专利名称：血细胞分析仪校准品及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及血细胞生物活性保护液和稳定剂的配制及其血细胞分析仪用校准品(物)制备工艺技术。
背景技术：
在血细胞分析仪质量控制过程中，仪器的校准或校正是必不可少的，新仪器安装或每次维修后都应进行仪器的校准。血细胞分析仪用校准品是权威部门认可的标准物质。某一型号的校准品，只能用于校准同型号的仪器，不能用于其他品牌仪器的校准。全血细胞分析的检测结果只有直接或间接地溯源至参考方法，才能保证结果的准确性和不同实验室检测结果的可比性。全血细胞校准
品是血细胞(液)分析仪溯源性必备的计量物质；作为血细胞分析仪测量结果的计量学溯源性，评价与确保临床实验结果准确性唯一依据。目前，血细胞分析仪校准通常采用两种方法①新鲜血液作为校准品，②稳定血液或替代物。国内外全血才交准品大多数采用动物(如禽类)血细胞或高分子材料(如塑料粒子或纳米物质)作为替代品较广泛地应用于临床检验。正在临床上使用的全血细胞校准品，置2 ~ 8r保存有效期为1 ~ 3个月不等，开瓶后稳定性为1 ~ 3天。
发明内容
本发明利用多种细胞活性保护液和稳定剂的组合效应；包括Rb液、Wb,。和Wb22液;Rb液为全血细胞活性保护液(剂)，WbH)和Wt)22液按恰当比例组合为全血细胞稳定剂。1. 配方l且成
(1) 全血细胞活性保护液(Rb液)按以下组分和浓度范围制成化学试剂为分析纯，氯化钠4. 0~6. Og/L、枸橼酸O. 15~0. 3g/L、枸橼酸钠1. 0 ~ 2. Og/L、磷酸二氢钠0. 5 ~ 1. 5g/L、腺噤呤0. 1 ~ 0. 6g/L、葡萄糖4. 0 ~ 10. Og/L 、甘露醇4. 2~15. Og/L、海藻糖5. 0~10g/L、 D-甘露糖0. 5 ~ 1. Og/L、丙三醇5. 0 ~10g/L 、 1.2-丙二醇0. 2~1. Og/L、 EDTAO. 1 ~ 0. 5g/L,生物抑菌剂适量(小于0. 5% )。
(2) 全血细胞稳定剂I (Wb,。液)按以下组分和浓度范围制成化学试剂为分析纯，其浓度范围分别为Rb液lOO. OmL、 二曱亚砜0. 1 ~ 1. 0 mL、曱醛l. 0~3. 0 mL、戊二醛0. 01 ~ 0. 08mL、迭氮钠0.1 ~ 0. 25g。
(3) 全血细胞稳定剂II (Wb22液)按以下组分和浓度范围制成化学试剂为分析纯，其浓度范围分别为Rb液100.0mL、曱醛1.0 3.0mL、多聚曱醛0.05~0. 60g、乙醛0. 5 ~ 5. OmL、迭氮钠0.1 ~ 0. 25g。
(4) A液、Wbw和Wb^液配制后，经过滤(4>0. 2 n )处理，置2 ~ 8'C冰箱保存使用。
2. 血细胞分析仪校准品制备工艺
(1) 血液来源血液中心健康人义务献血或大型动物源性抗凝全血。规格为200mL/袋或400mL/袋血液成分。
(2) 质量要求RBC、 MCV、 HGB、 PLT和WBC及其分类值接近参考值范围；生物源性病原体如乙型肝炎病毒(HBsAg)、抗-HCV、抗-HIV等传染性指标均为阴性。
(3) 全血细胞分离取人类(或动物源性)新鲜抗凝全血("0"或"A"、 "B"、AB血型)225mL/袋，置水平离心机3000转离心25 ~ 30min使血细胞成分与血浆分离，緩慢吸#浆，计其体积X mL,剩余血液体积为(225mL-X)待用。
(4) 全血细胞保护在约200mL全血中先緩慢加入Wb,。液18 20mL,轻轻摇匀置2 8'C24h保存待用。
(5) 全血细胞稳定经保护处理的全血细胞，再緩慢加入Wb22液1. 0~2. 5mL，边加边轻轻摇匀，充分混匀后密封置2 ~ 8'C保存，间隔4 ~ 8h轻轻颠倒2 ~ 4次使其充分混匀，待留样观察结果可行后按所需规定量(0. 5mL ~ 5 . 0 mL/支)分装使用。
(6) 注意事项所使用的实验器具必需洁净并高压消毒灭菌；全血校准品制备全过程必需无菌操作或在10万级净化环境中进行。
3. 质量监测
(1) 对照1号管取血液分离前轻轻充分混匀全血细胞2. OmL x 1支；
(2) 实验2 ~ 3号管吸取全血细胞稳定处理的混匀血液2. OmL x 2支作为留样观察；
(3) 1 ~ 3号血样分别在校准好的血细胞分析仪(如Sysmex、 Cell-Dyn、 Coulter、MEK、 COBAS/ABX、 TEK、 BC、 AC、 CA等系列仪器)上，按1、 3、 5、 7、 9…的间隔日期连续测定8~10次结果。分析和观察细胞变化过程，待全血细胞形态稳定后，采用真空釆血管进行穿刺式定量分装，使分装后的采血管仍然保持真空状态。全血校准品置2-8。C保存有限期为6个月，开瓶使用2~8匸保存可稳定一周。该产品经过生物溯源性链接程序，ICSH或NCCLS提供的参考方法赋值；在有效期内全血细胞校准品可用于血细胞分析仪校准。
本发明采用具有对组织细胞保护及蛋白质、酶和脂类緩慢固定的化学物质，使新鲜抗凝全血细胞离体后，血细胞在较长时间内仍然保持一定代谢和生理活性。血液离心分离获得血细胞成分，在适当比例(如4: l到5: 1)的细胞保护液和细胞稳定剂的协同作用下，生物试剂间的活性协调、互补和叠加作用与效果一方面，保护液提供了维持血细胞正常生理活性所需要的营养成分和生存环境利于进行无氧酵解；另一方面，稳定剂中含有较低浓度的细胞膜及细胞质固定物质，利用多种细胞活性保护液与稳定剂的组合效应，能够緩慢地渗透细胞膜作用于细胞质，有效地与细胞成分-蛋白质、酶、脂类等生物分子牢固结合从而使白细胞、红细胞、血小板不同程度地得到固定及有效保护；使血细胞保持其表观形态特征。因此，处理好的血细胞，经过生物溯源性链接程序及其参考方法赋值；在有效期内全血质控物或校准品，可作为血细胞分析仪的校准品，当加入仪器配套的溶血剂和稀释液时，校准品中的红细胞能迅速溶解，而白细胞在受溶血剂中表面活性剂的作用下表观体积及内部结构发生明显变化，满足血细胞分析仪计数及达到分类之效果。
本发明研制的全血细胞校准品粘稠度低，容易混匀，不存在基质效应；真空密闭后置2 ~ 8'C保存有限期至少为6个月，开瓶使用2 ~ 8C保存可稳定一周，室温(15iC~25°C)可保存有效期为36h。
本发明釆用人类或动物源性全血细胞，利用多种细胞活性保护液与稳定剂的协同组合效应，经细胞保护和稳定技术处理好的全血细胞校准品有良好的稳定性，不仅可以细胞染色及显微镜计数，而且有效期较临床现有全血校准品(物)或质控物(品)长。
具体实施例方式
本发明细胞活性保护液和稳定剂包括保护液(剂)、Wb,。和Wb22液。配方组成
(1)全血细胞活性保护液(Rb液)氯化钠5. Og/L、枸橼酸0. 2g/L、枸橼酸钠2. Og/L、磷酸二氢钠0. 75g/L、腺嘌呤0. 3g/L、葡萄糖7. 5g/L 、甘露醇10. Og/L、海藻糖7. 8g/L、 D-甘露糖0. 6g/L、丙三醇8. Og/L 、 1. 2-丙二醇0. 4g/L、EDTAO. 25g/L,生物抑菌剂适量。2-8X:水箱保存备用。
(2 )全血细胞稳定剂I (Wb,。液)Rb液100. OmL、 二甲亚砜0. 5 raL、曱醛3. 0mL、戊二醛0. 05mL、迭氮钠0.15g。 2 ~ 8'C水箱保存备用。
(3 )全血细胞稳定剂II (Wb22液):Rb液100， OmL、甲醛1. OmL、多聚甲醛0. 25g、乙醛4. 5mL、迭氮钠0.2g。 2 ~ 8'C水箱j呆存备用。
本发明血细胞分析仪用校准品生产工艺如下(l)全血细胞分离取人类(或动物源性)新鲜抗凝全血("0"或"A"、 "B"、AB血型)225mL/袋，置水平离心机3000转离心25 ~ 30min使血细胞成分与血浆分离，緩慢吸取血浆，计其体积XmL(X为为20-28mL )，剩余血液体积为(225mL-X)待用。混匀后取样2. 0mL为1号对照管。
(2) 全血细胞保护在上述225mL-X全血中先緩'漫加入Wb,。液18 ~ 20 mL，轻轻摇匀置2 8。C24h保存待用。混匀后取样2. OmL为2号管。
(3) 全血细胞稳定经保护处理的全血细胞，再緩慢加入Wb22液1. 0~2. 5mL，边加边轻轻摇匀，充分混匀后密封置2 ~ 8'C保存，间隔4 ~ 8h轻轻颠倒2 ~ 4次使其充分混勻，待留样观察结果可行后按所需规定量分装使用。混匀后取样2. OmL为3号管。
(4) 质量监测1 ~ 3号管在校准好的Sysmex kx-21血细胞分析仪上，按1、 3、 5、7、 9...的间隔日期连续测定8~10次结果。直方图和WBC、 RBC、 MCV/HCT、 HGB、PLT等血液分析5项指标结果及直方图质检合格或符^L定要求即可真空分装成产品。
(5) 真空分装根据实际需要制作一套穿刺式定量分装工装，全血校准品充分混匀后，采用真空采血管(2. 0~5. OmL规格)进行穿刺式定量分装，使分装后的#管仍然保持真空状态。
(6) 溯源性赋值通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准或方法联系起来的特性。通常是建立一套参考测量程序，依据ICSH或NCCLS提供的参考方法对全血校准品进行赋值。
(7) 保存与临床使用全血校准品真空密闭后置2 8。C保存，供临床血细胞分析仪校准使用，有限期至少为6个月，开瓶使用2 ~ 8'C保存可稳定一周，室温(15°C ~ 25匸)可保存有效期为36h。
权利要求
1、一种血细胞分析仪校准品，其特征在于利用多种细胞活性保护液和稳定剂的协同组合效应，包括Rb液、Wb10和Wb22液；Rb液为全血细胞活性保护液，Wb10和Wb22液按比例组合为全血细胞活性稳定剂；(1)、Rb液按以下组分和浓度范围制成氯化钠4.0～6.0g/L、枸橼酸0.15～0.3g/L、枸橼酸钠1.0～2.0g/L、磷酸二氢钠0.5～1.5g/L、腺嘌呤0.1～0.6g/L、葡萄糖4.0～10.0g/L、甘露醇4.2～15.0g/L、海藻糖5.0～10g/L、D-甘露糖0.5～1.0g/L、丙三醇5.0～10g/L、1.2-丙二醇0.2～1.0g/L、EDTA0.1～0.5g/L，生物抑菌剂适量；(2)、全血细胞稳定剂按以下组分和浓度范围制成Wb10液Rb液100.0mL、二甲亚砜0.1～1.0mL、甲醛1.0～3.0mL、戊二醛0.01～0.08mL、迭氮钠0.1～0.25g；Wb22液Rb液100.0mL、甲醛1.0～3.0mL、多聚甲醛0.05～0.60g、乙醛0.5～5.0mL、迭氮钠0.1～0.25g。
2、 一种如权利要求1所述的血细胞分析仪校准品的制备工艺，其特征在于，由以下生产工艺制成(1) 全血细胞分离取人类(或动物源性)新鲜抗凝全血细胞("0"或"A"、"B"、 AB血型)225ml/袋，置水平离心机3000转离心25 ~ 30min使血细胞成分与血浆分离后，緩慢吸取少量血浆，计其体积X ml，剩余血液体积为225ml-X待用；(2) 、全血细胞保护在上述225ml-X全血中先緩慢加入Wb,。液18 20 mL,轻轻摇匀置2 ~ 8 °C 24h保存待用；(3 )全血细胞稳定经保护处理的全血细胞，再緩慢加入Wb22液1. 0 ~ 2. 5mL，边加边轻轻摇匀，充分混匀后密封置2 ~ 8。C保存，间隔4 ~ 8h再轻轻颠倒2 ~4次使其充分混匀，后真空分装#_用；(4 )血细胞分析仪校准品效期稳定性真空密闭后的全血校准品置2 ~ 8XM呆存有限期至少为6个月，开瓶4吏用后置2 ~ 8'C保存可稳定一周，室温(15°C ~25'C)可保存有效期为24h。
全文摘要
本发明利用多种细胞活性保护液与稳定剂的协同组合效应，保护剂提供了维持血细胞正常生理活性所需要的营养成分和生存环境进行无氧酵解；稳定剂中含有较低浓度的细胞膜及细胞质固定物质，能够缓慢地渗透细胞膜作用于细胞质，有效地与细胞成分--蛋白质、酶、脂类等生物分子牢固结合从而使白细胞、红细胞、血小板不同程度地得到固定及有效保护；使血细胞保持其表观形态特征。经保护和稳定处理好的血细胞，依据溯源性链接传递程序及其参考方法进行赋值；可作为血液分析仪用校准品(物)在临床使用，本发明采用人类或动物源性全血细胞，有良好的稳定性，不仅可以显微镜人工计数及细胞染色分析，而且效期较现有全血校准品长。
文档编号G01N33/96GK101672853SQ200910186118
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者箫 颜, 菲 颜 申请人:江西特康科技有限公司