神经性自身免疫紊乱的制作方法

专利名称：神经性自身免疫紊乱的制作方法
技术领域：
本发明涉及自身免疫紊乱，尤其涉及诊断哺乳动物这种紊乱的方法。同时本发明提供用于所述诊断的试剂盒，和用于检测自身抗体的方法和组合物。
背景技术：
电压门控性钾通道(Voltage-gated potassium channel ；VGKC)抗体与三个主要临床症状有关神经性肌强直(NMT)、莫旺氏综合征(MoS)、和边缘叶脑炎(LE)。NMT是指末稍夕卜周神经过度兴奋综合征(peripheral nerve hyperexcitability syndromes),会导致肌肉痉挛和僵直，有时疼痛。MoS是指NMT加上自发症状，例如，出汗过度、便秘、心率异常， 和中枢神经系统症状，尤其是错乱、幻觉和失眠。与抗VGKC抗体有关的LE包括受限制中枢神经系统(CNS)的特征失忆症、人格障碍或精神病，以及癫痫发作(癫痫症)。这些疾病(尤其是MoS)可能与胸腺或其他肿瘤(肺癌、淋巴瘤、妇科恶性肿瘤)有关，但与抗VGKC抗体有关的LE则主要是非副肿瘤性的(non-paraneoplastic)。所有这三种病症都为亚急性发作， 且有免疫疗法反应。此外，在某些具有其它临床病症例如特发性癫痫的患者身上也发现了这些抗体。到目前为止，大部分患者为成人，但也已经发现了一些具有这些抗体和LE或癫痫的儿童。在体内已经由NMT证明[1]，大量证据支持LE和MoS免疫球蛋白G (IgG)的致病作用。第一，患者在血浆交换后经常经历快速的临床痊愈[2』。第二，单个患者中的抗体浓度测定与临床状态的变化相关良好[2、3]。第三，患者IgG结合在海马体上，该解剖区域可定位几乎所有的CNS临床特征[2_4]。过去5年在英国已经诊断了近500例具有抗VGKC抗体和有CNS特征的患者(A Vincent未公开的观察报告)。患者血清被认为是含有抗-VGKC抗体[5、6]，该患者血清能免疫沉淀碘化的α _树眼镜蛇毒素(I125-α DTX)标记的洋地黄皂苷增溶的哺乳动物脑勻浆。电压门控性钾通道由多个结构不同的通道家族构成，包括Kvl (Shaker)亚型[Kvl (shaker) subtype]。Kvl α 亚单位可特异地与其它kvl亚单位同或异四聚(homo- or heterotetramerise)以形成活性通道。α DTX与Kvl. 1，1.2和1.6通道结合，Kvl. 1，1.2和1. 6都存在于脑组织中，且Kvl. 1 和1. 2被发现存在于外周神经中。这三种亚单位的功能和表面表达可由Kvl. 4和Κνβ 1、2 和3调节，其中Kv β 2是脑组织中存在量最大的Kv β成员。LE和MoS患者通常具有较匪T患者更高的抗VGKC抗体浓度。匪T抗VGKC抗体的抗原目标和功能效果先前已经被详细地研究过，且NMT IgG已经被显示结合于表达的Kvl 并下调Kvl电流[5_7]，但仅有一项研究检测了 LE或MoS抗VGKC抗体[8]。最近，大量新的Kvl相互作用蛋白(Kvl -interacting proteins)被揭示[9、1CI]。本发明表明Kvl复合蛋白例如三种复合蛋白CASPR2 (接触蛋白相关蛋白2)、Lgil (富亮氨酸胶质瘤失活基因1)、TAG1 (瞬变轴突糖蛋白1，也就是接触蛋白2)，而未必是Kvl蛋白本身，是某些LE和MoS患者自身抗体(autoantibodies)的目标
发明内容
按照第一个方面，本发明提供一种诊断哺乳动物的自身免疫神经性紊乱的方法， 包括检测步骤，在取自哺乳动物的体液样品中检测至少一种Kvl复合蛋白的表位的自身抗 /[本(autoantibodies)。该至少一种Kvl复合蛋白可复合或结合于其它Kvl复合蛋白，或该至少一种Kvl 复合蛋白可独立于Kvl复合物，例如不共定位，或不物理结合到该复合物。自身抗体可结合到正常复合或结合的蛋白上，即便当它们不处于复合或结合状态时。Kvl复合蛋白可以是必需的或非必需的Kvl辅助蛋白。Kvl复合蛋白可包含Kvl， CASPR2, Lgil and TAGl 中的至少一个。Kvl 复合蛋白可包含 CASPR2, Lgil and TAGl 中的至少一个。在一个实施方式中Kvl复合蛋白可不包含Kvl。CASPR2, Lgil and TAGl已经被显示出是与Kvl相互作用或物理地联结的蛋白。 例如，CASPR2和Tagl对于Kvl蛋白在朗维结(nodes of Ranvier)上的定位是必要的。Kvl复合蛋白可包括CASPR2或主要由CASPR2组成。Kvl复合蛋白可包括Lgil或主要由Lgil组成。Kvl复合蛋白可包括TAGl或主要由TAGl组成。Kvl复合蛋白可包括除 CASPR2, Tagl, Lgil, Kvl 之外的 Kvl 复合蛋白，或主要由除 CASPR2，Tagl, Lgil, Kvl 之外的Kvl复合蛋白组成。优选地，自身免疫神经性紊乱为边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直或相关病症。优选地，神经性紊乱为边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直。当神经性紊乱为边缘叶脑炎时，神经性紊乱的主要特征包括癫痫发作，例如癫痫症，或失忆症，或单纯的精神错乱。当自身免疫神经性紊乱为莫旺氏综合症和/或神经性肌强直时，Kvl复合蛋白可包括CASPR2。针对CASPR2的自身抗体可能反映了胸腺恶性肿瘤和/或其他恶性肿瘤增加的风险、或可能与胸腺恶性肿瘤和/或其他恶性肿瘤增加的风险相关。当自身免疫神经性紊乱为边缘叶脑炎或主要为癫痫症时，Kvl复合蛋白可包括 Lgil0当自身免疫神经性紊乱为神经性肌强直和/或边缘叶脑炎和/或癫痫症时，Kvl复合蛋白可包括TAGl。当自身免疫神经性紊乱为Kvl-复合蛋白可包括CASPR2和TAGl。优选地，本发明的方法进一步包括步骤a)将体液与Kvl复合蛋白或其抗原决定簇相接触；和b)检测抗体-抗原复合物，其由Kvl复合蛋白或其抗原决定簇与存在于体液中的抗体形成，其中，上述复合物的存在反映了自身免疫神经性紊乱，进一步地是边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直或相关病症。优选地，本发明的方法结合临床症状的评估来进行。本发明的方法和临床症状的分析的结合可用来确定个体身上具体的神经性紊乱。自身抗体可通过任何免疫分析技术检测出，许多这样的技术是本领域众所周知的。适合的技术的实例包括ELISA、放射性免疫测定、竞争分析、抑制分析、夹芯式分析等。 总的来说，这类分析使用抗原，其可能被固定于固体支撑物上。使待测样品与抗原接触，如果抗原特定的自身抗体存在于样品中，他们会与抗原发生免疫反应而形成自身抗体-抗原复合物，其可随后被检测出或检测定量。或者，抗原可在表面上或渗透化的细胞内表达[16]。 自身抗体-抗原复合物的检测可使用作为第二抗体的人免疫球蛋白抗体进行，典型的是抗IgG或抗人lgM，它们分别能够识别所有的人IgG或IgM通有的一般特征。第二抗体通常由酶标记，例如；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidise, HRP),以此自身抗体或抗原或第二抗体复合物的测定可通过加入酶底物，以及后续的比色测定、化学发光或荧光检测酶促反应产物进行，或者第二抗体由荧光信号标记[16]。优选地，该方法使用的第二抗体，是经标记或标签的抗IgG抗体。优选地，抗IgG抗体是标记了报道分子(importer molecule)的抗体。该报道分子可以通过重金属、荧光或冷光分子、放射性标记或酶标记。酶标记可以是 HRP。优选地，当与阳性或阴性对照进行比较时，来自抗IgG抗体的信号强度反映了体液中Kvl复合蛋白自身抗体的相对含量。按照另一方面，本发明提供一种分析试剂盒用于诊断哺乳动物自身免疫神经性紊乱包括至少一种Kvl复合蛋白的至少一种表位。按照另一方面，本发明提供一种分析试剂盒用于检测哺乳动物自身免疫神经性紊乱增加的风险，包括至少一种Kvl复合蛋白的至少一种表位。优选地，该试剂盒包括该试剂盒的使用方法说明。优选地，该试剂盒还包括使至少一种Kvl复合蛋白的至少一种表位与哺乳动物体液样品相接触的方法。优选地，神经性紊乱是边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直或相关病症。相关病症包括不具严重癫痫发作的失忆症，不具严重失忆症的癫痫症和/或不具严重失忆症的人格障碍或精神紊乱和/或胸腺恶性肿瘤。按照本发明的试剂盒可进而包括制备校准曲线的标准溶液。按照另一方面，本发明提供一种分离或纯化的自身抗体，其特异用于至少一种Kvl 复合蛋白的表位。这样的抗体可能分离于体液样品。按照另一方面，本发明提供一种分离或纯化的特异用于至少一个Kvl复合蛋白自身抗体的抗体或抗体片断。这种抗体可作为药物或用于制备治疗神经性紊乱和/或相关病症的药物。优选地，神经性紊乱是指边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、或神经性肌强直。这种抗体可包含在药物组合物中，与药物可接受载体、赋形剂或稀释剂一起。相关病症包括不具严重癫痫发作的失忆症，不具严重失忆症的癫痫症和/或不具严重失忆症的人格障碍或精神紊乱和/或胸腺恶性肿瘤。单克隆的或多克隆的抗体或抗体片断可使用本领域技术人员已知的技术来制备。特异用于Kvl复合蛋白自身抗体的抗体还可用于诊断试剂盒，用来检测神经性紊乱例如边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直或相关病症，或用来确定这些病症或胸腺恶性肿瘤所增加的的患病风险。体液用于本发明任何方面可以包括血浆、血清、全血、尿液、汗液、淋巴液、粪便、脑脊髓液或乳头抽吸液。优选地，体液是血清或血浆。按照再一方面，本发明提供一种治疗患者所患的神经性紊乱例如边缘叶脑炎、莫旺氏综合征或相关病症的方法，包括向所述患者施用有效剂量的如本发明所述的抗体或至少一种Kvl复合蛋白或其表位。按照另一方面，本发明提供一种确定能够缓解和治疗神经性紊乱例如边缘叶脑炎、莫旺氏综合征或相关病症的化合物的方法，包括步骤在存在至少一种Kvl复合蛋白或其表位的情况下，使候选化合物与能够结合至少一种Kvl复合蛋白的抗体相接触，其中，阻止所述抗体结合到至少一种Kvl复合蛋白或其表位的化合物即为用于治疗神经性紊乱的候选化合物。本领域技术人员将理解上面讨论的任何优选特征能适用于本发明的任一方面。现在仅通过举例、参照下述附图和实施例来描述本发明的优选实施方式。


图1- LE或MoS血清从兔子皮层提取物中沉淀Kvl但不直接与Kvl结合。A.在增溶的兔子皮层勻浆中LE和MoS血清滴定沉淀高含量的I125- α DTX标记的 Kvl。B.抗Kvl. 1、1.2和1. 6抗体(1 500)，结合到细胞内表位，与渗透化的Kvl. 1,1. 2 或1. 6转染细胞结合。通过抗兔IgG (1 750 ；568nm)观察。抗Kvl抗体的良好特异性被观察到。C. HEK细胞经Kvl和增强型绿色荧光蛋白(EGFP) (488nm)共转染。LE (n=15)和 MoS (n=6)血清(1 :20)用于Kvl. 1-EGFP共表达的HEK细胞，未被检测到结合在使用了抗人IgG Alexa Fluor的表面上。Kvl亚单位联合体的共转染之后未见结合，包括1. 1、1. 2、 1.4、1.6和32。但是，指向1^1.1(1 100)细胞外表位的抗体确实与Kvl转染细胞结合。图2-功能性的、α DTX敏感的Kvl电流未受LE和MoS IgG急性应用的影响。Α. ΗΕΚ-293细胞经Kvl. 1转染表现了 α DTX敏感的电流。B.类似地，ΗΕΚ493细胞经Kvl. 6转染表现了大振幅α DTX敏感电流。这些电流较Kvl. 1介导电流具有明显更大的振幅。C和D. Kvl. 1 (C)和Kvl. 6 (D)电流未受对照或患者血清急性应用的影响。图3- α DTX敏感的Kvl电流未受LE和MoS IgG慢性应用的影响。A和B.在孵育患者血清1天后，α DTX敏感的Kvl. 1 (A)和Kvl. 6 (B)介导电流未显著减少(Ρ> 0. 05，单因素方差分析(one-way AN0VA))。C和D.同样地，在患者血清孵育3天后，未有明显减少在Kvl. 1 (C)和Kvl. 6 (D) 介导电流中被观察到(P> 0.05，单因素方差分析(one-way AN0VA))。图4-患者血清和抗Kvl沉淀不同含量的I125- α DTX标记Kvl取自兔皮层提取物， 患者血清不能沉淀I125- α DTX标记Kvl取自转染细胞提取物。Α.在各个分析(η=3个实验)中，多个抗Kvl商品化抗体，LE (n = 5)和MoS (η =3)血清滴定以50000cpm取自兔皮层提取物的I125-CiDTX标记Kvl。健康对照数值被减去以获得具体数据。B.最大数量的I125-Ci DTX结合位点被图4A中的每个抗血清沉淀，并通过单位点结合双曲线进行预测(GrapUad Prism V5)。C.提取自转染细胞的I125-α DTX标记的Kvl. 1/1. 2/1. 4/1. 6/β 2未被LE或MoS 血清(5 μ 1)沉淀，但被抗Kvl抗体沉淀(5μ 1，η=5个实验)。用健康对照血清或不相关的抗兔抗体进行的非特异性结合已经被扣除。图5-LE和MoS血清结合位点从I125- α DTX复合物中分离。CASPR2抗体免疫共沉淀I125- α DTX取自于脑提取物，并类似于LE/MoS血清进行分离。A. LE (n = 5)和MoS (n = 3) IgG结合到I125-α DTX标记的、洋地黄皂苷增溶的兔皮层复合物显示出比抗Kvl. 1/1. 2IgG结合(所有8个血清结合的结果)更大的对十二烷基硫酸钠(SDS)的敏感性。B.抗CASPR2抗体沉淀20%的全部I125-Q DTX结合位点取自标记的脑勻浆，类似于LE和MoS血清中所发现的(图4A)。此外，抗Lgil抗体沉淀大于60%的全部I125- α DTX 结合位点，抗TAGl抗体沉淀小于10%的全部I125- α DTX结合位点。因此，全部I125- α DTX结合位点中大部分与Lgil复合，小部分与TAGl复合。C.与如A所示相似的实验中，CASPR2抗体(平均2个实验)和Lgil抗体(平均3 个实验)的分离模式与LE患者的IgG (η=5)相似，与抗Kvl. 1/1. 2结合相比。图6-某些LE/MoS血清直接结合到CASPR2的细胞外的区域。在溶液中的结合是高度特异性的，且这些浓度与I125- α DTX免疫沉淀浓度相关。A. LE和MoS血清(1 :100)结合到表达的CASPR2的细胞外区域(xlOOO倍放大)。B.用5 μ 1患者血清孵育IOOfU (荧光单位)的CASPR2-EGFP提取物，并进行免疫沉淀反应。188个已知免疫沉淀I125-aDTX标记的脑勻浆的血清中，32个(18%)也沉淀 CASPR2-EGFP。具有其他神经性疾病的患者的血清不能沉淀I125-α DTX结合位点的，在使用 CASPR2-GFP荧光免疫沉淀分析(FIPA)时不呈阳性。这些疾病包括脑病(ΕΝ)、胸腺瘤、多发性硬化(MS)、植物性神经病(ANS)和健康对照(HC)。这些血清不能沉淀或结合MuSK-EGFP 的细胞外区域(图6A，下方panel)。C.抗CASPR2 FIPA滴定量与I125-α DTX脑勻浆免疫沉淀滴定量的呈线性关系 (Spearman correlation, r2=0. 89, Ρ<0·0001)οD.抗CASPR2阳性血清对CASPR2细胞外区域的免疫吸附避免了沉淀I125-α DTX脑提取物*。但是，对Kvl. 1-1. 2-1. 6表达的HEK细胞的细胞外区域的吸附不能移除I125-α DTX 脑提取物沉淀。图7-CASPR2抗体为IgGl和IgG4亚类，且具有高的亲和性。它们不能结合在蛋白质印迹上的线性化CASPR2。A.亚类特定的第二抗体IgG与已经结合到CASPR2-GFP表达的HEK细胞上的抗 CASPR2抗体的结合，允许抗CASPR2抗体亚类的相对量的定量测定。B.抗体亲和性的斯卡查德分析(Scatchard analyses)通过用CASPR2-GFP提取物滴定非饱和体积的患者血清(n=5)来计算。得到Kd值为1.2X10_8M (士标准偏差 0. 54 X I(T8M)。
C. CASPR2分子量为180KDa。鼠抗CASPR2抗体在CASPR2提取物中检测到一个 180KDa条带(+，圈出的)，但在Kvl. 1/1. 2/1. 6提取物中未检测出(*)。已证明的抗CASPR2 阳性血清在蛋白质印迹的CASPR2提取物(+ )中不能结成一个固定的条带。图8-血清IgG结合到TAGl转染的HEK细胞上。A.商品化的抗体结合在TAGl转染细胞上证明了其是表达在细胞表面上。B.匪T患者血清IgG结合到TAGl-HEK (EGFP阳性)细胞上的例子。108个临床确诊的患者经测试的血清中，仅4个明确地结合到TAGl上。其中的3个为神经性肌强直患
者οC.对照血清((n=40))不发生结合。图9-血清IgG与Lgil转染的HEK细胞的结合。
A.血清IgG结合到Lgil-HEK细胞的两个例子。在108个经测试的血清中，39个结合到Lgil转染的细胞上。对照血清(其它疾病，健康个体)不发生结合(ri=70)。B.但是，该结合不是专门地针对EGFP共转染的HEK细胞，这表明(如前所报道的 [24~25])，Lgil被分泌到基质中且其中一些同时结合到转染(EGFP阳性，绿色)HEK细胞和未转染(EGFP阴性，非绿色)HEK细胞的表面。图10-具有Lgil反应活性的血清IgG与未转染HEK细胞的结合。A. Lgil培养基，未转染HEK细胞用Lgil转染HEK细胞的上清液孵育1小时，被患者血清IgG结合，该患者血清IgG之前被认为是与Lgil结合的。(图9)。B. MUSK培养基，未转染HEK细胞用MUSK转染的HEK细胞上清液孵育1小时，未被这些患者IgG结合。图11-常规临床测试的VGKC抗体滴定量被显示在具有对应于不同VGKC Kvl复合蛋白的抗体的患者中。对照血清沉淀< 100 PM (直线)。图12-患者VGKC抗体滴定量被分为不同的临床表型，由指定的神经病学专家提交的问卷确定。图13-表格所示为所研究的108位患者样品的临床特征。图14-表格所示为按照抗体特异性分类的患者的临床特征。39位具有Lgil抗体的患者当中，36位患者患有边缘性脑炎，无人患有神经性肌强直，无人患有胸腺恶性肿瘤。 通过对比，27位具有CASPR2抗体的患者中，10位患者患有莫旺氏综合症，8位患者患有神经性肌强直，10位患者患有胸腺恶性肿瘤。因此，对这两种不同抗体的识别解释了与“VGKC” 抗体有关的大部分的临床异质性。
具体实施例方式MM
LE/MoS血清免疫沉淀取自兔皮层提取物的I125- α DTX-VGKC,但不抑制VGKC Kvl. 1和 1. 6电流
LE/MoS血清可通过根据其能够免疫沉淀取自兔子或人类皮层的洋地黄皂苷提取物的 I125-α DTX标记的VGKC的特点而被识别确定，如本研究中所用的8个血清(5个LE，3个 MoS)所示(图1Α)。抗体滴定量从这些样品中测定并在2006至6412ρΜ之间变化(正常范围 <100ρΜ)。为了确定抗体是否与单个VGKC结合，我们表达了单个Kvl. 1、1. 2和1. 6亚单位在 HEK细胞中。我们首先用兔抗Kvl抗血清间接免疫细胞化学确认了存在适当的亚单位表达。 由于这些兔抗体结合到细胞内表位，我们对细胞进行渗透(permeabilised the cells)。这些抗体显示出了对适当的Kvl亚型的特异性(图1B)。此外，这些细胞在其表面上表达了一些Kvl亚单位，如Kvl. 1细胞外免疫染色(immunostaining)所示(图1C)，也如对未渗透的细胞上I125- α DTX结合位点的测试所示。无论如何，令人失望地是，我们测量的21个LE/ MoS血清中没有一个显示出相似的可测表面结合(图1C)。仍然存在血清对Kvl的功能或表达产生影响的可能性。转染的HEK细胞证明了取决于电压的电流被α DTX所抑制(图2Α、B)。我们在血清(1 50_1 1000稀释)中孵育表达的Kvl. 1或1.6的HEK细胞，并比较加入血清前后的电流(图2C、D)。当与培养基单独对比时，健康血清未改变Kvl电流。尽管在记录的平均电流上存在某些变化，但总体来说，相比于在健康对照血清中的孵育，患者血清对电流没有显著影响(单因素方差分析(one-way AN0VA);图 2C、D)。某些抗体不直接影响其目标抗原的功能，但通过表面表达的减少引起内化造成对时间和温度的依赖性增加[12~13]。为了观察患者抗体是否随着时间而减少细胞表面表达，在测试0 01乂敏感电流前，我们在371下孵育细胞1天或3天[12]。但是，这对α DTX敏感电流没有影响(图3A-D)。因此，总体来说，这些结果验证了在HEK细胞表面上存在功能性的 α DTX结合Kvl，但不能证明患者抗体结合在这些细胞或影响了通道的功能或者数量。LE/MoS血清不沉淀取自脑提取物的1125_ α DTX-VGKC亚群，不沉淀取自Kv转染的 HEK 细胞的 Iim- α DTX-VGKC
为了进一步研究，我们比较了 I125- α DTX标记的提取自兔皮层的VGKC用患者血清与用兔抗体时对Kvl. 1、1. 2和1. 6的免疫沉淀。所有哺乳动物脑I125-Ci DTX结合位点被认为含有Kvl. 2[14]。抗Kvl. 2免疫沉淀81%的50000最大I125- α DTX结合位点(图4Α)。加入Kvl. 1 或Kvl. 6未能获得进一步的沉淀(补充数据，图1Β)。因此，仅19%的I125-Ci DTX未与VGKC 结合。相比较，通过抗Kvl. 1、1.6和1.4的沉淀分别稳定在51%、17%和7% (图4Α)。这些数据与先前未公开的使用替代的Kvl抗体的实验结果一致(补充数据1C)。当我们以相同分析方法测试单个LE/MoS血清时，即时在血清过量的情况下，他们也一致地免疫沉淀小于 I125-α DTX的最大量。尽管对每个血清的稳定值不相同(图1Α)，对于所有测试的LE/MoS血清而言，平均值为最大值的32% (23-43%范围)(图4B)。这些数据表明血清可能结合于α DTX标记的通道的亚群。为进一步探究，我们在 HEK细胞中单独地和一起地表达了 Kvl. 1、1. 2、1. 4、1. 6和β 2亚单位，并在洲洋地黄皂苷中以与制备兔皮层提取物相同的方式提取细胞。提取物用I125-α DTX进行标记并用抗Kvl 和LE/MoS血清测试免疫沉淀反应。单个的兔抗体的结果与兔皮层提取物中的发现类似，但是用LE/MoS血清时未发生沉淀(图4C)。因此，这些结果使我们得出结论，LE/MoS抗体不直接Kvl亚单位与同聚或异聚结合。 LE/MoS结合到Kvl复合蛋白
对于这些发现的一种解释是，LE/MoS抗体结合到与兔皮层提取物中的Kvl相关的蛋白上，但这种蛋白不存在于转染的HEK细胞中。为测试这种假设，我们对I125- α DTX标记的兔皮层提取物用浓度增加的十二烷基硫酸钠(SDS)进行处理，并用兔抗Kvl抗体和LE/MoS血清进行免疫沉淀反应。结果证明，患者抗体和α DTX复合物的结合与Kvl. 1和1. 2抗体和 α DTX复合物的结合之间没有关系(图5Α)，前者对SDS处理敏感得多。
有数种蛋白已经被报道过与Kvl或DTX在脑提取物中结合位点有关，包括富亮氨酸胶质瘤失活基因1 (Lgil)、接触蛋白相关蛋白2 (CASPR2)、瞬变轴突糖蛋白1 (TAGl) 和突触后密度(PSD)成员[9、1(K15]。当我们用这些蛋白测试抗体时，抗Lgil免疫沉淀61%的 α DTX结合位点，TAGl免疫沉淀约5%。但是，抗CASPR2抗体证明与LE/MoS血清在从兔提取物中沉淀的α DTX位点的比例上(图5Β)，和在对浓度增加的SDS的敏感性上(图5C)均具有类似的反应活性。这些发现表明，在我们的兔皮层提取物中的很大部分的aDTX标记的 VGKC与CASPR2有关，并提示LE/MoS抗体可能直接结合于CASPR2。类似地，使用Lgil抗体的沉淀反应证明了对SDS敏感性比Kvl特异抗体的更好(图5C)，提示了这种蛋白也是LE/ MoS抗体的潜在目标。
某些LE/MoS血清抗体结合到CASPR2
为了直接查明LE/MoS抗体是否结合CASPR2，在细胞内的C末端引入EGFP来标记蛋白之后，我们在HEK细胞中表达了全长度人CASPR2。很多LE/MoS血清结合到这些细胞的表面，而不结合到仅用载体(Vector)转染的细胞表面(图6A)。使用EGFP标记的CASPR2的好处在于它能提供溶液中血清抗体的快速定量测定方法(如Waters等人，水通道蛋白4抗体 [16])。我们通过测量沉淀中的绿色荧光对188个血清免疫沉淀EGFP-CASPR2的能力进行测试(图6B)；这些血清比对照沉淀更多I125-α DTX标记的兔皮层提取物。健康个体或其它神经性疾病患者的血清未沉淀可测的荧光，且IOFU被认为是cut-off值。总共18%的LE/MoS 血清是阳性，且每个血清沉淀的值在12-100FU之间。这些血清全都结合到CASPR2的细胞外区域(图6A)。在对这种抗体呈阳性的患者中，结合到兔皮层提取物的VGKC与直接结合到 CASPR2之间存在非常紧密的联系(图6C)。为进一步确认抗体的特异性，我们用CASPR2表达的HEK细胞预吸附血清。这中止了 CASPR2-EGFP提取物中CASPR2的免疫沉淀反应，同时也中止了取自兔皮层提取物的I125-α DTX-VGKC的免疫沉淀反应(图6D)。抗CASPR2抗体的特性
许多引起疾病的自身抗体具有很高的亲和性、IgG、补体激活和构象依赖。用同种特异的第二抗体对CASPR2-EGFP表达HEK细胞免疫染色使得能够测定CASPR2 IgG亚类的相对丰度(图7A)。大部分的CASPR2抗体为IgGl和IgG4亚类，少量为IgG2，且几乎没有IgG3。我们还测试了有限量的单个患者的血清与不同浓度的CASPR2-EGFP的结合，并通过斯卡查德作图(Scatchard plots)对结果进行了分析。分析5个患者得出平均Kd为1. 2+/-0. 54X IO"8 (SD，图7B)。使用蛋白质印迹法，商品化的抗CASPR2抗体在CASPR2转染细胞提取物中识别出一条分子量为ISOKDa的明显条带，但是被测的10个CASPR2抗体阳性患者未结合到该条带上，这表明CASPR2抗体结合到构象表位上，这些构象表位是不存在于变性的CASPR2提取物中(图7C)。少数VGKC抗体阳性血清结合到TAGl
我们最初没有对很多血清测试其与TAGl的结合，因为抗TAGl抗体仅免疫沉淀小于10% 的取自脑提取物的I125-α DTX结合位点(图5B)。图8Α表明，TAGl转染的HEK细胞在其表面上具有TAG1，这被兔抗TAGl的结合得以证明。两个患者血清的IgG结合显示在图8Β中。 血清结合到未渗透的TAGl转染(EGFP共转染)细胞的细胞外表面。在108个测试的血清中， 我们在4个中发现了 TAGl结合抗体。大部分LE/MoS血清结合到Lgi 1。我们在大部分血清中发现了血清IgG与Lgil转染细胞的结合(见以下)。但是，这种结合不仅仅是在EGFP共转染的HEK细胞的表面上(EGFP阳性，图9A)，而且在未转染的细胞周围也检测到了(图9B)。看来很可能是，Lgil被分泌到培养基当中，然后结合到所有HEK 细胞表面，这之前已被报道过同前]。为了查明是否是这种情况，我们取Lgil转染的细胞的上清液，用未转染的HEK细胞在室温下孵育1小时。然后，通过查找血清中具有Lgil反应活性的IgG的结合来测试这些未转染细胞的Lgil的结合情况(图9A)。取自于Lgil转染的HEK细胞(图10A)、而不是取自于表达其它抗原的细胞的上清液，例如MuSK(图10B)，能转移Lgil至HEK细胞的表面， 且该表面上已被Lgil阳性患者的血清Ig G所结合。这确认并延续了先前的观察，即Lgil被分泌出来且能附着在培养基中PC12细胞的细胞表面上(例如[M、25])。CASPR、TAGl和Lgi 1抗体的临床相关性
为了建立我们的发现的临床关联性，我们测试了 108位带VGKC抗体的患者的血清与表达这三种抗原的HEK细胞的结合。这些样品包括88份用于常规分析的带高含量VGKC抗体 (>400 pM)的血清，它们被认为主要包括CNS (LE或MoS莫旺氏综合征)疾病患者，和20份其它血清(13份来自神经性肌强直患者和7份来自莫旺氏综合征患者)。这些血清选自于我们保存的样品，因为莫旺氏综合征非常稀少，还因为神经性肌强直患者通常具有低含量的结合到I125-Adtx-VGKC的抗体且不足以代表高滴定量的患者。与三种不同抗体有关的VGKC抗体滴定量如图11中所示。这表明，滴定量在Lgil 阳性患者中最高，CASPR2阳性患者居中，TAGl阳性患者最低，包括1份血清I125- α DTX-VGKC 免役滴定量小于ΙΟΟρΜ。我们从指定神经学家处得到了临床信息，主要源自详细的问卷(Oxford Research Ethics Committee A approval，07/Q160X/28)。患者中65位患有边缘叶脑炎(其中6位主要症状为癫痫)，12位患有莫旺氏综合症，25位患有神经性肌强直，并且只有6位患有癫痫症、肌张力障碍或惊吓综合征(startle syndrome)的，不直接归入那些类别。这些患者很好地代表了已知的与VGKC抗体有关的疾病谱系。不同患者临床分组的VGKC抗体滴定量的分布如图12所示。如同依据单个患者之前的数据所预测的，边缘叶脑炎最高，莫旺氏综合症较低，神经性肌强直最低。后面一组包含常规检查中对VGKC抗体呈阴性的8位患者。图 13表示临床综合征、每组中的患者数量、具有非胸腺肿瘤证据的患者数量(这些是变化的， 仅2位在抽样时是临床活跃的)和具有胸腺恶性肿瘤的患者数量，胸腺恶性肿瘤是唯一通常与VGKC抗体有关的肿瘤类型M。图14表示与这三种抗体之每一种相关的患者。值得注意的，Lgil抗体几乎只能在边缘叶脑炎患者中找到——39个Lgil阳性血清中仅3份来自具有其它症状的患者——且重要的是在胸腺恶性肿瘤患者中未能找到。相比较，在12位莫旺氏综合症患者中的10位和11位胸腺恶性肿瘤患者中的10位中找到了 CASPR2抗体。此外，在25位神经性肌强直患者中的8位中也找到了 CASPR2抗体。TAGl抗体仅在4位患者中找到，但是其中3位患神经性肌强直，1位对VGKC抗体呈阴性；还有1位TAGl阳性患者具有边缘叶脑炎。讨论
在先前被认为具有指向中枢神经系统表达的Kvl型钾通道的患者中，我们描述CASPR2 为新的自身抗体目标。此外，我们展示了大部分的其他患者具有Lgil抗体，少数具有TAGl 抗体，其中包括1位对VGKC抗体测试呈阴性的患者。这些抗体的存在与患者的不同临床症状相关，且第一次地，这些结果证明，不同的临床表型很可能取决于以神经系统中不同VGKC Kvl复合蛋白为目标的特定抗体的存在。我们这里定义的抗体代表65%的VGKC抗体阳性样品。进一步改进抗体检测分析方法可能提高该比例。α DTX对Kvl. 1、1. 2和1. 6这些哺乳动物大脑中最多的Kvl亚单位进行标记。对 LE和MoS IgG免疫沉淀α DTX标记的脑蛋白的观察已被假设来推定LE和MoS IgG与Kvl 蛋白的直接结合。通过对特别是Kvl. 2与患者血清的共同定位的说明，脑组织免疫组织化学对该设想提供了支持[4~3~17]。此外，一项研究已经说明了 LE和MoS IgG与表达于一个异源哺乳动物细胞系中的Kvl的结合Μ。但是，LE或MoS血清对特定Kvl亚型的“偏爱”不能解释为什么外周产生的抗Kvl抗体患者仅显现出中枢神经系统表型。功能上地，NMT患者IgG的被动转移产生了电生理学上的改变，这种改变与神经元过度兴奋并发的钾通道功能障碍相一致[1]。同样地，LE和MoS患者表现出神经元过度兴奋的特征，例如癫痫、神经性肌强直和神经元丢失[2~18]；且Kvl. 1突变患者和Kvl. 1基因敲除小鼠形成癫痫[19~2°]。这些证据使得Kvl亚单位成为最可能的LE和MoS IgG的抗原目标。 但是，尚无分子水平的方法令人信服地证实该设想。如果LE或MoS IgG结合Kvl. 1，则它们将被认为会沉淀与抗Kvl. 1抗体沉淀的相同量的I125-aDTX。尽管我们有关抗Kvl. 1、1.2、1.4和1. 6沉淀的数据与先前的研究[14， 21]非常类似，但LE和MoS IgG沉淀Kvl亚群的量，不与任何单个的抗Kvl抗体相类似。这表明他们不结合任何一个Kvl蛋白。Kvl四聚合以在HEK细胞表面上形成功能性的、α DTX敏感通道。但是，我们既不能检测电流抑制，也不能用免疫荧光法测量暴露到LE和MoS IgG后的表面结合。为了排除 IgG结合到Kvl细胞内区域的可能性，我们在模拟诊断分析的条件下增溶细胞，提取类似于存在于我们的脑组织中的Kvl亚单位的异聚体(heteromers)。使用这种模式，我们不能证明LE或MoS IgG沉淀了 I125-α DTX标记的Kvl。因此，尽管Kvl功能障碍可能与LE和MoS 表型存在分子性关联，且LE和MoS IgG沉淀用I125-Ci DTX标记的哺乳动物脑勻浆来计算，但他们并不通过直接结合Kvl蛋白这样做。因此，很可能它们共同沉淀另一种复合到脑组织中的Kvl的蛋白，这种蛋白并不存在与表达Kvl的HEK细胞中。这种设想因Kvl. 1/1. 2和 LE/MoS抗原间不同的SDS敏感度而被加强，而且也详细地提供了他们与I125-Ci DTX结合脑复合物中单独的、更外周的蛋白结合的证据。CASPR2是具有大的细胞外区域的Kvl共沉淀分子[9]。此外，CASPR2从α DTX复合物中的分离方式类似于LE和MoS患者的情况。使用增溶的CASPR2-EGFP的FIPA在32位 (18%)诊断分析阳性患者中产生了阳性值。抗CASPR2抗体不存在于中枢神经系统疾病、自主神经功能障碍或胸腺瘤的患者身上，这些患者在测试血清的诊断分析中呈阴性。所有抗 CASPR2 IgG与CASPR2的细胞外区域的表位结合。这些IgG在蛋白质印迹中不能识别线性化的CASPR2，这表明它们与哺乳动物表达的CASPR2中存在的构象表位结合。抗CASPR2抗体主要为IgGl和4亚类。IgGl亚类可能在抗CASPR2抗体相关的疾病的发病机理中起到补体结合的作用。这些抗体有很高的亲和性，类似于其它神经性疾病中发现的抗体。CASPR2 抗体免疫吸附后的诊断分析中没有发现可检测到的抗体以及抗CASPR2滴定量和诊断分析滴定量之间的线性关系强烈地表明，这些抗CASPR2是某些前面提到的电压门控性钾通道的抗体。CASPR2的唯一神经表达确保了抗体介导的病变仅发生在神经细胞的表面。这与观察到的LE和MoS患者的临床症状一致。CASPR2和Tag 1基因敲除小鼠表现了遍及它们的轴突的Kvl扩散的分布，这与见于野生型神经细胞中的juxtaparanodal聚集 (juxtaparanodal-clustered)的Kvl相反[22]。类似地，具有CASPR2 C端截断的人脑组织表现出比对照脑中所见更扩散的Kvl表达。这些患者形成癫痫，认知功能障碍和腱反射缺失 [23]。考虑到CASPR2在中枢和外周神经系统的分布，这种遗传模型与我们发现的在抗CASPR2 阳性患者中MoS代表比例过剩(MoS overrepresentation) 一致。抗CASPR2抗体可产生与预先簇集的Kvl相似的分散，主要机理有三i)补体结合和病灶组织损伤(focal tissue damage);ii)直接刺激或目标蛋白的阻碍，和iii)目标抗原的内化。很有可能是抗CASPR2抗体通过i)和iii)来介导其行为。降低数量的Kvl可产生相对去极化的、过度兴奋的隔膜。类似的考虑适用于指向Lgil或TAGl的抗体。Lgil主要表达于中枢神经系统，特别是不表达CASPR2的那些区域，例如海马的苔藓纤维层。这可能解释了为什么带这些抗体的患者主要表现为边缘叶脑炎，它与颞叶MRI高信号和颞叶癫痫症有关[2]。此外，基因编码 Lgil的突变被发现于在具有外侧颞叶癫痫症的家族中[28]，他们未表现出任何外周神经功能障碍。相比之下，TAGl用Kvl. 1和Kvl. 2和CASPR2表达在郎维结处，那里它可以提供神经性肌强直患者的抗体目标，TAGl基因敲除小鼠表现了先前簇集的Kvl蛋白在CNS和PNS juxtapar阳极(juxtapar anodes)的散布te~27]。所有这些发现提供一种对与抗“VGKC”抗体有关的临床异质性的重要的新理解，并且今后将提供更加精确的患者的诊断和分类。我们这里所用的基于细胞的分析通常比依赖于溶液中标记抗原的免疫沉淀反应的分析更灵敏[11~16]。例如，在另一组14位神经性肌强直患者中，我们在5位免疫分析中对VGKC抗体呈阴性的患者中发现了 CASPR2或TAGl抗体。因此，这些目标的诊断，和分析方法的进步， 不仅仅解释了表型差异而且也提高了诊断结果。方法
临床资料
血清样品保藏于-20°C。临床医生提供临床详细资料，对患者再进行分类。LE血清被分类为患有失忆症和突发癫痫但无神经性肌强直的血清。MoS血清具有中枢神经系统病症和自主神经病症以及神经性肌强直。对照血清包括胸腺瘤患者(n=9)，亚急性发作的自主神经疾病(n=34)，多发性硬化(n=14)，非I125- α DTX沉淀性脑病(11=50)和健康对照血清(11=10)。 选择88份自具有中等至高VGKC抗体滴定量(全部MOOpM)的血清，忽略任何已知的临床表型。为获得详细的临床信息，向指定神经学家发放了问卷并将这些信息整理到数据库中 (Oxford Research Ethics Committee A approval, 07/Q160X/28)。这让我们能够识别三种主要的临床表型。6位患者不是很符合这些分类4位只患有癫痫症；1位患有肌张力失常和过度惊吓(excessive startle) ；1位只患有过度惊吓。增加另外20份取自已知的莫旺氏综合症患者(n=7)或神经性肌强直患者(n=13)的血清以增加患者的数量，用于确认我们的发现和进行统计学分析。取自兔皮层的VGKC复合物的放射性免疫沉淀反应
从在DTX缓冲液(IOOmM NaCl, 20mM Tris, 5mM KCl, pH调整为7. 12)中用2%洋地黄皂苷在37°C下增溶20分钟的兔脑皮层隔膜(Calbiochem，USA)提取VGKC复合物。用PTX (0. 02M磷酸盐缓冲液和0. 1% Triton X100)按1 2稀释上清液，并用I125-α DTX (Perkin Elmer, USA)孵育。用 PTX稀释提取物至 100 万 cpm每毫升(1 million counts per minute (cpm) per ml)。对于分离试验，室温(RT)下向I125-α DTX标记的提取物中加入十二烷基硫酸钠(SDS) 2小时。用血清或商品化抗体(加入PTX至50 μ 1)对50 μ 1的I125- α DTX标记的提取物4°C孵育过夜。室温下按10 μ 1/1 μ 1血清加入第二抗体(抗人IgG (The Binding Site, UK))或抗山羊 IgG( Jackson Imniunoresearch Laboratories Inc, USA),持续90 分钟。在0.5ml PTX中旋转沉淀物，在PTX中洗涤得到的颗粒两次，并在伽玛计数器(Cobra2， Perkin Elmer)上读数。但用具体的cpm表述时，结果已将健康对照数据减去。
质粒构建
克隆cDNA编码的全长度人Kvl. 1,1. 2,1. 4,1. 6和 β 2至 pcDNA3. l-hygro( Invitrogen Ltd, CA, USA)中。全长度人MuSK-GFP的构建先前已有描述[2]。用EcoRI酶切含有CASPR2 的 cDNA 的载体(Vector)pCR4-T0P0 (IMAGE: 7939625 来自 geneservice, Cambridge, England)。亚克隆该片断到pcDNA3. 1 ( + ) (Invitrogen, UK)以提供在哺乳动物细胞中表达的未标记的CASPR2。 为了用EGFP标记CASPR2，用XhoI和XmaI酶切(digest) pcDNA3. 1 ( + )- CASPR2质粒。亚克隆该片断到pEGFP-Nl (Clontech Laboratories, CA, USA)。对于人Lgi-1，cDNA购自Geneservice Ltd,并用下述引物进行PCR扩增 FPLgilpcdna GATCGCTAGCCCACCATGGAATCAGAAAGAAGCAAAAGG
NheI ；
RPLgilpcdna GATCCTCGAGTCATGCGCTTAAGTCAACTATGACATG )(ho I。纯化的产物被亚克隆到pGEM-Teasy。该克隆和Clontech的质粒pcDNA3. 1 (+)用 Nhel和Biol酶切(digest)。片断被连接到一起，构建体被纯化并被测序验证。FPLgilpcdna: GATCGCTAGCCCACCATGGAATCAGAAAGAAGCAAAAGG Nhel ； RPLgilpcdna: GATCCTCGAGTCATGCGCTTAAGTCAACTATGACATG Xhol。人TAGl cDNA得自 Dr. D. KaragogeosCUniversity of Crete;见 )的馈赠。转染和人胚肾细胞培养
在 37°C、5%C02 条件下，HEK293 细胞在加入 10% 胎牛血清(FCS，TCS Cellworks Ltd, Buckingham, UK)和各 100 单位 /ml 的青霉素 G 和链霉素(Invitrogen, CA, USA)的 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)中培养。在6孔培养板上生长细胞进行免疫吸附和毒素结合(toxi binding)试验，在置于6孔细胞培养板中的13mm盖玻片上进行显微镜观查，在175cm2的烧瓶中进行蛋白质提取。使用聚乙烯亚胺(PEI)，细胞瞬时与Kvl. 1、 1. 2,1. 4,1. 6、β 2,EGFP (增强型绿色荧光蛋白)、MuSK_EGFP、CASPR2-EGFP, Lgil 或 TAGl cDNA共转染。使用Axion 200倒置蔡斯荧光显微镜，EGFP的表达可见。免疫细胞化学
HEK细胞转染48小时后进行荧光免疫染色。盖玻片转移至M孔培养板，并用小鼠抗 Kvl. 1细胞外域抗体(1:100，Dr J Trimmer, California馈赠)或用加入了 1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM-N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ - -乙磺酸)(HEPES)稀释的患者血清(1 20-100)在室温(RT)下孵育1小时。随后在DMEM-HEPES缓冲液中洗涤细胞3次，室温下用含 3%甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定(fix)15分钟。如上洗涤细胞，并用(i)以1:750， 1%的BSA-DMEM-HEPES缓冲液，抗鼠IgG或抗人IgG Alexa Fluor 568标记的第二抗体 (Invitrogen-Molecular probes, Paisley, UK)，或(ii)以 1 :50，1% BSA-DMEM-HEPES 缓冲液，鼠抗人IgGl、2、3或4 (Binding Site, Birmingham, UK)和随后的山羊抗鼠同种型特异的 IgG-Alexa Fluor 568 标记的抗体(Invitrogen-Molecular probes, Paisley, UK)，室温下标记45分钟。对于细胞渗透化，细胞先用固定液(如上所述)孵育，再用含0. 1% Triton χ 100的全部溶液孵育。通过使用抗兔 IgG Alexa Fluor 568 标记的第二抗体(Invitrogen-Molecularprobes, Paisley, UK)观察兔抗Kvl. 1/1. 2 和 1. 6 抗体(1 500，Alamone, Israel)。随后细胞在PBS中洗涤3次，装到滴有含DAPI G’，6’-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐，1:1000) 的抗荧光淬灭剂(DakoCytomation, Cambridge, UK)的载玻片上。用具有MacProbe v4. 3 数字成像系统的荧光显微镜进行观察。为了亚类分析，由3位被遮盲的观察者用事先确定的0-4的评分系统检验所有载玻片[11]。对于TAGl和Lgil，我们使用的鼠抗TAGl (IgGl) 是购自于 Developmental Studies Hybridoma Bank 用于学术研究目的(http://dshb. biology, uiowa. edu/ 上的，3. 1C12，)，山羊抗 Lgil, C19 (sc-9583)和 N18 (sc-9581)是购自于 Santa Cruz Biotechnology Inc.。电生理学
用Kvl. 1和GFP或Kvl. 6和GFP转染HEK-293细胞(同上)，并直接置于盖玻片上进行全细胞膜片钳记录。细胞电压钳记录在含有(mM计)145 NaCl,6 KClU MgCl2UO HEPES, 2 CaCl2,和5葡萄糖，用NaOH调节至pH7. 4的外部缓冲液的固定槽(stationary bath (lml体积))中进行。 2-5ΜΩ抗阻的记录电极(recording pipettes)由硼硅酸盐毛细管玻璃制备(Harvard Apparatus)，并用含有(mM 计)150 KClUO EGTAU CaCl2U MgCl2 禾口 10 HEPES,以KOH调节至pH7. 4的标准细胞内液充满。使用倒置荧光显微镜(Nikon)观察细胞，且仅记录GFP表达细胞。在室温(20-M°C)下进行记录。使用CsCl内液，初步试验确认，显示的电流为钾介导的(数据未示出)。记录过程中α - DTX敏感电流通过α - DTX (1 μ m，Sigma-Aldrich)的直接同浴应用(direct bath application)使得以证实；对照实验中使用相同体积的缓冲溶液。血清样品在使用前经过外部记录溶液渗析，且待用样品缓慢地在培养基中稀释(1 50-1 1000) 中。记录过程中通过直接血清应用，血清在表达的电流上的急性效应得以确定，类似于添加 α - DTX0记录前通过37°C下用Kvl转染的HEK-293细胞孵育1_3天，患者血清的慢性效应得以确定。数据在IkHz低通过滤，在IOkHz获取。使用Axopatch-ID放大器、Digidata 1320系列数字转换器和用于脉冲发生、数据获取和数据分析的pClamp程序套装(Axon Instruments)进行记录。用于分析的细胞具有记录中少于30%变化的低通道阻抗(low access resistance (Ra, < 20 ΜΩ ))、高输入阻抗(high input resistance, Ri, _70mV (+ 10 mV阶越电压)> IGQ )、基线稳定性和小泄漏电流(< -50 pA)。从-80mV的保持电位施加+40mV 300ms试验脉冲进行峰值电流测量。对活化和稳态失活的电压依赖性也进行了分析(数据未示出)。用双尾Mudent t-检验(two-tailed Student t-test)进行单独比较、用单因素方差分析(one-way ANOVAs)进行多重比较检验来评估统计显著性。蛋白质提取和标记
共转染48小时后，用PBS洗涤融合的175cm2烧瓶，用含1 100蛋白酶抑制剂混合物 (Sigma- Aldrich, WO的洲洋地黄皂苷的DTX缓冲液进行溶解。溶解产物转动1小时，离心(13000rpm，5分钟，4°C )并用如上I125- α DTX标记。他们和GFP标记的提取物(IOOfU/分析)都用5 μ 1的人血清或兔抗CASPR2 (Dr E Peles赠送)抗体进行免疫沉淀。颗粒再悬浮于180μ1 PTX中，转移到96孔板，并使用荧光分析仪(Gemini XS, Molecular Probes) 分析。这后一分析方法公知为荧光免疫沉淀分析(FIPA)。蛋白质印迹转染的细胞提取物与SDS类上样缓冲液和还原剂(Invitrogen，CA, USA) 一起沸煮。 4-12% SDS聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，UK)上每孔加入15 μ 1 (等同于蛋白质浓度)的提取物中，在200mV下电泳90分钟。凝胶在30mV下转移至硝化纤维纸上90分钟。用PBS-0. 1% 吐温(tween)、5%牛乳蛋白质溶液封闭每一个条带。随后，用稀释在封闭液(1:100)中的第一抗体孵育隔膜1小时，用PBS-0. 1%吐温(tween)洗涤3次后，用稀释在封闭液(1 200)中的HRP标记的抗兔或抗人IgG第二抗体(DakoCytomation，UK)孵育30分钟。用二氨基联苯胺(DAB)显示印迹。
参考文献Sinha S, Newsom-Davis J, Mills K, Byrne N, Lang B, Vincent A.
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权利要求
1.一种诊断哺乳动物自身免疫神经性紊乱的方法，包括步骤在哺乳动物体液样品中检测对于至少一种Kvl复合蛋白表位上的自身抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括步骤a)将所述体液与至少一种Kvl 复合蛋白或其抗原决定簇相接触；和b)检测抗体-抗原复合物，其由该至少一种Kvl复合蛋白或其抗原决定簇与存在于体液中的抗体形成；其中，所述复合物的存在反映了自身免疫神经性紊乱。
3.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括评估哺乳动物临床症状的步骤。
4.一种用于诊断哺乳动物自身免疫神经性紊乱的分析试剂盒，包括至少一种Kvl复合蛋白的至少一种表位和使用该试剂盒的方法说明。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其进一步包括用于制备校准曲线的标准溶液。
6.一种分离或纯化的自身抗体或抗体片断，其专门用于至少一种Kvl复合蛋白的表位。
7.一种分离或纯化的抗体或抗体片断，其专门用于抗Kvl复合蛋白自身抗体。
8.如权利要求7所述的抗体或抗体片断，其进一步包括标记或标签。
9.如权利要求7或8所述的抗体或抗体片断，其中，所述抗体是抗IgG抗体。
10.如权利要求7-9中任一项所述的抗体在制备治疗神经性紊乱的药物中的应用。
11.如权利要求4或5所述的试剂盒，其进一步包括如权利要求7、8或9所述的抗体或抗体片断。
12.—种治疗患神经性紊乱患者的方法，其包括向所述患者施用有效剂量的如权利要求7、8或9所述的抗体或抗体片段或至少一种Kvl复合蛋白或其表位。
13.一种鉴别能够缓解或治疗神经性紊乱的化合物的方法，其包括步骤在存在至少一种Kvl复合蛋白或其表位的情况下，使候选化合物与能够结合至少一种Kvl复合蛋白的抗体相接触，其中，阻止所述抗体结合到至少一种Kvl复合蛋白或其表位的化合物是用于治疗神经性紊乱的候选化合物。
14.如前述任一项权利要求所述的方法、试剂盒、分离或纯化的自身抗体或抗体片断、 或应用，其中，所述自身免疫神经性紊乱选自边缘叶脑炎、莫旺氏综合征、神经性肌强直和相关病症。
15.如前述任一项权利要求所述的方法、试剂盒、分离或纯化的自身抗体或抗体片断、 或应用，其中，所述体液选自血浆、血清、全血、尿液、汗液、淋巴液、粪便、脑脊髓液和乳头抽吸液。
16.如前述任一项权利要求所述的方法、试剂盒、分离或纯化的自身抗体或抗体片断、 或应用，其中，所述哺乳动物是人。
17.如权利要求1-3和12-16中任一项所述的方法，或如权利要求4-5中任一项所述的分析试剂盒，或如权利要求6-9中任一项所述的分离或纯化的自身抗体或抗体片断，或如权利要求10所述的应用，其中，所述Kvl复合蛋白包括Kvl、CASPR2、Lgi 1和TAGl中的至少一种。
18.如权利要求17所述的方法、分析试剂盒、分离或纯化的自身抗体或抗体片断、或应用，其中，所述Kvl复合蛋白包括CASPR2、Lgil和TAGl中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种诊断哺乳动物的自身免疫神经性紊乱的方法，包括步骤在取自哺乳动物的体液样品中检测对于至少一种Kv1复合蛋白的表位上的自身抗体，以及相关的方法、分析试剂盒、分离或纯化的自身抗体或抗体片断，或其用途。
文档编号G01N33/564GK102203613SQ200980141798
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月26日 优先权日2008年10月25日
发明者安琪拉·文森特 申请人:Isis创新有限公司