专利名称：用于测量大鼠血清总IgE的放射免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测大鼠血清总IgE含量的放射免疫分析试剂盒，特别涉及一种基于偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子制备方法；本发明还涉及一种大鼠血清总IgE含量放射免疫检测方法。
背景技术：
过敏是现代社会中最常见的一种疾病，它是由不同种过敏原引发的。我国大约 5 10%，美国和欧洲约有5 25%的人受过过敏性疾病的侵扰，其中幼儿和青少年的病症尤为明显，威胁较为严重。过敏反应(allergic reaction)又称变态反应，过敏原 (allergen)又称变应原。根据欧洲过敏和临床免疫学学会(European Academy of Allergy and Clinical Immunology，EAACI)发表的观点，免疫介导的过敏反应有两种类型IgE 介导的过敏反应和非IgE介导的过敏反应(Johansson SG0. et al，2001，Allergy，56 813-824)。IgE介导的过敏反应是过敏原刺激抗体的淋巴、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(SlgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型过敏原刺激时，过敏原使IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及细胞因子等化学物质产生过敏反应导致机体的毛细血管扩张、水肿平滑肌痉挛内分泌活动亢进、引发过敏性疾病的临床症状，如花粉症、过敏性鼻炎过敏性哮喘、过敏性休克、荨麻疹、湿疹、血管性水肿、关节炎、头痛、肠胃功能失调及其他慢性症状。IgE介导的过敏反应的致敏原检测在临床上可以通过皮肤敏感试验及血清IgE抗体的体外测量，结合病史、病症的问诊来确定致敏的致敏原。皮肤敏感试验一般是将低浓度、低剂量的过敏物质注射至皮下组织，以观察其过敏反应。虽然皮肤敏感试验准确性高且成本低，但因需要皮下注射多次，操作性较差，且容易使受测者感到不适和恐惧，此外，还存在易产生伪阳性反应而造成误判，以及因直接注射过敏原而造成过敏性休克的危险。血清IgE抗体的体外免疫学检测方法很多，其中有放射免疫吸附剂试 ^t (radioimmunobsorbent test, RIST) > M Wi ^ ^L Wi ^ ^ ^ (enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)、焚光酶联免疫吸附试验(fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay, FEIA)等,不同方法各有优缺点。中药注射制剂的过敏反应是其不良反应主要形式之一，这可能意味着临床前有必要在动物体内进行致敏原的试验，以测试中药注射制剂的过敏反应程度。然而，目前尚缺乏有针对性地测量中药注射制剂致敏原的试验方法(包括动物试验和判定指标)。由于中药注射制剂的致敏原成分复杂，可能制剂中的杂质，也可能中药有效成分本身是个半抗原。 目前通常采用豚鼠为实验动物晶形致敏反应实验，但致敏反应的一个重要指标血清IgE抗体的含量可能不是在致敏原攻击之后达到最高。一个改进方法是应用大鼠(特别是BN大鼠)进行过敏反应研究，这样可在致敏后不同时间取血清，通过测量不同时间的血清中IgE抗体的量，了解致敏反应的程度(而豚鼠不能多天取血清)。目前测量大鼠血清中的IgE抗体的体外免疫学分析药盒不多见，就是有均为进口，购买时间长，而且价格昂贵。为更有利于开展中药注射制剂致敏原的研究，建立测量大鼠血清总IgE的放射免疫分析试剂盒是很有必要的。放射免疫法检测IgE，虽由于放射性的问题妨碍其发展和广泛应用，但其测定重复性好，目前仍在研究单位应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种灵敏度高的测量大鼠血清总IgE的放射免疫分析方法，并提供一种测量大鼠血清总IgE的放射免疫分析试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于测量大鼠血清总IgE的放射免疫分析试剂盒，该试剂盒以偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子作为分离剂。优选地，本发明上述分析试剂盒中还包括本领域技术人员进行测量大鼠血清总 IgE放射免疫分析所用的其它常规试剂，如标准溶液由大鼠IgE配置，标记物溶液为125I标记大鼠IgE，抗血清溶液为兔抗大鼠IgE的抗血清，质控样品由已知大鼠血清样品配制。优选地，本发明上述偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子的制备方法包括如下步骤①.采用碱性化学共沉淀法，制备了磁性纳米粒子粒径约为< lOOnm，比饱和磁化强度为25-50emU/g !^e3O4，具有超顺磁性的!^e3O4纳米粒子。投料反应前，用去离子水分别配制浓度为 1. 7 2. 3mol/L 的 FeCl2 ·4Η20 和 FeCl3 ·6Η20 水溶液。按 F2+A^e3+ = 1/1. 5 1/2. 2 (摩尔比)加到通有氮气反应瓶中，水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加氨水使溶液维持PH= 10 11，停止滴加氨水，再升温至80°C，并继续搅拌0.5 1. ^！。反应结束后， 自然冷却到室温，产生的黑色!^e3O4磁性纳米粒子经蒸馏水反复洗至中性，真空干燥后，即得!^e3O4纳米粒子。②.以Y-氨丙基三乙氧基硅烷(APTQ对!^e3O4纳米粒子进行表面改性，从而在其表面引入氨基，制备得到了硅氨化的Fe53O4纳米粒子，硅氨化的!^e3O4纳米粒子的结构和性能进行了表征分析。其拥有较小的粒径(< IOOnm)，较高的比饱和磁化强度(25-50emu/ g硅氨化的狗304纳米粒子)，表现出优越的磁响应性。具体制备步骤如下称取上述得到的I^e3O4纳米粒子0. 3 0. 8g于反应瓶中，加入IOOml乙醇和1 3ml蒸馏水，超声20 40min。反应液在水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加完0. 5 2ml γ -氨丙基三乙氧基硅烷(APTQ，并保持50 60°C下继续搅拌4 他。产生的硅氨化!^e3O4磁性纳米粒子经乙醇反复洗至中性，真空干燥后备用。③.选用碳二亚胺(EDC)为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下把IgG偶联到硅氨化的狗304磁性纳米粒子表面。具体步骤如下取以上已经硅氨化的!^e3O4磁性纳米粒子0. 3 0. Sg于反应瓶中，加入15 25ml的0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，根据需要分别加入NHS和EDC，室温下搅拌反应池后，用磁分离出已经活化的!^e3O4磁性纳米粒子。再加入15 25ml的0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，加入羊抗兔IgG，并4°C下搅拌反应过夜。产生的偶联有IgG的!^e3O4磁性纳米粒子经0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液反复磁分离洗5次， 用2. 5%的明胶封闭后，再用0. 5%的吐温-20的0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液配置，4°C 保存备用。本发明提供的一种大鼠血清总IgE含量的检测方法，使用上述的放射免疫分析试剂盒，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、IgE标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管，分别进行如下操作1)加入兔抗大鼠IgE的抗血清；2)加入125I标记大鼠IgE,混勻；3)4°C下放置过夜，或37士2°C Ihr温育；4)加入偶联有IgG的狗304磁性纳米粒子，振荡摇勻；5)将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁15 30min， 再移走磁铁；6)倒出溶液后测沉淀放射性计数cpm ；7)计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。随后的实施例将证明，本发明分析试剂盒的测量灵敏度能达到0. 5ng/ml、且精密度和准确度良好，可用大鼠血清中微量IgE测量。
图1为本发明偶联有IgG的Fe53O4磁性纳米粒子的粒径测定结果图。图2为测量大鼠IgE标准溶液的拟合的标准曲线图(其相关系数大于0. 99)。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仪用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。实施例1 抗体和分离剂的制备1.兔抗大鼠IgE的抗体制备采用微量抗原淋巴结内注射免疫方法将弗氏完全佐剂与抗原(大鼠IgE溶液) 按体积1 1混合乳化后，首次在新西兰种公兔两脚前掌各注射0.2ml混合乳化液。10天后，可见胭窝淋巴结肿大，用弗氏完全佐剂与抗原混合乳化液注射到肿大的淋巴结内。以后每隔14天用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次。免疫期间用琼脂免疫双扩散法监测抗血清的效价。二个月后心脏取血清，经硫酸铵分步沉淀得到兔抗大鼠IgE的多克隆抗体(IgG)，使用间接ELISA方法测定所制备得到的抗体效价为1.5X105。2.磁性分离剂制备DFe3O4纳米粒子的制备采用碱性化学共沉淀法制备!^e3O4纳米粒子。投料反应前，用去离子水分别配制浓度为2. Omol/L的FeCl2 ·4Η20和FeCl3 ·6Η20水溶液。按F2V^e3+ =1/1.8(摩尔比)加到通有氮气反应瓶中，水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加氨水使溶液维持PH = 10 11，停止滴加氨水，再升温至80°C，并继续搅拌Ih。反应结束后，自然冷却到室温，产生的黑色!^e3O4磁性纳米粒子经蒸馏水反复洗至中性，真空干燥后，即得!^e3O4 纳米粒子。2)Fe3O4纳米粒子的硅氨化称取上述得到的!^e3O4纳米粒子0. 5g于反应瓶中，加入IOOml乙醇和2ml蒸馏水，超声30min。反应液在水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加完Iml γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTQ，并保持50 60°C下继续搅拌乩。产生的硅氨化 !^e3O4磁性纳米粒子经乙醇反复洗至中性，真空干燥后备用。3)Fe3O4纳米粒子与IgG的偶联利用可溶于水的碳二亚胺，1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，在N-羟基琥珀酰亚胺(MB)存在下把IgG偶联到硅氨化的狗304磁性纳米粒子表面。具体步骤如下取以上已经硅氨化的!^e3O4磁性纳米粒子0. 5g于反应瓶中，加入20ml的0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，根据需要分别加入NHS和 EDC,室温下搅拌反应池后，用磁分离出已经活化的!^e3O4磁性纳米粒子。再加入20ml的 0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，加入羊抗兔IgG，并4°C下搅拌反应过夜。产生的偶联有IgG的狗304磁性纳米粒子经0. 01mol/L,pH 7. 4磷酸缓冲液反复磁分离洗5次，用2. 5%的明胶封闭后，再用0. 5%的吐温-20的0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液配置，4°C保存备用。如图1所示，测定偶联有IgG的狗304磁性纳米粒子的粒径，结果在IOOnm范围内。实施例2 大鼠IgE的125I标记取涂有Iodogen (5 μ g，Sigma)的反应小试管一支，依次加入5 μ g/50 μ 1大鼠IgE 溶液，和2 μ 1的Na125I溶液( 500 μ Ci)。室温下搅拌反应5min后，用0. 01mol/L ρΗ7· 4 的PBS缓冲液终止反应。然后用kphadex G25-80凝胶葡聚糖层析柱(IcmX 25cm)进行纯化，洗脱液为0. 01mol/L pH7. 4的PBS缓冲液，流速lml/min。收集洗脱液(lml/管)并依次测量各管的放射性量，合并收集到的125I标记的大鼠IgE峰，实施例3 试剂盒组成1.大鼠IgE标准溶液取大鼠IgE标准品，分别配成浓度为0. 5、2、6、18、50、180、 500、1，500ng/ml的标准系列，共8瓶，0. 5ml/瓶。标准点浓度确定拟合的标准曲线相关系数要求大于0. 99，否则要调整标准浓度。2.标记物溶液=125I标记大鼠IgE，一瓶，10ml，红色，每IOOul中含有1. 5 3. 0万 cpm放射性量。3.抗血清溶液兔抗大鼠IgE的抗血清，一瓶，10ml，兰色。抗血清稀释度确定抗血清与125I标记大鼠IgE的最大结合率=35 50% (B0值)时的浓度为实用稀释度。4.质控样品由已知大鼠血清样品配制，三瓶，0.5ml/瓶，低、中、高浓度各1瓶，浓度分别为10、100和500ng/ml。5.磁分离剂偶联有IgG的狗304磁性纳米粒子，一瓶，10ml，黑色。6.缓冲液一瓶，50ml，为含有明胶的0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液。实施例4 测量样品的过程1.样品大鼠血清。2.操作程序1)在塑料试管上编号(复管)，包括非特异管(NSB)、零结合管(Btl)、标准管(S1-S8)、质控管(QC-1和QC-2)，样本管(U)，加入的总放射性管(T)。按照下表程序进行加样和操作(双复管分析)
权利要求
1.一种用于检测大鼠血清总IgE含量的放射免疫分析试剂盒，其特征是，其磁分离剂为偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的放射免疫分析试剂盒，其特征是，标准溶液由大鼠IgE配置； 标记物溶液为125I标记大鼠IgE ；抗血清溶液为兔抗大鼠IgE的抗血清；质控样品由已知大鼠血清样品配制。
3.根据权利要求1或2所述的放射免疫分析试剂盒，其特征是，偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子的制备方法包括下列步骤①.采用碱性化学共沉淀法，制备粒径<lOOnm，比饱和磁化强度为25 50emu/g，具有超顺磁性的!^e3O4纳米粒子；②.以Y-氨丙基三乙氧基硅烷对狗304纳米粒子进行表面改性，在其表面引入氨基， 制备得到粒径< lOOnm，比饱和磁化强度为25 50emu/g的硅氨化的Fii3O4纳米粒子；③.选用碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下，把IgG偶联到硅氨化的狗304纳米粒子表面。
4.如权利要求3所述的放射免疫分析试剂盒，其特征是，步骤①中，投料反应前，用去离子水分别配制浓度为1. 7 2. 3mol/L的FeCl2 · 4H20和FeCl3 · 6H20水溶液；按摩尔比 F2VFe3+ = 1/1. 5 1/2. 2加入通有氮气的反应瓶中，水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加氨水使溶液维持pH = 10 11，停止滴加氨水，再升温至80°C，并继续搅拌0. 5 1. 5h ；反应结束后，自然冷却到室温，产生的黑色!^e3O4磁性纳米粒子经蒸馏水反复洗至中性，真空干燥后，即得比饱和磁化强度为25 50emu/g !^e3O4，具有超顺磁性的!^e3O4纳米粒子。
5.如权利要求3所述的放射免疫分析试剂盒，其特征是，步骤②中，称取步骤①得到的I^e3O4纳米粒子0. 3 0. 8g于反应瓶中，加入IOOml乙醇和1 3ml蒸馏水，超声20 40min ；反应液在水浴中搅拌升温至50 60°C后，滴加0. 5 2ml Y -氨丙基三乙氧基硅烷， 并保持50 60°C下继续搅拌4 他，产生的硅氨化!^e3O4磁性纳米粒子经乙醇反复洗至中性，真空干燥，得到比饱和磁化强度为25 50emu/g的硅氨化的!^e3O4纳米粒子。
6.如权利要求3所述的放射免疫分析试剂盒，其特征是，步骤③中，称取步骤②得到的硅氨化的Fe3O4纳米粒子0. 3 0. 8g于反应瓶中，加入15 25ml的0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，分别加入NHS和EDC，室温下搅拌反应池后，用磁分离出已经活化的!^e3O4磁性纳米粒子；再加入15 25ml的0. lmol/L, pH 5. 4缓冲液，加入羊抗兔IgG，并4°C下搅拌反应过夜；产生的偶联有IgG的!^e3O4纳米粒子经0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液反复磁分离洗5 次，用2. 5%的明胶封闭后，再用0. 5%的吐温-20的0. 01mol/L, pH 7. 4磷酸缓冲液配置， 4°C保存备用。
7.一种大鼠血清总IgE含量的检测方法，使用权利要求1-6任何一项所述的放射免疫分析试剂盒，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、IgE标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管，分别进行如下操作1)加入兔抗大鼠IgE的抗血清；2)加入125I标记大鼠IgE，混勻；3)4°C下放置过夜，或37 士 2 °C Ihr温育；4)加入偶联有IgG的!^e3O4磁性纳米粒子，振荡摇勻；5)将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁15 30min，再移走磁铁；6)倒出溶液后测沉淀放射性计数；7)计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。
全文摘要
本发明公开了一种基于测量大鼠血清总IgE的磁性分离的放射免疫分析试剂盒，该放射免疫分析试剂盒是由基于偶联羊抗兔IgG磁性纳米粒子和相应试剂组成。该分析试剂盒的特征在于测量灵敏度能达到0.5ng/ml、且精密度和准确度良好，可用大鼠血清中微量IgE测量。本发明还公开了使用上述的放射免疫分析试剂盒检测大鼠血清总IgE含量的方法。
文档编号G01N33/543GK102243229SQ20101017235
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者张彤, 徐培康, 李秀芳, 林敏 , 金若敏, 钟高仁, 韩向东 申请人:上海中医药大学