专利名称：健脑补肾制剂的含量测定方法
技术领域：
本发明提供一种中药制剂的含量测定方法，尤其是健脑补肾制剂的含量 测定方法。
背景技术：
目前临床应用的健脑补肾中成药的剂型主要以口服液或者传统丸剂的形式
提供药用。己有的健脑补肾口服液(健脑补肾口服液为中药成方制剂第16册收 载，标准号WS3-B-2209-96)的质量标准中只是对人参药材进行了简单的鉴别， 这种鉴别也只是简单的定性制剂中是否含有人参，而含量多少则无法确定，除 此以外，没有对任何成分进行含量和限度测定。
健脑补肾制剂成分复杂，多达25味不同药材，有很多成分从本领域技术人 员公知的常识角度是可以检测的，例如，乙醇回流提取的5味药材中的人参可 以采用比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法法、GLC法测定人参皂苷或人参 皂苷元的含量；鹿茸可以采用紫外分光光度法测定鹿茸酸性多糖的含量，或者 采用高效液相色谱法测定碱基的含量；肉桂可以采用容量法及高效液相色谱法 测定其中的桂皮醛及肉桂酸的含量；砂仁采用气相色谱法测定挥发性成分的含 量，或者重量法测定挥发油的含量等等。
针对水提的20味药材的提取物，理论上可以检测的包括牛蒡子，采用用高 效液相色谱法或者TLCS法测定牛蒡甙及甙元含量；金银花采用高效液相色谱 法测定绿原酸、咖啡酸含量；连翘采用高效液相色谱法测定连翘甙和连翘脂素， 或者薄层扫描法测定齐墩果酸以及熊果酸；酸枣仁采用薄层层析法测定白桦脂酸的含量，或者采用紫外分光光度法测定酸枣皂甙的含量；当归采用高效液相 色谱法测定阿魏酸的含量；茯苓采用高效液相色谱法测定去氢茯苓多糖的含量， 或者比色法测定茯苳多糖的含量；白芍采用高效液相色谱法测定芍药苷含量；
白术采用gc法测定苍术酮、高效液相色谱法测定苍术醇苷m、 gc—ms法测
定苍术酮、脱水羟基苍术内酯、苍术内酯、羟基苍术内酯等等。
这些虽然都是本领域技术人员公知或者从现有文献中可以査阅到的，但是 在实际应用中确完全不同，并不是简单的理论套用就可以轻而易举的实现。有 些根本不用实验，采用现有的理论推理计算即可以被轻而易举的否定，例如川 牛膝药材中齐墩果酸、熊果酸，健脑补肾制剂中的川牛膝采用的水提取工艺， 而齐墩果酸和熊果酸均为脂溶性物质，水溶液中溶解度很低，在水提工艺中， 其转移率不足10%左右，再加上川牛膝药材中齐墩果酸和熊果酸本身含量就偏 低，只有不足0.1%，所以在健脑补肾制剂成品中含量极低几乎无法有效检测。 还有如连翘药材中连翘苷，在健脑补肾制剂中连翘药材所占处方量很小，药材 转移率即使按照100%折算，根据药典的方法，其取样量需要7g，这么大的取样 量，在实际操作中很难实现，因此测定该成分根本没有实际意义。
靳维荣、高国敬等人在2006年02期《时珍国医国药 >>中曾发表过采用高 效液相色谱(HPLC)法测定健脑补肾丸中绿原酸含量的方法，用以控制健脑补肾 丸的质量；本发明人重现了该方法，具体如下 测定方法采用高效液相色谱法
色谱条件色谱柱C18柱；检测波长327nm;流动相乙腈-0.4%磷酸
(13:87)。
对照品以及溶液的制备绿原酸购买自由中国药品生物制品检定所，纯度 为供含量测定用；取绿原酸对照品适量，用50%甲醇制成适当浓度对照品溶液。
供试品制备方法称取健脑补肾制剂适量，精密加入50y。甲醇50ml，称重， 超声处理30分钟，称重，用50%甲醇补足损失的量，过滤，进样测定。
结果绿原酸出峰时间较靠前，没有达到完全基线分离。调整流动相比例为乙腈-0.4%磷酸(10:90)，仍然没有改变出峰时间。
本领域技术人员公知用于含量测定的色谱峰如果出峰时间过早，势必会 造成其与溶剂峰重合从而无法准确量取色谱峰的峰面积，直接导致含量测定结
果不准确；虽然文献中声明该方法简便，快速准确，灵敏度高，适用于健脑补 肾丸的质量控制，但是本发明人在具体实施上述文献内容中发现色谱图中绿 原酸跟其他杂峰虽然到达了分离，但绿原酸峰拖尾严重无法实现自动积分，根 本不适用于含量测定，即使是对流动相进行很大的调整也无法改善脱尾，这也 从另一方面反应了该色谱条件的不成熟。另外，实验中还发现，绿原酸对照品 溶液在室温下1小时以后就开始分解导致含量下降明显，3小时后几乎下降50 %，即使是采用棕色瓶低温放置也很难避免对照品溶液的分解。由于测定中药 成分的色谱图保留时间相对较长，所以一般检测时间都很长，这种不稳定极不 利于含量测定的准确性，实际操作性差。
人参作为健脑补肾制剂中的君药，是该制剂进行含量控制的首选；本发明 人在实验中也试图对健脑补肾中的人参进行含量测定，并作了如下工作
测定方法采用高效液相色谱法
色谱条件色谱柱C18柱(150x4.6 mm， 5[xm);检测波长选择203nm 作为检测波长；流动相乙腈一0.1%磷酸(19 : 400)。
对照品以及溶液的制备人参皂苷Rgl购买自由中国药品生物制品检定所， 纯度为供含量测定用；取人参皂苷Rgl对照品适量，用甲醇制成适当浓度的对 照品溶液，
供试品溶液的制备
称取健脑补肾制剂内容物适量，研细，加甲醇适量，用索氏提取器回流提 取，提取液蒸干，残渣用20ml甲醇溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇 提取数次，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次10ml，弃去氨试液， 正丁醇液水浴蒸干，残渣作为供试品准备物；
实验方法l、将上述供试品准备物用3ml水溶解，通过大孔吸附树脂柱上，用水100ml冲洗，弃去水液，再用30。/。乙醇40ml冲洗，弃去30%乙醇洗脱液， 继用70%乙醇70ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5ml， 过0.45um微孔滤膜，20ul进样，结果人参皂苷Rgl跟其他杂峰得不到有效分离。
实验方法2、将上述供试品准备物用70%乙醇少量溶解，加在中性氧化铝-大孔吸附树脂柱(上层中性氧化铝为填料，下层为大孔吸附树脂填料)上，用 70W乙醇70ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至5ml，过 0.45um微孔滤膜，吸20ul进样，结果人参皂苷跟其他杂峰也得不到有效分离。
从上述实验的结果可以知道，采用普通的单泵的高效液相色谱仪器很难实 现对人参皂苷Rgl与其他成分的有效分离， 一般要求采用带有双泵或者四元泵 的仪器，通过梯度洗脱才能实现其与其他成分的有效分离，即使这样也无法准 确测定它的真实含量，分析原因人参皂苷Rgl紫外吸收在末端，响应值低，检 测灵敏度极低，数据不准确。
本发明人还对其他药材含有的测定成分进行了含量测定方法学考察，都或 多或少的存在问题，例如，肉桂药材中含有桂皮醛和肉桂酸2种可以测定的成 分，但是由于肉桂酸的含量偏低，即使是质量上好的肉桂药材中，其肉桂酸的 含量也不高于0.1%，通过制剂的各种提取手段后发现，其在制剂成品中含量极 低几乎无法有效检测；桂皮醛的色谱峰虽然与其他杂峰分离较好，但是由于采 用乙酸乙酯提取而无法直接进样(对色谱柱损害过大)，需要挥干乙酸乙酯；在 实验中发现，如果采用水浴挥干，在水浴蒸干过程中发现桂皮醛损失很大，如 果采用低温挥干，需要时间至少12小时，而且也有损失，这种需要长时间操作 的检测方法，不但不利于生产过程中的质量控制，测定的准确性也很差。本发 明人曾试图采用其他溶剂提取(如乙醇、甲醇等)，但是发现杂质干扰大，都无 法实现准确定量的测定。
山药药材中尿囊素在C18柱中的保留时间很短，且尿囊素跟其他峰的分离 也不好。
远志药材中远志酸的最大吸收波长在210nm附近，靠近紫外吸收末端使得色谱图基线噪音很大，其他杂质峰干扰大，即使可以测定，该方法的加样回收
率也过低，不足80%，与药典规定不得低于95%相差过大造成含量测定不准确。 当归药材中阿魏酸经实际检测，每个制剂单位含量不足0.01mg，不能作为 含量测定的检测指标，在大生产质量控制上，没有实际意义。
健脑补肾制剂含有药材数量达25味之多，品种复杂，相互之间干扰很大， 很难准确单独的检测到制剂中某一种物质，即使是采用多种提取纯化处理技术 也很难达到检测的分离要求；另一方面是该产品的提取工艺复杂，包括醇提药 材、水提药材、二者合并浓縮后进行醇沉除杂等等，而一般的中药提取物都是 采用单纯的水溶液或者乙醇溶液提取，浓縮后使用，或者水提醇沉去除杂质， 很少有象本发明中健脑补肾制剂中的众多环节，这样复杂的工艺势必导致提取 成分复杂，提取成分数量的不可控制性，就为有效选择控制产品的检测指标提 出了很高的技术要求，要通过大量的实验筛选和富有创造性的实验设计和摸索 才能够实现。
目前在国家大力倡导提高中药制剂质量，控制有效的检测成分，提高中药药 材质量和控制质量的药材检测标准的现实条件下，作为国家控制药品质量的最 后屏障的国家药品标准，中药部颁标准WS3-B-2209-96中至今也没有健脑补肾 制剂的含量测定方法，只有一种制剂的鉴别指标，这也反应了目前健脑补肾的 各种制剂的含量测定方法至今也无法解决的现实难题。
因此，本领域技术人员迫切地希望开发出能够准确的测定健脑补肾制剂含量 的测定方法，该方法能够更为科学的简便的控制健脑补肾各种制剂的产品质量， 从而为广大患者提供安全、高效的健脑补肾制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的健脑补肾制剂的含量测定方法； z本发明提供一种健脑补肾制剂的含量测定方法，其为测定该健脑补肾制剂中(1) 供试品的前处理，包括取健脑补肾制剂，研细，称取约l一2g，称取 健脑补肾制剂的量折合含有中药甘草的生药材约为0.17g-0.34g，加入甲醇和乙 酸和混合溶液10-50ml处理至少10分钟，滤过，得到供试品溶液；
(2) 对照品溶液的制备，称取对照品，加流动相溶解并稀释，该对照品浓度 以甘草酸计算为0.002-5mg/ml，即得，所述对照品选自甘草酸铵、甘草酸单铵、 甘草酸双铵或甘草苷；所述的流动相为选自甲醇或乙腈的酸溶液；
(3) 采用HPLC进行测定，该HPLC的色谱条件包括，流动相为甲醇或乙腈 的酸溶液；填充剂选自十八烷基硅烷键合硅胶、辛烷基硅烷键合硅胶、苯基硅烷 键合硅胶；检测波长为220-450nm;
(4) 吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪测定，按照外标方法 进行计算，即得甘草酸的含量。
上述的健脑补肾制剂中甘草酸含量测定方法优选，该HPLC的色谱条件还包 括该HPLC的色谱柱的填充剂选自十八烷基硅烷键合硅胶、辛烷基硅烷键合硅 胶、苯基硅垸键合硅胶；优选十八烷基硅垸键合硅胶、辛垸基硅烷键合硅胶，更 优选十八烷基硅烷键合硅胶。
上述的流动相可以选自甲醇、乙腈、四氢呋喃、水、酸、碱、缓冲盐，优选 甲醇、乙腈、水、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、醋酸、冰醋酸、三乙胺、二乙胺、 醋酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐或其至少两种的任意组合，更优选甲醇、 乙腈、水、磷酸、醋酸、冰醋酸、三乙胺或醋酸盐，或其至少两种的任意组合。
本发明的方法中，理论上检测波长可以选择220-450nm，优选230-300nm,为 了得到几乎无干扰的图谱，检测波长更优选250nm。
本发明以甘草酸做为含量测定指标，而如何对甘草酸进行含量测定方法的文 献报导已经相当多，都是关于流动相如何选择的文章；本领域技术人员公知的 事实是，对于中药成方制剂的含量测定，其难点不在流动相的选择，而在于供 试品的前处理，特别是复方制剂，事实证明，对供试品(即健脑补肾制剂)进 行前处理的过程更为重要。本发明选甘草酸作为含量测定的指标，主要有以下几方面的原因
1、 大量的实验证明，对于健脑补肾制剂而言，无法对本处方中的君药—— 人参，进行定量分析。
2、 甘草酸，即甘草甜素，是一种三萜皂甙；是甘草次酸的二葡萄糖醛酸甙。 甘草酸的水溶液，在持续高温状态下，容易水解成甘草次酸。在本发明所针对 的健脑补肾制剂的工艺中，涉及到的水提、浓縮、干燥等，都有甘草存在。在 工艺摸索过程中发现，不同的操作，不同的提取时间，不同的温度对甘草酸的 含量变化影响较大。S卩，甘草酸的含量能反应整个生产过程中的工艺水准。
3、 从功能主治上分析，甘草具有补脾益气、安神的作用，即甘草在本处方 中不单单是使药的角色，还起到臣药的作用。
4、 发明人对其它药味的含量测定也进行了分析，通过试验没有发现比甘草 更合适的含量测定指标。
本发明的对照品选择甘草酸铵，甘草酸单铵，甘草酸双铵，甘草苷，按照甘 草酸的实际含量进行折算，优选甘草酸铵。
对照品浓度以含有的甘草酸计算，最终溶液选择5mg/ml-0.002 mg/ml，优 选lmg/ml-0.005 mg/ml，更优选0.5mg/ml-0.01 mg/ml。
为得到更好结果，本发明优选加入甲醇和乙酸和混合溶液10—50ml超声处理 至少10分钟，更优选超声至少30分钟，例如30-60分钟，在优选实施例中，超 声处理时间为约40分钟，选用超声40分钟时间的原因以甲醇-36%乙酸溶液处 理为例，取健脑补肾胶囊的内容物适量，研细，精密称取约1.5g，置具塞锥形瓶 中，精密加入体积比为25:5的甲醇-36。/。乙酸溶液25ml，称重，按下表时间超声 处理，放冷，称重，用该甲醇-36%乙酸溶液补足损失的量，摇匀，滤过，即得；
方 法含量(mg/g)
1、甲醇-36%乙酸(25:5) 25ml，超声30分钟0.835
2、甲醇-36%乙酸(25:5) 25ml，超声40分钟0.860
3、甲醇-36%乙酸(25:5) 25ml，超声60分钟0.856以上表明，超声30分钟提取的含量偏低，即提取不完全；比较超声40分 钟与超声60分钟的测定结果，两者数据基本一致，即超声40分钟已提取完全。
上述提到的健脑补肾制剂不但组方成分复杂，是由25味中药组成的超大复 方制剂，不同药材之间的干扰相当大；而且提取工艺复杂，包括醇提药材、水 提药材、二者合并浓縮后进行醇沉除杂等等。这也是造成至今也没有人教导发 明人如何测定健脑补肾制剂中甘草酸的含量测定方法重要原因。
为了得到本发明的技术方案，发明人进行了大量的实验，目的是在保证完全 提取甘草酸的基础上，尽可能的去除杂质。
提取溶剂选择
据文献报道， 一般提取溶剂采用50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙 醇(超声或回流)，但该几种提取溶剂在试验中，均不适合本发明，结果如下
方 法结果
1、 50%甲醇，回流30分钟基线噪音大,主峰分叉(有其他杂峰分离不好)
2、 50%甲醇，超声40分钟基线噪音较大，主峰分叉(有其他杂峰分离不好)
3、 50%乙醇，回流30分钟基线噪音大，主峰分叉(有其他杂峰分离不好)
4、 50%乙醇，超声40分钟基线噪音大，主峰分叉(有其他杂峰分离不好)
5、 70%甲醇，回流30分钟基线飘移，主峰跟其他峰分离不好
6、 70%甲醇，超声40分钟基线飘移，主峰跟其他峰分离不好
7、 70%乙醇，回流30分钟基线飘移，主峰跟其他峰分离不好
8、 70%乙醇，超声40分钟基线飘移，主峰跟其他峰分离不好
在试验中也发现，1%乙酸甲醇溶液无法完全提取甘草酸。而在1%乙酸甲醇 中加入少量的水，甘草酸提取的量能明显增多。根据上述现象，我们配制了以
下几种溶剂甲醇-36%乙酸(25: 1)、甲醇-36%乙酸(25: 2)、甲醇-36%乙酸 (25: 3)、甲醇-36%乙酸(25: 4)、甲醇-36°/。乙酸(25: 5)、甲醇-36%乙酸(25: 6)、甲醇-36%乙酸(25: 7)、甲醇-36%乙酸(25: 8)、甲醇-36%乙酸(25: 9)、 甲醇-36%乙酸(25: 10)等，进行考察。结果如下方 法结果
甲醇-36%乙酸(25: 1)含量偏低，提取不完全；峰形不好，分离好
甲醇-36%乙酸(25: 2)含量偏低，提取不完全；峰形不好，分离好
甲醇-36%乙酸(25: 3)含量偏低，提取不完全；峰形好，分离好
甲醇-36%乙酸(25: 4)含量偏低，提取不完全；峰形好，分离好
甲醇-36%乙酸(25: 5)提取完全。峰形好，分离好
甲醇-36%乙酸(25: 6)提取完全。峰形好，分离差
甲醇-36%乙酸(25: 7)提取完全。峰形好，分离差
甲醇-36%乙酸(25: 8)基线有飘移，提取完全。峰形好，分离不好
甲醇-36%乙酸(25: 9)基线有飘移，提取完全。峰形好，分离不好
甲醇-36%乙酸(25: 10)
本发明所述的流动相为甲醇或乙腈的酸溶液，该酸优选为醋酸或者磷酸，该
甲醇或乙腈的重量占流动相重量的40 80%。本发明的流动相包括甲醇-水-磷酸 (优选65: 35: 0.1)、甲醇-水-乙酸(优选65: 35: 1)、乙腈-水-磷酸(优选40: 60: 0.1)、乙腈-水-乙酸(优选40: 60: 1)、甲醇-水(优选其中含0.4%磷酸，0.7% 三乙胺)(优选65: 35)、乙腈-水(优选含0.4%磷酸，0.7%三乙胺)(优选40: 60)、甲醇-水(优选含0.4%三乙胺，0.7%乙酸)(优选65: 35)和乙腈-水(优选 含0.4%三乙胺，0.7%乙酸)(优选40: 60)中任一，上述比例为体积比。
本发明的含量测定方法，所述的流动相还优选为甲醇或乙腈的醋酸铵溶液， 该流动相中还可包括冰醋酸，该甲醇或乙腈醋酸铵冰醋酸的体积比为50 70: 30 40: 1: 3。
例如，试验中发明人选用Apollo C18柱(150x4.6 mm， 5jim);流动相采 用甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸的混合溶液，其中甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液 -冰醋酸的比例为63:37:2 (体积比)；检测波长为250nm，获得很好的测试结果。
在本发明的优选实施例中，提供了一种健脑补肾制剂的含量测定方法，包括: (1)对供试品进行前处理，取该供试品l一2g，加入甲醇和乙酸的混合溶液25ml超声处理至少10分钟，例如30分钟，滤过，得到供试品溶液；该供试 品为健脑补肾固体口服制剂。
(2) 制备对照品溶液，称取甘草酸铵作为对照品，加甲醇-醋酸铵-冰醋酸溶 液溶解并稀释，该对照品浓度以甘草酸计算为0.01mg/ml-l mg/ml，得对照品溶液；
(3) 采用HPLC对供试品溶液和对照品溶液进行测定，该HPLC的流动相选 自甲醇-醋酸铵-冰醋酸溶液；检测波长为230-300nm;填充剂为填充剂为十八烷 基硅垸键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶；
(4) 吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪测定，按照外标方法 进行计算，即得甘草酸的含量。
上述步骤(1)中所述的甲醇和乙酸的混合溶液为甲醇与30-40%的乙酸以 25:3-7的体积比混合得到的溶液，优选为甲醇与36%的乙酸以25:5的体积比混合 得到的溶液；步骤(2)中所述的甲醇-醋酸铵-冰醋酸溶液的体积配比为60 65 份的甲醇、35 40份的0.2mol/L醋酸铵溶液和1 3份的冰醋酸溶液，优选为甲 醇、0.2mol/L醋酸铵溶液和冰醋酸以63:37:2的体积比混合得到的溶液；步骤(3) 中所述的流动相优选为甲醇、0.2mol/L醋酸铵溶液和冰醋酸以63:37:2的体积比 混合得到的溶液。
值得说明的是经过对流动相的筛选发现，本发明可以采用的流动相包括 甲醇-水-磷酸(65: 35: 0.1)、甲醇-水-乙酸(65: 35: 1)、乙腈-水-磷酸(40: 60: 0.1)、乙腈-水-乙酸(40: 60: 1)、甲醇國水(含0.4%磷酸，0.7%三乙胺)(65: 35)、乙腈-水(含0.4°/。磷酸，0.7%三乙胺)(40: 60)、甲醇-水(含0.4%三乙胺， 0.7%乙酸)(65: 35)、乙腈-水(含0.4%三乙胺，0.7%乙酸)(40: 60)等等，均 有数据证明，此处暂欠奉。
本发明的大量的筛选实验的过程摘选如下
1、水提，过柱纯化
甘草酸在水中的溶解度较好，特别是在热水中，易溶。但直接提取后，无法 进样测定，杂质多，容易损坏柱子，另外杂质多也干扰测定。因此选用中性氧化铝柱纯化(中性氧化铝柱对酸物质有一定的吸附作用)，用36%乙酸洗脱。
.精密称取供试品适量，精密加入水25ml，称重，回流30分钟，放冷，称重， 用水补足损失的量，过滤，精密量取10ml，过中性氧化铝柱(内径lcm， 5g， 100-200目，湿法装柱)，先用水30ml洗脱，弃去洗脱液，然后用3()c/。甲醇50ml 洗脱，收集洗脱液备用；接着用60。/。甲醇50ml洗脱，收集洗脱液备用；最后用 36。/。乙酸50ml洗脱，收集洗脱液，备用。
取上述各备用液，进样分析得30%甲醇、60%甲醇洗脱液中没有甘草酸， 而在36%乙酸中含有甘草酸。发明人在原来提取的基础上，把洗脱液用水浴加 热浓縮后，然后再定容到50ml量瓶中，摇匀，进样，发现甘草酸的峰形发生严 重变化，即甘草酸在酸性条件下，加热浓縮会使其结构发生变化。
另精密称取供试品适量，精密加入水25ml，称重，回流30分钟，放冷，称 重，用水补足损失的量，过滤，精密量取10ml，过中性氧化铝柱(内径lcm， 5g， 100-200目，湿法装柱)，先用水30ml洗脱，弃去洗脱液，然后用60%甲醇 50ml洗脱，弃去洗脱液；最后用36%乙酸洗脱，精密收集洗脱液50ml(用50ml 量瓶收集至刻度，即可)。进样，分离及峰形均良好。但在接下来方法学验证中 发现，该方法的加样回收率低于90%,即不适用于含量测定。分析原因，可能 中性氧化铝与甘草酸能起一定的发应，即强制吸附了部分甘草酸。
2、酸性醇提
由于本品的工艺为水提(20味药材)，而其余也是用40%乙醇提，即其中大 部分成分均不溶于甲醇。因此考虑醇提法。
由于甘草酸在甲醇中的溶解度不大(乙醇中更小)，直接用甲醇去提取，提 取不完全，因此在甲醇中加入了 1%乙酸。但在试验中发现，1%乙酸甲醇溶液无 法提取甘草酸。而在1%乙酸甲醇中加入少量的水，甘草酸提取的量能明显增多。 根据上述现象，发明人配制了以下几种溶剂甲醇-36%乙酸(25: 1)、甲醇-36% 乙酸(25: 2)、甲醇-36%乙酸(25: 3)、甲醇-36%乙酸(25: 4)、甲醇-36%乙 酸(25: 5)、甲醇-36%乙酸(25: 6)、甲醇-36°/。乙酸(25: 7)、甲醇-36°/。乙酸(25: 8)、甲醇-36%乙酸(25: 9)、甲醇-36%乙酸(25: 10)等。
分别称取样品2g，精密加入上述溶液各25ml，超声处理30分钟，过滤，进 样。结果发现，甲醇-36%乙酸(25: 5)提取的样品峰形及分离较好。通过方法 学验证，符合含量测定的需要。
最后确定的最优选方法为色谱条件与系统适应性试验用十八垸基硅烷键 合硅胶为填充剂；甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(63:37:2)为流动相；检测 波长为250nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于2500。
在本发明的优选实施例中，提供了一种健脑补肾制剂的含量测定方法，其 为测定该健脑补肾制剂中的甘草酸的含量，该含量测定方法包括
供试品溶液的制备取健脑补肾制剂(固体剂型)适量，研细，精密称取 约1.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-36%乙酸(25:5)溶液25ml，称重， 超声处理40分钟，放冷，称重，用甲醇-36%乙酸(25:5)溶液补足损失的量， 摇匀，滤过，即得；该健脑补肾制剂若是胶囊，则上述取健脑补肾制剂适量应 为取健脑补肾制剂的内容物适量；
对照品溶液的制备精密称取甘草酸铵对照品适量(约相当于甘草酸 12.5mg)，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取5ml 置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得；
测定分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10pl，注入高效液相色谱仪 测定，按照中国药典2005版中规定的外标方法进行计算即得甘草酸的含量。
本发明提供的健脑补肾制剂的含测方法，于每个制剂单位测得含甘草酸不得 低于0.15mg。
艮口，在本发明的健脑补肾制剂中，含甘草酸不得低于0.15mg都可以达到本发 明的有益效果和目的。
附健脑补肾制剂见实施例。
本发明所述的健脑补肾制剂包括固体制剂(固体剂型)和液体制剂，例如
胶囊剂、丸剂、片剂、软胶囊、散剂、口服液等。
具体实施例方式
以下详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。 实施例l.
健脑补肾胶囊的组成和配比-
人参55份、鹿茸13份、狗肾26份、肉桂55.5份、砂仁77份、金牛草22份、牛 蒡子(炒)33.0份、金樱子22.5份、杜仲(炭)66.5份、川牛膝66.5份、金银花 48.0份、连翘44.0份、蝉蜕44.0份、山药88.0份、远志(甘草水制)77.0份、酸麥 仁(炒)77.5份、当归66.0份g、龙骨(煅)64.5份、牡蛎77.5份、茯苓154.5份、 白术(麸炒)77.5份、桂枝64.5份、甘草51.5份、白芍64.5份、豆蔻64.0份。
胶囊剂的制备方法
取人参55g、鹿茸13g、狗肾26g、肉桂55.5g、砂仁77g，用40%乙醇回流 提取二次，每次加6倍量，每次2 3小时，合并提取液，滤过，备用；其余金 牛草22g、牛蒡子(炒)33.0g、金樱子22.5g、杜仲(炭)66.5g、川牛膝66.5g、 金银花48.0g、连翘44.0g、蝉蜕44.0g、山药88.0g、远志(甘草水制)77.0g、 酸枣仁(炒)77.5g、当归66.0g、龙骨(煅)64.5g、牡蛎77.5g、茯苳154.5g、 白术(麸炒)77.5g、桂枝64.5g、甘草51.5g、白芍64.5g、豆蔻64.0g共20味 加水煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡1小时，煎煮1 3小时，第2次加8 倍量水，煎煮1 2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮，与上述备用提取液合并， 加乙醇使含醇量为70%，静置，取上清液，回收乙醇，加水至3500ml，搅匀， 静置。取上清液滤过，滤液浓縮成稠膏，干燥后粉碎，加适量辅料混匀，制粒， 干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。
含量测定方法
(1)供试品溶液的制备取健脑补肾胶囊的内容物适量，研细，精密称取 约1.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为25:5的甲醇-36。/。乙酸溶液25ml， 称重，超声处理40分钟，放冷，称重，用该甲醇-36%乙酸溶液补足损失的量， 摇匀，滤过，即得；(2) 制备对照品溶液，称取甘草酸铵作为对照品，置25ml量瓶中，加流动 相溶解并稀释，该流动相为甲醇、0.2mol/L醋酸铵溶液和冰醋酸以63:37:2的体 积比混合得到的溶液，该对照品浓度以甘草酸计算为12.5mg/ml，摇匀，精密移 取5ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
(3) 采用HPLC对供试品溶液和对照品溶液进行测定，该HPLC的流动相为 甲醇、0.2mol/L醋酸铵溶液和冰醋酸以63:37:2的体积比混合得到的溶液；检测 波长为250nm;填充剂为填充剂为十八烷基硅垸键合硅胶；
(3)测定分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1(^1,注入高效液相 色谱仪测定，按照中国药典2005版中规定的外标方法进行计算即得甘草酸的含 量。
结果测得每个制剂单位含甘草酸不低于0.15mg。
权利要求
1. 一种健脑补肾制剂的含量测定方法，其为测定该健脑补肾制剂中的甘草酸的含量，该含量测定方法包括(1)供试品的前处理，包括取健脑补肾制剂，取健脑补肾制剂的量折合含有中药甘草的生药材约为0.17g-0.34g，加入甲醇和乙酸的混合溶液10-50ml处理至少10分钟，滤过，得到供试品溶液；(2)对照品溶液的制备，称取对照品，加流动相溶解并稀释，该对照品浓度以甘草酸计算为0.002-5mg/ml，即得，所述对照品选自甘草酸铵、甘草酸单铵、甘草酸双铵或甘草苷；所述的流动相为选自甲醇或乙腈的酸溶液；(3)采用HPLC进行测定，该HPLC的色谱条件包括，流动相为甲醇或乙腈的酸溶液；填充剂选自十八烷基硅烷键合硅胶、辛烷基硅烷键合硅胶、苯基硅烷键合硅胶；检测波长为220-450nm；(4)吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪测定，按照外标方法进行计算，即得甘草酸的含量。
2. 如权利要求1所述的含量测定方法，其中，所述的检测波长为230-300nm。
3. 如权利要求1所述的含量测定方法，其中，所述的流动相为甲醇或乙腈的 酸溶液，该酸为醋酸或者磷酸。
4. 如权利要求3所述的含量测定方法，其中，所述的流动相为甲醇或乙腈 的酸溶液，该酸为醋酸或者磷酸，该甲醇或乙腈的重量占流动相重量的40 80%。
5. 如权利要求1所述的含量测定方法，其中，所述的流动相选自甲醇-水-磷酸、甲醇-水-乙酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-乙酸、含0.4%磷酸和0.7%三乙胺 的甲醇-水、含0.4%磷酸和0.7%三乙胺的乙腈-水、含0.4%三乙胺和0.7%乙酸 的甲醇-水、含0.4%三乙胺和0.7%乙酸的乙腈-水中任一。
6. 如权利要求3所述的含量测定方法，其中，所述的流动相为甲醇或乙腈的醋酸铵溶液，该流动相中还包括冰醋酸，该甲醇或乙腈醋酸铵冰醋酸为 50 70: 30 40: 1: 3。
7. 如权利要求1所述的含量测定方法，其中，该含量测定方法包括(1) 对供试品进行前处理，取该供试品l一2g，加入甲醇和乙酸的混合溶 液25ml超声处理至少10分钟，滤过，得到供试品溶液；该供试品为健脑补肾 固体口服制剂。(2) 制备对照品溶液，称取甘草酸铵作为对照品，加甲醇-醋酸铵-冰醋酸溶 液溶解并稀释，该对照品浓度以甘草酸计算为0.01mg/ml-lmg/ml，即得对照品 溶液；(3) 采用HPLC对供试品溶液和对照品溶液进行测定，该HPLC的流动相 选自甲醇-醋酸铵-冰醋酸溶液；检测波长为230-300nm;填充剂为填充剂为十八 垸基硅烷键合硅胶或辛垸基硅烷键合硅胶；(4) 吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪测定，按照外标方 法进行计算，即得甘草酸的含量。
8. 如权利要求7所述的含量测定方法，其中，步骤(1)中所述的甲醇和乙 酸的混合溶液为甲醇与30-40%的乙酸以25:3-7的体积比混合得到的溶液。
9. 如权利要求7所述的含量测定方法，其中，步骤(2)中所述的甲醇-醋酸 铵-冰醋酸溶液的体积配比为60 65份的甲醇、35 40份的0.2mol/L醋酸铵溶 液和1 3份的冰醋酸溶液。
10. 如权利要求9所述的含量测定方法，其中，步骤(3)中所述的流动相为 甲醇、0.2mol/L醋酸铵溶液和冰醋酸以63:37:2的体积比混合得到的溶液。
全文摘要
本发明提供了一种健脑补肾制剂的含量测定方法，包括供试品加入甲醇和乙酸的混合溶液10-50ml进行前处理得到供试品溶液；制备对照品溶液；采用HPLC进行测定；按照外标方法进行计算，即得该健脑补肾制剂中甘草酸的含量；该方法准确、便捷。
文档编号G01N30/02GK101532994SQ200910130500
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月18日 优先权日2009年4月18日
发明者姚俊华 申请人:姚俊华