
Val Tyr Arg lie Pro Gin Ser Leu Glu Asp Pro
170 L75 Asn Ser End Ser Trp Ser End Leu Phe Pro Val
185 190 Leu Thr lie Pro His Asn lie Arg Ala Gly Ser
200 205 Trp Gly Ala End End Val Ser End Leu Thr Leu
215 220 Leu Pro Ala Phe Gin Ser Gly Asn Leu Ser Cys 230 235 240
GlyLeuValValGin
15
ArgMetAspArgLeu
20
TyrValLeuSerGin
35
LysProSerGinThr
50
LeuSerThrSerGly
65
LysGlyLeuGluTrp
85
丁yrAsnProSerLeu
100
ArgAsnGinValPhe
115
AlaThrTyrTyrCys
130
PheAsnTyrTrpGly
145
ThrThrProProSer
165
ArgValProSerSer
180
EndAsnCysTyrPro
1^5
lieLysCysLysAla
210
lieAlaLeuArgSer
225抗人淀粉样蛋白序列表.txt
GinLeuHisEndEndlieGly Gin ArgAlaGlyArgGlyGlyLeuArg
245250255
lieGlyArgSerSerAlaSer Ser LeuThrAspSerLeuArgSerVal
260265270
ValArgLeuArgArgAlaVal Ser AlaHisSerLysAlaVallieArg
275280285
LeuSerThrGluSerGlyAsp Asn AlaGlyLysAsnMetEndAla匕ys
290295300
GlyGinGinLysAlaArgAsn Arg LysLysAlaAlaLeuLeuAlaPhe
305310315320
PheHisArgLeuArgProPro Asp GluHisHislysAsnArgArgSer
325330335
SerGinArgTrpArgAsnPro Thr GlyLeu
340 345
〈210〉3
〈211〉1045
<212>腿
〈213〉人(Homo sapiens)
<400> 3
ATGAAAAACG
TTGCCTGTTA
ATGACCCAAA
AGATCTAGTC
AAACCAGGCC
CCAGACAGGT
GAGGCTGAGG
GGTGCTGGGA
CCCGAATTCT
CATAGCTGTT
GAAGCATAAA
TGCGCTCACT
GCCAACGCGC
ACTCGCTGCG
TACGGTTATC
AAAAGGCCAG
CTGACGAGCA
AAAGATACCA
TCAGTGCAAG GGCTGTTGGT CTCCACTCTC AGAGCATTGT AGTCTCCAAA TCAGTGGCAG ATCTGGGAAT CCAAGCTGGA AGAATCTCTA TCCTGTGTGA GTGTAAAGCC GCCCGCTTTC GGGGAGAGGC CTCGGTCGTT CACAGAATCA GAACCGTAAA TCACAAAAAT GGCGTTTCCC
CTTGCATGCC GCTGATGTTC CCTGCCTGTC ACATAGTAAT GCTCCTGATC TGGATCAGGG TTATTACTGC GCTGAAACGG GAGGATCCCC AATTGTTATC TGGGGTGCCT CAGTCGGGAA GGTTTGCGTA CGGCTGCGGC GGGGATAACG AAGGCCGCGT CGACGCTCAA CCTGG
TGCAGGTCGA TGGATTCCTG AGTCTTGGAG GGAAACACCT TACAAAGTTT ACAGATTTCA TTTCAAGGTT GCTGATGCTG GGGTACCGAG CGCTCACAAT AATGAGTGAG ACCTGTCGTG TTGGGCGCTC GAGCGGTATC CACGAAAGAA TGCTGGCGTT GTCAGAGGTG
CGATTAAGAA CTTCCAGCAG ATCAAGCCTC ATTTAGAATG CCAACCGATT CACTCAAGAT CACGTGTTCC CACCAACTGT CTCGAATTCG TCCACACAAC CTAACTCACA CCAGCTGCAT TTCCGCTTCC AGCTCACTCA CATGTGAGCA TTTCCATAGG GCGAAACCCG
GCTTATGAAG TGATGTTTTG CATTTCTTGC GTACCTGCAG TTCTGGGGTC CAGCAGAGTG GCTCACGTTC ATCCATCTTC TAATCATGGT ATACGAGCCG TTAATTGCGT TAATGAATCG TCGCTCACTG AAGGCGGTAA AAAGGCCAGC CTCCGCCCCC ACAGGACTAT
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
■
960
1020
1045
〈210〉 4
〈211〉 348
<212> PRT
〈213〉 人(Homo sapiens) 〈400〉 4
MetLysAsnValSerAlaSerLeuHisAlaCysArgSerThrlieLys
151015
LysLeuMetLys 20LeuProValArgLeu 25LeuValLeuMetPhe 30Trplie
ProAlaSer 35SerSerAspValLeu 40MetThrGinThrPro 45LeuSerLeu
ProVal 50SerLeuGlyAspGin 55AlaSerlieSerCysArgSerSerGin
SerlieValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGin
65707580
LysProGlyGinSer 85ProLysLeul>eulie 90Tyr匕ysValSerAsn 95Arg
PheSerGlyVal 100ProAspArgPheSer 105GlySerGlySerGly libThrAsp
PheThrLeu 115tyslieSerArgVal 120GluAlaGluAspLeu 125GlylieTyr
TyrCysPheGinGlySerArg 135ValProLeuThrPhe 140GlyAlaGlyThr
LysLeuGluLeuLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerliePhe
145150155160抗人淀粉样蛋白序列表.txt
ProGluPheEndAsn 165LeuEndArgliePro 170Gly丁yrArgAlaArg 175lie
ArgAsnHisGly 180HisSerCysPheLeu 185CysGluIleVallie 190ArgSer
GinPheHis 195ThrThrTyrGluPro 200GluAlaEndSerVal 205LysProGly
ValPro 210AsnGluEndAlaAsn 215SerHisEndLeuArg 220CysAlaHisCys
ProLeuSerSerArgGluThrCysArgAlaSerCyslieAsnGluSer
225230235240
AlaAsnAlaArgGly 245GluAlaValCysVal 250LeuGlyAlaLeuPro 255Leu
ProArgSerl>eu 260ThrArgCysAlaArg 265SerPheGlyCysGly 270GluArg
TyrGinLeu 275ThrGinArgArgEnd 280TyrGlyTyrProGin 285AsnGinGly
lieThr 290HisGluArgThrCysGluGinLysAlaSer 300LysArgProGly
ThrValLysArgProArgCysTrpArgPheSerlieGlySerAlaPro
305310315320
LeuThrSerlieThr 325LyslieAspAlaGin 330ValArgGlyGlyGlu 335Thr
ArgGinAspTyr 3^0LysAspThrArgArg 345PheProLeu
权利要求
1、SEQ ID NO1所示的DNA序列及其编码的多肽SEQ ID NO2。
2、 SEQ ID NO: 3所示的DNA序列及其编码的多肽SEQ ID NO: 4。
3、 权利要求1和/或权利要求2所述的基因及多肽在制备抗人淀粉样蛋白单克隆抗 体中的应用。
4、 权利要求1和/或权利要求2所述的基因及多肽在制备诊断阿尔茨海默病试剂和 治疗药物中的应用。
5、 权利要求1和/或权利要求2所述的基因在构建基因工程单克隆抗体表达体系中 的应用。
6、 权利要求1和/或权利要求2所述的基因表达后所获得的蛋白晶体在药物研究中的r^r m
全文摘要
本发明涉及抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其编码的多肽。本发明还涉及所述基因和多肽在制备诊断阿尔茨海默病试剂和药物的用途。本发明从培养的寡聚体高亲和性单抗A8杂交瘤细胞中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得基因可以正确编码小鼠抗体可变区。基于上述已经克隆到的A8抗体轻链、重链可变区基因，可采用基因重组的方法构建和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体，以期用于阿尔茨海默病的诊断和治疗。
文档编号G01N33/577GK101555477SQ20091008207
公开日2009年10月14日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者何金生, 莹 张, 涛 洪, 鑫 王 申请人:北京交通大学