用于三维衍射成像的流式细胞仪系统及方法

专利名称：用于三维衍射成像的流式细胞仪系统及方法
技术领域：
本发明涉及流式细胞仪系统，特别是涉及可测量衍射图像信号与三维结构参数的 流式细胞仪系统。
背景技术：
在生命科学研究中流式细胞仪系统可用来对包含大量生物细胞和粒子的群落进 行定量分析。考虑用一束光(通常为单波长)照射经过流体力学聚焦的一流体。该流体一 般包括作为载体的鞘流与包含许多粒子的样品流。这种流体一般可使单个粒子流过照射光 束。多个传感器可用来收集发自被照射粒子位置的信号。例如，可将一个传感器置于靠近 照射光束的位置测量前向散射光和将一个或多个传感器置于与照射光束垂直的方向测量 侧向散射光。被照射的粒子可含荧光分子，用一个或多个荧光传感器可测量粒子所产生的 荧光信号。每个流过照射光束的悬浮粒子都会产生散射光，其内的荧光分子则可能会产生 频率小于照射光频率的荧光信号。散射光与荧光均可被测量并分析。
通过流式细胞仪测量到的信号可用来确定所测粒子的物理与化学结构特征。例 如，前向散射光可与粒子体积相关联，侧向散射光则可与粒子形状与内部结构特征相关联。 使用高速传感器可快速测量散射光和/或荧光信号并据此对包含许多细胞的群落进行快 速数据分析。例如，细胞群落可在一由荧光信号，前向散射光信号和/或侧向散射光信号定 义的多维特征空间内分类。
近年来，利用如电荷耦合器件(CCD)相机测量明场、暗场和荧光图像数据的图像 流式细胞仪已经出现。这种图像流式细胞仪利用光学显微镜技术测量被照射粒子的二维图 像，分析速度可达每秒一千个细胞。但是这种技术依赖于传统的明场或荧光显微镜方法，所 获取的图像为粒子三维结构以非相干方式的二维投影复制图(第三维被压缩至“景深”之 内)。这种二维图像因其不包括三维信息，尽管可用各种模式识别算法分析，但以现有的模 式识别算法进行自动分析还是非常复杂，需要大量人工介入操作，非常困难。在粒子静止条 件下共聚焦成像技术可用于在第三维方向上获取许多幅景深非常小的非衍射二维图像，然 后叠加重建三维结构。但这种技术一般需要许多幅图像，因而不能应用于粒子流动速度较 快的图像流式细胞仪。此外，现有的流式细胞仪中粒子的流速较高，信号的信噪比较低，这 些特点会限制可从散射光和/或荧光信号中提取的信息量。发明内容
本发明的实现方法可为一种流式细胞仪系统其中包括由外层鞘流与内层样品流 组成的可形成流体力学聚焦的流体控制器件。一个可照射位于内层样品流中单个粒子的相干光源。一个可用来探测被相干光源照射激发的粒子所产生的弹性散射光的空间分布的传 感器。一个可用来从弹性散射光的空间分布提取该粒子的三维结构形态参数的分析模块。 本发明的某些实现方法包括传感器可用来获得记录相干弹性散射光空间分布的衍射图像 数据。
在另外一些实现方法中，用一个非相干光源照射粒子并用一个传感器测量被非相 干光源激发的粒子产生的包括明场，暗场和荧光信号的非相干图像数据。系统的分析模块 可设计用来结合衍射图像与非相干图像数据分析位于样品流的粒子。
在另外一些实现方法中，可设计使用分析模块分析弹性散射光的相干分布对粒子 进行分类。可设计使用分析模块分析衍射图像数据并提取粒子结构的体积信息，例如一个 生物细胞内的细胞质体积和/或细胞核体积和/或线粒体体积。
在另外一些实现方法中，流体控制器件设计用来形成为层流状的流相干。流体控 制器件可包括一流动室，其材料的折射率与层流中的鞘流的折射率非常接近。流动室至少 有一边面形状为平面或接近平面。
在另外一些实现方法中，传感器设计用来探测在某一角度范围内的散射光，其中 心角度与自相干光源入照的光传播方向呈某一角度，如90度。
在另外一些实现方法中，可根据包括计算获得的衍射图像数据和/或实验确定的 细胞结构的数据库分析提取三维结构参数。
根据本发明更进一步的一些实现方法，通过流式细胞仪分析粒子并决定其三维结 构参数的方法包括由外层鞘流与内层样品流组成的可形成流体力学聚焦的流体。位于内层 样品流的粒子由一相干光源照射。测量相干光源激发下的粒子所产生的弹性散射光并从中 提取粒子的三维结构参数。
本发明还有一些实现方法可提供计算程序产品，可用来分析流式细胞仪所测量的 粒子并提取其三维结构参数。这种流式细胞仪系统具有包括由外层鞘流体与内层样品流体 组成的可形成流体力学聚焦的一流体。一个用来照射粒子的相干光源，一个用来探测被相 干光源照射激发的粒子所产生的弹性散射光的相干空间分布的传感器。计算程序产品包括 可供计算机使用的存储可读程序编码的存储器。计算机可读的程序编码可用来读入由流式 仪测量的弹性散射光的相干空间分布的衍射图像数据。


所有附图均包括在技术说明之内，也是技术说明的一部分，本发明的实现方法既 由附图与说明示意，用来解释本发明的原理。
图1为本发明实施方法之一的一种流式细胞仪系统示意图。
图2为本发明其他实施方法的另一种流式细胞仪系统的示意图。
图3为本发明实施方法之一的一种包括可测量衍射与非相干图像器件和特征提 取与分类器件的流式细胞仪系统方框图。
图4A为本发明其他实施方法的另一种流式细胞仪系统的示意图。
图4B为本发明其他实施方法的另一种流式细胞仪系统的示意图。
图5为本发明实施方法的一种流式细胞仪系统的示意图。
图6A为本发明实施方法的一种液流控制器件的数字照片。
图6B为本发明实施方法的一种流式细胞仪系统的示意图。
图6C为本发明实施方法的一种流式细胞仪系统的数字照片。
图6D为图6C所示流式细胞仪系统的示意图。
图7为基于本发明实施方法的入射光与散射光分布的示意图。
图8A为一幅自直径为25微米的微球测得的衍射图，激发处于样品流中微球的激 光波长为633纳米。
图8B为根据米理论模型计算的衍射图，其横轴代表散射角度θ s，纵轴代表散射角 度(Ps，角度范围在70度至110度之间，计算不含可调参数。
图9为入射光波波前以及由于一生物细胞内部折射率分布不均勻所造成的散射 光波前的示意图，其中包括细胞核，线粒体，g=格基结构，λ =波长，2a=线性尺度。
图10为包括7个NALM-6培养细胞三维结构参数的数据表。
图11为包括分布在不同二维特征空间内九个NALM-6培养细胞的数据，这些二维 空间由散射光矩阵元素Sll在散射角度θ s = 0时的值与其在不同测向散射光角度范围内 积分值定义。
图12为本发明一些实施方法的一种流式细胞仪系统的示意图。
图13A-13C为显微目镜置于χ = 0时所获得的不同微球与细胞的明场数字图像， 其中微球直径9. 6微米(图13A)，25微米(图13B)以及一个B16/GPR4细胞(图13C)，短 直线=20微米。
图14显示自一直径为25微米的聚苯乙烯微球(嵌于凝胶内)所获取的多幅数字 衍射图与一幅非相干光源照射下获得的明场图(第一列，第三行)。在一波长λ = 532微 米的激光束照射条件下，衍射图于不同的χ位置获取。第一列自左至右x = 0微米，100微 米，200微米；第二列自左至右χ = 300微米，400微米，500微米；第三列自左至右x = 0 微米(明场图)，-100微米，-200微米；第四列自左至右x = -300微米，-400微米，-500 微米。
图15显示多幅获自嵌于凝胶内不同微粒的数字衍射图，左列为一直径为9. 6 微米的聚苯乙烯微球，中间及右列分别为属黑色素肿瘤培养细胞的两个不同细胞Β16/ vector (#1细胞)和B16/GPR4(#2细胞)。第一列衍射图获取位置为χ = 200微米，第二列 衍射图为χ = -200微米。
图16左列与中列显示多幅根据米理论模型计算的散射光角度分布投影获得的数 字衍射图，左列图所用的最大投影半角Θ = 24°，中列为最大投影半角Θ = 16°。右列 显示的为自嵌于凝胶内的聚苯乙烯微球测量的衍射图，测量位置Χ = 200微米，第一列的微 球直径为25微米，第二列直径为9. 6微米。
图17Α-17Β为自10，000个B16F10培养细胞测量的侧向散射光信号与前向散射光 信号双参数点图，图17Α为B16/GPR4培养细胞，图17Β为Bie/vector培养细胞。
图18为一 B16/GPR4细胞三维结构的二维剖面图。
图19为流动状态下直径为9. 6微米的微球所产生的数字衍射图像，激发光波长为 532纳米，流速在1. 6毫米/秒至1. 8毫米/秒之间，曝光时间为50微秒。
图20为流动状态下直径为9. 6微米的微球所产生的数字衍射图像，激发光波长为 532纳米，流速为12毫米/秒，曝光时间为50微秒。
图21A为流动状态下直径为5. 2微米的微球所产生的数字衍射图像，流速约为4. 7毫米/秒。
图21B为流动状态下直径为9. 6微米的微球所产生的数字衍射图像，流速约为12毫米/秒之间。
图21C为流动状态下直径为25微米的微球所产生的数字衍射图像，流速约为7毫 米/秒之间。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式
为例对本发明做出详细说明。但本发明可通过许多 种不同方式实施，因此本发明的实施不应限于这里所介绍的方式，这里介绍的实施方式只 是用于完整地公布本发明，使其全部内容可为业内同行所知。
全文中同样的数字指同样的部件。在附图中，一些线段、层次、成份、部件或特征的 粗细可能会为了清晰而加粗或加大。虚线除注明外表示备选特征。
这里所用的术语仅是为了描述本发明的某种实施方式，并非具有限制意义。特别 值得指出的是，本文中所用的“包括”一类词语用以表明一些所述的特征、数字、步骤、操作、 部件、成份等的存在，但不排除其他以表明一些所述的特征、数字、步骤、操作、部件、成份等 的存在。正如所述，“和/或” 一词包含了任一和所有上述一或多部分的组合。正如所述， 类似于“介于X和Y之间”和“介于大约X和Y之间”等词应解释为包含了 X和Y。正如所 述，类似于“介于大约X和Y之间”应解释为“介于大约X和大约Y之间”。正如所述，类似 于“自大约X至Y”应解释为“自大约X至大约Y之间”。除另定义外，这里使用的所有词 汇(包括技术和科学词汇)所具有的意义与任何一位本发明所属专业的同行通常理解的一 致。更应进一步理解的是，在常用字典或词典中所定义的词汇在本文中使用时其意义应与 上下文和相关专业的解释一致。除非明确定义时，一般不应对词汇作理想化或过于正式的 解释。从所周知的功能或操作可能不会作仔细描述，以行文简洁。
应该理解的是，当提到某一部件与另一部件“相邻”、“相接”、“相连”、“接触”等等 时，这两个部件可以是直接相邻、相接、相连或接触，也可是其间还有其他部件。与此对照， 当提到某一部件与另一部件“直接相邻”、“直接相接”、“直接相连”、“直接接触”等等，这两 个部件之间没有其他部件。业内人士应该理解，当提到一个结构或特征与另一特征相接时， 该结构或特征可能会与相接特征存在相交部分。
在使用例如“在下面”、“处于下方”、“在上面”、“处于上方”之类空间相对关系词汇 时，这些词汇应理解为是为了便于在附图中说明一个部件或特征与另外的部件或特征之间 的关系。这类空间相对关系词汇应理解为是用来包括图中描述的装置或操作的所有方位。 例如，如果图中装置是倒置的，则在相对于其它部件或特征时用“在下面”或“处于下方”所 描述的某一部件或特征的方位应该为“在上面”或“处于上方”。一个典型的例子就是“在下 面”可以包含“在下面”和“在上面”的方位意义。所描述的装置方位可能变化(旋转90度 或其他方位)，其空间相对位置的解释也应相对变化。除非明确定义时，类似的词汇如“向 上的”、“向下的”、“竖直的”、“水平的”等相似词汇也应同样解释。
在使用“第一”、“第二”等词汇描绘某些部件时，这些部件不应被这些词汇限制。这 些词汇只是用于区分不同的部件。所以，一个上述的“第一”部件也可称为“第二”部件而不会偏离本发明所述的原则。除非明确定义时，权力要求或附图中的操作(或步骤)的顺 序并不限于所述的前后次序。
下面对本发明的描述会涉及到使用方框图和/或流程图说明的基于本发明的各 种实施方式的方法，仪器(系统)和/或计算机程序产品。在方框图和/或流程图中的各 个方框或不同方框的组合应理解为可通过计算机程序指令实现。这些计算机程序指令可输 进一个通用或专用计算机和/或其他可编程的数据处理仪器而成为一台机器，使得这些指 令可通过计算机处理器和/或其他可编程的数据处理仪器得到执行并实现方框图和/或流 程图或其中方框的功能/行为。
上述计算机程序指令还可储存于一个计算机可读的存储器并用于控制一台计算 机和/或其他可编程的数据处理仪器实现某一特定方式的功能，例如储存于一个计算机可 读的存储器内的指令生产一件产品用于实现方框图和/或流程图或其中方框的功能/行 为。
上述计算机程序指令还可输入至一台计算机和/或其他可编程的数据处理仪器 并用于启动一系列计算机和/或其他可编程的数据处理仪器的运行步骤而形成通过计算 机实现的过程，在过程之中指令得到执行而实现方框图和/或流程图或其中方框的功能/ 行为。
因此本发明可以通过硬件和/或软件(包括固件、常驻软件、微代码等)实现。此 外本发明的实现还可具有一储存于计算机可用或可读的存储介质内的计算机程序产品的 形式，其中存储介质含有计算机可用或可读的程序代码并用于一个指令执行系统或与其相 联。在本文中计算机可用或可读的介质可以是任何可含有、储存、通讯、传播或传输程序并 用于一个指令执行系统、仪器或设备或与其相联的介质。
计算机可用或可读的介质可以包括但不限于下列介质中的任何一种电子介质、 磁性介质、光学介质，电磁介质、红外介质或半导体系统、仪器、设备或传播介质。更为具体 的计算机可读介质的例子包括(非完全名单)一个包含一或数条电线的电路连接、一个可 携带的计算机盘、一个随机存取存储(RAM)、一个只读存储(ROM)、一个可擦可编程序只读 存储(EPRM或闪存)、一根光纤和一个可携带只读存储光盘(CD-ROM)。应该指出，计算机可 用或可读的介质甚至可以是纸或者其他适当的可印刷程序的介质，因为程序可通过例如光 学扫描纸或其他介质的方式进行电子纪录后以适当方式加以编译和处理，然后根据需要储 存在一个计算机存储器内。
图像数据为使用如成像传感器所纪录的信号空间分布。因此，光学图像为由电 磁场组成的光波信号的空间分布，一般可分为两类1)基于相干光信号空间分布的衍射图 像，2)基于非相干光信号空间分布的非相干图像。这两类图像的区别在于不同空间位置的 电磁场之间的相干性。形成衍射图像的光波信号主要由存在于空间不同位置的高度相干场 组成，而形成非相干图像的光波信号则主要由存在于空间不同位置的非相干场组成。传统 光学显微镜即为一广为人知的非相干图像方法，包括通过被非相干光照射的粒子所产生的 弹性散射光信号而形成的亮场图像和通过被非相干光照射的粒子所产生的荧光信号而形 成的荧光图像。这些图像的非衍射性质使其只能在实际三维空间中复制具有三维结构的细 胞的二维投影结构，细胞的第三维结构被压缩成为所谓的“影深”，无法获得真正的三维结 构信息。与此形成对照，在粒子被例如激光束的相干光束照射或激发时，我们可以测量获得9衍射图像并据此提取粒子的三维结构特征和信息。光学全息图即为衍射图像的一个例子， 全息图片可通过用胶片纪录在激光束照射下的物体所产生的弹性散射光与作为参考光束 的该激光束的一部分之间的干涉条纹而获得。全息图片在相同波长的激光束照射下可在不 同观看角度上重现所记录物体的三维结构。随着图像处理技术的进步，现在我们已可不需 使用参考光束干涉的方式而直接从散射光所形成的衍射图像获取三维结构特征。
现在根据图1至图21C讨论本发明的不同实施方式。
如图1所示，一种基于微流器件设计的流式细胞仪10包括一个流控装置100，测量 相干光分布的成像传感器130，相干光分布的图像分析装置140。流控装置100又包括样品 流入口 102和鞘流入口 104，分别提供沿着流体通道106在微流样品室108流动的样品流和 鞘流。样品室108通过流体排出口 110输出样品流与鞘流流体。流控装置100应具有可在 流体室108内通过流体聚焦形成由样品流和鞘流组成的沿着流体通道106流动的层流的能 力。样品流和鞘流在控制装置控制下分别流入入口 102和104。在流体通道106内流体动 力学聚焦条件下的样品流可以基本保证被测粒子以单列方式通过样品室108。样品流包括 的所测粒子可以是包括人体细胞在内的生物细胞，也可是其他微粒。
例如激光束120的相干光源输出光束可用来照射在流体室108内流动的样品流内 的粒子。一个相干分布成像传感器130可用来探测由被测粒子产生的弹性散射光在空间的 相干分布。一个相干图像分析装置140可用来从弹性散射光相干空间分布提取被测粒子三 维结构特征和形态参数。
在这种实施方式中，当位于样品室108样品流内的粒子被相干光束照射时，粒子 会在不同方向产生散射光。弹性散射光会形成复杂的空间分布模式，与粒子的大小、形状 以及粒子内部的光折射率分布也即结构有关。根据本发明的实施方式，弹性散射光的空间 分布或衍射图像数据可用成像传感器130在某一角度范围内测量，并据此获得被测粒子的 三维结构参数。例如图像分析装置140可用来自衍射图像数据提取与粒子结构相关的体积 与光折射率，如生物细胞内部的细胞核和/或线粒体的体积与光折射率。
在更具体的实施方式中，流控装置100可以为一个层流控制装置，用来提供流速 低于10毫米/秒的层流，这样可在曝光时间小于50微秒时位于样品室108和样品流内的 被测粒子在曝光时间内的移动距离较小(如低于0. 5微米)。在这种实施方式中，流控装置 100可以增强信噪比，提高包括衍射图像在内的成像质量。
在一些实施方式中，微流样品室108可使用光折射率与样品室108内的鞘流光折 射率非常相近的材料制作，这些材料包括硅胶或其它高分子材料。在这种实施方式中，可以 通过匹配激光束120入射至样品室108的部分与其内的流体的光折射率降低成像噪音背 景。此外，例如图6所示，样品室108还可至少有一边面为平面形状使得激光束120可以自 此面以垂直于平面的方向入射，从而进一步降低由于在样品室108入射面的光散射所造成 的成像噪音背景，增强信噪比。
本发明还有一种如图2至图3所示的微流器件型流式细胞仪系统200的实施方 式。系统200包括一个非相干光源202，一个激光源204，一个样品室或微流装置206 (细胞 或其他粒子从其中流过)和一个分束元件208。自非相干光源202和激光源204产生的光 束入射到微流装置206内的粒子。散射光与荧光信号在通过分束元件208时分开。粒子在 激光源204产生的光束激发下所产生的弹性散射光信号通过一波长滤光片1后由一成像传感器220(如标注为CCDl的电荷耦合器件相机)作为衍射图像数据记录；而同一粒子在 非相干光源202产生的光束激发下所产生的弹性散射光和/或荧光信号由另一成像传感 器210(如标注为CCD2的电荷耦合器件相机)作为非衍射亮场或荧光图像数据记录，具 体的图像数据种类可通过选用不同的波长滤光片2选择(见图2)。如图2所示，由非相 干光源202产生的光束通过透镜1和透镜2、含有多个不同波长的滤光片的转轮FW以及 一个聚光镜后聚焦至微流装置206内的粒子。粒子在非相干光源202激发下所产生的弹 性散射光和/或荧光信号通过物镜260 (例如聚焦平面在无穷远处的物镜)和分光片208 后再通过筒镜和波长滤光片2后由非相干成像传感器210探测。粒子在激光源204激发 下所产生的弹性散射光通过物镜260和分光片208后再通过另一个筒镜和波长滤光片1 后由衍射成像传感器220探测。
在微流器件型的实施方式中，传感器220获取的衍射图像是由某一角度范围内的 散射光形成的，例如与激光源204产生的入射光方向成大约90度角度范围内的散射光方 向。传感器210也可获取粒子由于非相干光源202激发所产生的非相干散射光形成的非衍 射亮场或暗场图像和/或由非相干荧光信号形成的非衍射荧光图像。在本发明的一些实施 方式中，衍射图像与非相干图像可以在基本相同的时间段内获取，并可结合起来对所测量 的微流装置206内的粒子进行分析。业内专业人士都知道，非相干图像是为重现所测粒子 的结构而形成，但其粒子结构细节的重现精度也即分辨率会由于非相干光残存的相干性而 受到限制，也称为分辨率的衍射极限。在本发明的一些实施方式中，非相干图像和衍射图像 可以合并在一起用于对粒子的分析。
如图3所示，由传感器210获取的非相干图像和由传感器220获取的衍射图像可 通过特征提取模块230分析。微流装置206内的粒子可根据分类模块240对图像数据分析 后分类。分类方法可以有多种，例如可以根据细胞类粒子的体积或其他特征进行分类。在本 发明的一些实施方式中，衍射图像模拟数据250可通过光学模型和已知的粒子结构获得， 这些图像模拟数据可用来“训练”分类方法，使其可通过分类模块240分析并提取粒子的 三维结构特征后对粒子分类。
在图4A至4B所示的一些实施方式中，可用另外一个激光源270提供粒子激发光 束，然后在接近180度的背散射方向由传感器220测量有弹性散射光形成的衍射图像。如 图4A至4B所示，激光源270的输出光束通过扩束器272，波片274以及衰减片276后再经 过分光片208(从图2所示的方位旋转90度)入射至微流装置206内的粒子，产生沿背散 射方向上的散射光。
以上描述很清楚地表明所述的相干激光源204和270以及非相干光源202均可分 别用适当的光源器件实现。在一些实施方式中，非相干光源202可以是包括175瓦氙灯的 库勒(Kohler)照明系统，而相干激光源204和270可以是波长在180纳米至3000纳米之 间的同一或不同的激光系统。具体的激光波长可以是444纳米或532纳米或633纳米。物 镜260可以是一个聚焦平面设计在无穷远处的物镜，其数值孔径和工作距离均较大，比如 由Mituyo公司生产的型号为M Plan Apo HR 50x或IOOx的物镜。通过在物镜260后不 同距离放置的不同筒镜，衍射图像和非相干图像可使用同一物镜260测量，如图2和图4A 至图4B所示。例如其中的物镜放大倍数可以是50x，数值孔径为0. 55和工作距离为13毫 米。在这些条件下，在空气中所测量的衍射图像是由半角值为48. 6度的角度范围内的散射光形成的。如果自光源202和204的入射光所产生的散射光束经过微流装置206的有机硅 胶(其可见光范围内的折射率大约为1.40)壁出射，由于光束的折射则所收集的散射光束 角度范围的半角值会降低为大约32度。传感器210和220可以使用光敏度较高的电子倍 增电荷耦合器件(EMCXD)相机，可减低曝光时间，例如由AndorTechnology公司生产的型号 为DU88^(，像素数目为10(Mxl002的电子倍增电荷耦合器件相机。尽管如由Apogee公司生 产的型号为Alta U2000相机一类的普通冷却电荷耦合器件相机也可用于图像测量，电子倍 增电荷耦合器件相机采用电子倍增的机制在放大所测得光电信号后再进行模数转换，这样 可在每个像素只有10个光子数量级的弱光条件下将信噪比提高3到10倍，从而使得将曝 光时间自50微秒降低到10微秒或更低成为可能。曝光时间短的好处是可以允许细胞快速 流动，从而提高测量处理细胞的速度。上文提到的电子倍增电荷耦合器件相机一般可有高 达35兆赫兹的像素读出速率，在将像素进行4x4的合并后，图像读出速率可达每秒112幅。 电子倍增电荷耦合器件相机的暗电流与读出噪音一般都较低，因此相机图像输出信号的动 态范围较大(例如可达70分贝)，可对之进行例如14或更高位数的信号数字化，有利于提 高后面的衍射图像数据分析精度。我们应该在这里指出，上述的如角度值、像素数目、图像 读出速率等具体数据值仅仅作为某些实施方式的范例，这些数据可采用其他的适当值。
据此，任何其他适当的流式细胞仪均可作为本发明所述的衍射图像数据测量的实 施方式。例如本发明所述的衍射图像测量可通过不同的流式细胞仪系统设计在不同的角度 范围内实现。此外，还可通过可靠的触发与延迟电路器件对图像数据测量进行准确地控制 测量时间。图5所示的为一具有斜面的微流器件，可用于收集中心散射角度为45度的衍射 图像。
在本发明一些实施方式中，粒子分类由图3所示的分类模块240根据衍射图像 和/或非相干图像数据完成。例如粒子分类可以先使用具有已知粒子三维结构特征与参 数以及所计算的衍射图像和/或非相干图像数据库训练分类算法，然后通过这些算法对粒 子进行分类，对于生物细胞而言，所谓已知粒子三维结构特征与参数可以包括核体积、核形 状、核光学折射率及其分布、核体积与细胞质体积之比、细胞形状、细胞质与核之折射率值 的对比度、线粒体密度、线粒体与细胞质之折射率值的对比度和线粒体与核之折射率值的 对比度。其他可以确定的细胞特征包括生存率、分子键联过程等。用于训练分类算法的 数据库可以由非流式仪方法获得的数据组成，其中三维结构特征可用共聚焦显微镜测量方 法确定，而衍射图像则可通过严格的基于麦克斯韦方程的弹性光散射模型计算获得(可参 见(1) J. Q. Lu, P. Yang, X. H. Hu, ” Simulations of Light Scattering from aBiconcave Red Blood Cell Using the FDTD method" ， Journal of Biomedical Optics，10(2)， 024022 (2005) ； (2) R. S. Brock，X. H. Hu，D. A. Weidner，J. R. Mourant, 1Q. Lu，“ Effect of Detailed Cell Structure on Light Scattering Distribution :FDTD studyof a B-cell with 3D Structure Reconstructed from Confocal Images" ， Journal ofQuantitative Spectroscopy & Radiative Transfer，102，25-36 (2006))。
在本发明一些实施方式中，粒子的结构参数可以通过在置于偏离聚焦位置的成像 系统所测得的图像数据分析获得，如下面的例4中所述。
尽管这里讨论的本发明实施方式是依据图1中基于微流器件设计的流式细胞仪 10和流控装置100描述的，应该指出本发明还可采用其他流控技术。例如流控装置可以采12用非微流器件方式加以实现。图12显示了一个基于“流中流”设计概念的流控装置300。 流控装置300包括一个用于储存样品流302A的样品流池302、一个鞘流入口 304以及包含 三种不同流体通道306A、306B和306C的流体样品室305。流体样品室305可以是内部充满 水的玻璃容器。
样品流池302包括一个用于将样品流302A压入流体样品室305的活塞302B，使 得样品流302A与自鞘流入口 304处流入的鞘流会合。样品流302A进入流体通道306A、鞘 流经入口 304进入另一通道306B后与样品流302A在此处会合。样品流池302也包括一个 保持样品粒子在样品流302A中悬浮的搅拌装置302C。流体样品室305包括流体通道306B 和306C，其间有一隙域308。通过对流体流量以及流体通道306A和306B尺寸和位置的调 节，可以使自通道306A流至通道306B的样品流与鞘流形成层流后经过隙域308流入通道 306C，最后流至出口 310。此时粒子P在流体动力学聚焦条件下由样品流302A夹载以单列 方式通过隙域308，使用在合适的位置上的物镜沈0以及后接的相机(如电荷耦合器件相 机)即可对位于流体样品室305内隙域308的粒子P进行单个粒子图像测量。样品流用以 携带各种需要测量的粒子，例如这里所讨论的生物细胞(包括人体细胞和水生植物细胞) 及其他微粒。
在这种配置方式下，粒子P在流经隙域308时所发出的光信号被成像传感器接收， 此时粒子P附近不存在类似于制作通道306A、306B和306C的光折射率不同的材料。
在本发明一些实施方式中，可用不锈钢细管作为通道306A引导样品流302A自的 样品流池302流入通道306B，不锈钢细管内直径例如可为大约200微米，外直径可为大约 300微米。图12所示的通道306B是由一个内部长度约为8毫米的玻璃管T2连接一个漏 斗形的玻璃质方形管Tl组成的，Tl的内边长可约为80微米外边长可约为230微米。在由 供给流体的针管泵所提供的适当的压强差条件下，样品流与鞘流在通道306B的玻璃管T2 内形成层流。通过此层流，粒子可在流过隙域308时定位于直径最小约为100微米的样品 流内，然后由通道306C收集排出。隙域308在流动方向的长度可约为5毫米。如果流体样 品室305内的流体以及流过通道306A、306B和306C内的流体具有相同或相似的光折射率 (例如样品流、鞘流和流体样品室305内的流体均为水或以水为主的液体)，则在成像系统 的视野内这三种流体之间的界面就不存在折射率差异或差异极小。比如工作距离为13毫 米的物镜260可以用来选择视野，使得流体样品室305的玻璃外壳在视野之外，从而可在视 野内消除具有不同折射率的界面，或使界面的折射率差异极小。
应该指出流体样品室305与物镜260可用任何其他适当的方式实现。例如在通道 306B中以层流形式流动的样品流和鞘流可以从流体样品室305的上端或侧面进入，而不是 如图12所示的从下端进入。
因此，通过减低或消除在粒子P附近区域内的界面折射率差异可提高物镜206 (如 图2、图3、图4A至图4B和图5中所示)测量到的图像质量。与设计为微流装置的样品室 108相比，在粒子P附近隙域308不存在大的折射率差异。一或多数激光束可从流体样品 室305的一个平侧面入射后激发粒子P，然后使用显微镜物镜260和其后的相机(如电荷耦 合器件相机)从另个平侧面收集测量散射光。在一些实施方式中，物镜260及其位置可以 选择使其视野不含流体样品室305的任何平侧面(一般与粒子P的距离可在10至15毫米 之间)。基于“流中流”概念设计的通道306B和306C以及隙域308是用以减小或消除粒子P附近界面的折射率差异，同时还可提供与通常形式的流式细胞仪相似的层流条件，使得快 速分析和/或利用多束激光入射光成为可能。
我们现在将讨论下述几个不带局限性的范例，用来描述本发明的其他实施方式。
例一
为了从相干散射光激发下的粒子所产生的弹性散射光信号中提取更多的结构信 息，我们试制了一台微流器件型流式细胞仪原型机，以验证利用一台标准的电荷耦合器件 相机(Alta 2000, Apogee)测量衍射图像的概念。该原型机如图6a至图6d所示，其性能可 以达到表一所列的指标。
表一双图象微流器件型流式细胞仪的期望指标
权利要求
1.一种流式细胞仪系统，其中包括一个流控装置可用于形成流体动力学聚焦流体，其特点为包括一个外层鞘流体和一个 内层样品流体；一个相干光源可用于对位于内层样品流体的一个粒子的照明；一个传感器可用于测量被相干光源激发的粒子所产生的弹性散射光的空间相干分布；还有一个分析模块可用于从弹性散射光的空间相干分布中提取粒子的三维结构参数。
2.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其流控装置由一个第一流体通道、一个第二流 体通道和一个在第一流体通道与第二流体通道之间的充满流体的隙域组成，其传感器可在 被相干光源激发的粒子位于第一流体通道与第二流体通道之间的隙域时用于测量其产生 的弹性散射光的空间相干分布。
3.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其传感器还可用于提供由粒子产生的弹性散射 光的空间相干分布所形成的衍射图像数据。
4.根据权利要求3所述的细胞仪系统，还可包括一个非相干光源可用于对粒子的照明 和一个传感器可用于测量被非相干光源激发的粒子所产生的亮场和/或暗场和/或荧光信 号所形成的非相干图像数据。
5.根据权利要求4所述的细胞仪系统，其分析模块可将相干图像数据与非相干图像数 据结合。
6.根据权利要求3所述的细胞仪系统，其分析模块可根据弹性散射光的相干分布对粒 子分类。
7.根据权利要求3所述的细胞仪系统，其分析模块可根据衍射图像数据提取粒子一种 结构的一个结构参数。
8.根据权利要求7所述的细胞仪系统，其衍射图像数据是由在一个相对于粒子非聚焦 位置上测得的图像数据组成的。
9.根据权利要求7所述的细胞仪系统，其粒子结构是由一个生物细胞中的细胞质和/ 或核和/或线粒体的体积与折射率组成的。
10.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其流控装置可用于形成一个层流体。
11.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其流控装置可由一个其折射率与鞘流折射率 基本相似的流体室组成。
12.根据权利要求11所述的细胞仪系统，其流体室具有至少一个平面边面。
13.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其传感器还可用于测量在一个角度范围内的 散射光，其范围的中心角度与来自相干光源的光束传播的方向之间有一个偏离角度。
14.根据权利要求13所述的细胞仪系统，其偏离角度大约为90度。
15.根据权利要求1所述的细胞仪系统，其分析模块可根据一个计算和/或测量细胞图 像数据库提取粒子三维结构参数。
16.一种分析流式细胞仪系统内粒子以决定三维结构参数的方法，其中包括形成一个 流体动力学聚焦流体，流体包括一个外层鞘流体和一个内层样品流体；使用一个相干光源对位于内层样品流体的一个粒子的照明；测量被相干光源激发的粒子所产生的弹性散射光；还有从弹性散射光的空间相干分布中提取粒子的一个三维结构参数。
17.根据权利要求16所述的方法，其流体动力学聚焦流体的形成可由使流体通过一个 位于一个流体通道和充满流体的隙域实现，并测量被相干光源激发的位于隙域内的粒子所 产生的弹性散射光的空间相干分布。
18.根据权利要求16所述的方法，还包括提供由被相干光源激发的粒子所产生的弹性 散射光的空间相干分布所形成的衍射图像数据。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括用一个非相干光源对粒子照明和测量由非相 干光源激发产生的弹性散射和/或荧光信号所形成的非相干图像数据。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括将相干图像数据与非相干图像数据结合。
21.根据权利要求18所述的方法，还包括根据弹性散射光的相干分布对粒子分类。
22.根据权利要求18所述的方法，还包括根据衍射图像数据确定粒子一种结构中的体 积与折射率。
23.根据权利要求22所述的方法，其粒子结构是由一个生物细胞中的细胞质和/或核 和/或线粒体的体积与折射率组成的。
24.根据权利要求16所述的方法，其一个流体动力学聚焦流体的形成为一个经过流体 动力学聚焦的层流体。
25.根据权利要求16所述的方法，还包括一个折射率与鞘流折射率基本相似的流体室。
26.根据权利要求25所述的方法，其流体室具有至少一个平面边面。
27.根据权利要求16所述的方法，其测量的散射光分布于一个角度范围内，其中心角 度与来自相干光源的光束传播的方向之间有一个偏离角度。
28.根据权利要求27所述的方法，其偏离角度大约为90度。
29.根据权利要求16所述的方法，其三维结构参数是从一个计算和/或测量细胞图像 数据库提取的。
30.根据权利要求16所述的方法，其光信号是在一个相对于粒子非聚焦位置上测量到的。
31.一个用于分析细胞流式仪中粒子并决定三维结构参数的计算机程序产品，细胞流 式仪具有一个流体动力学聚焦流体并包括一个外层鞘流体和一个内层样品流体，一个可用 于照明一个粒子的相干光源，一个传感器可用于测量被相干光源激发的粒子所产生的弹性 散射光的空间相干分布，该计算机程序产品包括一个可用的存储介质其中具有计算机可读 的程序编码，计算机可读的程序编码包括可读入自细胞流式仪出射的由弹性散射光的空间相干分布形成的衍射图像数据的计 算机可读的程序编码；可自弹性散射光的空间相干分布提取出粒子三维结构参数的计算机可读的程序编码。
32.根据权利要求31所述的计算机程序产品，还包括可读入自细胞流式仪出射的非相 干图像数据，非相干图像数据包括由非相干光源激发的粒子产生的弹性散射信号所形成的 亮场和/或暗场图像数据和/或荧光信号所形成的荧光图像数据。
33.根据权利要求32所述的计算机程序产品，还包括可用于根据弹性散射光的空间相 干分布对粒子分类的计算机可读的程序编码。
34.根据权利要求31所述的计算机程序产品，还包括可用于根据衍射图像数据确定粒 子一种结构中的体积与折射率的计算机可读的程序编码。
35.根据权利要求34所述的计算机程序产品，其粒子结构是由一个生物细胞中的细胞 质和/或核和/或线粒体的体积与折射率组成的。
36.根据权利要求31所述的计算机程序产品，其三维结构参数是从一个计算和/或测 量细胞图像数据库提取的。
全文摘要
本发明涉及一种流式细胞仪系统，其中包括由外层鞘流与内层样品流组成的可形成流体力学聚焦的液流控制器件。一个可照射处于内层样品流中单个粒子的相干光源。一个可用来探测被相干光源激发的粒子所产生的弹性散射光的空间分布的传感器。一个可用来从弹性散射光的空间分布提取该粒子的三维结构参数的分析模块。
文档编号G01N33/487GK102037343SQ200980114507
公开日2011年4月27日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月12日
发明者卢军O., 肯尼思.M.雅可布, 胡新华 申请人:东卡莱罗纳大学