专利名称：一种彗星电泳铺胶方法
技术领域：
本发明涉及一种彗星电泳铺胶方法，属于生物分子细胞实验技术领域。
背景技术：
DNA损伤的程度与修复可能性在一定程度上决定细胞生死，其检测方法一直是人们关注的问题之一。虽然这方面的技术有多种，但简便、快速、经济且敏感的方法应首推单 细胞凝胶电泳(SCGE)，或称彗星(comet)电泳。SCGE是第一个能有效检测单个细胞DNA损 伤的技术，目前已应用于各种有核细胞经理化因子诱导的DNA损伤和修复研究。单细胞凝胶电泳是由Ostling和johanson发明，Singh等人在此基础上引入碱性 环境而发展起来的。各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测，并在 统计学基础上对损伤程度做出评估。其基本原理是DNA超螺旋与其赖以附着的核骨架或核 基质经高盐及去污剂裂解后，再在碱性(pH> 12. 3)环境中进行解旋和电泳，断裂的DNA碎 片就会被释放并向阳极泳动，荧光染色后显微镜下观察呈“彗星”状。目前采用的各种彗星实验的实验操作主要包括单细胞悬浮液的获得、电泳胶板制 备、细胞裂解、DNA变性解旋、电泳、中和、染色和观察等步骤。胶片制备即是将获得的细胞悬浮液与低熔点琼脂糖混合并铺于载玻片，这是SCGE 技术中关键的步骤。制板方法有3种“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶。制板过程总 的原则是获得牢固稳定凝胶，避免额外DNA的损伤与修复。1、“三明治"凝胶3层琼脂糖的“三明治”式结构是目前最常用的实验方法，在 这种“三明治”式结构中，第1层为正常熔点的琼脂糖(NMA)层，它的作用是使第2层和第3 层琼脂糖牢固地附着于载玻片上；第2层琼脂糖是包含细胞核的低熔点琼脂糖(LMA)；第3 层为LMA层，可以防止第2层琼脂糖中的细胞DNA在碱处理和电泳时脱离凝胶，并使第2层 琼脂糖中的细胞都处于同一条件下。为了不使胶意外脱落，对这种方法也进行了很多改进。铺制第一层胶时， Navarrete (Mutat. Res, 389 271 277，1997.)等采用了以下方法显微镜载玻片垂直插 于65°C的0. 65% NMA中，取出后垂直放置，使其凝固，可以获得黏附力强均勻一致的琼脂糖 层。孟紫强等(中国化学与分子生物学学报，14(5) :604-609，1998.)采用将预热的NMA滴 在载玻片上，4°C使其凝固，载玻片预热可以增加琼脂糖和载玻片之间的结合力。另外为了 增加低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液与载玻片间的结合力，多采用全磨砂的载玻片制胶板。 刘丰(南京医科大学学报，19 (4) =326-327,1999)等人为了能在一张载玻片上铺两个样品， 在第一层胶凝固后，在载玻片中央用锋利刀片划下2mm宽的胶，将凝胶分成2块，用于注上 2个样品的靶细胞。并采用不加盖玻片的方法，以避免在取盖玻片时将胶撕坏。2、双层凝胶在〃三明治〃凝胶基础上，经多次实践，发现只铺第一和第二层凝 胶，对试验结果没有造成影响，这种方法简化了铺胶程序。3、单层凝胶为改善胶层易与玻片分离的缺点，可在玻片上制一凹槽进行单层灌 胶。刘强(中国辐射卫生，15(2) =153-155,2006)等人发明的微电泳槽，需要对载玻片先进行改造，该方法制胶迅速、操作简单，脱胶率几乎为零。为了降低脱胶率，有些研究人员自制磨砂载玻片，用水砂纸(粒度，NO. 380)将普 通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨，使形成的磨沙面均勻细密。将 这种磨砂片用于三明治胶、双层胶或单层胶制备，可以有效降低脱胶率，但是需要新鲜阅 片，即在电泳结束后如果不能及时阅片，需将做好的胶片放入铺有湿纱布的暗盒中(PBS浸 润)4°C保存。保持纱布湿度，胶片可放置一周。由于湿凝胶片在保存和运输方面困难较大，并且储存时间越长，DNA扩散的可能性 就越大，结果越不稳定。国内外已有研究使用甲醇脱水干燥法和乙醇脱水干燥法保存凝胶 片。胶片脱水干燥法在保持试验结果稳定可靠的基础上，给研究人员带来了方便。“三明治"凝胶制板方法操作复杂，耗时长，容易脱胶，载玻片上制备样品的数量 有限。双层凝胶基本上是在三层凝胶的基础上改进的，依然收到制备样品数量的限制
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速的彗星电泳铺胶方法，在解旋、裂解、电泳及 中和等环节不易脱胶，并容易脱水干燥，方便阅片，克服现有凝胶制备技术过程繁琐，耗时 长，脱胶率高，不易干燥的不足。本发明实现过程如下一种彗星电泳铺胶方法，包括如下步骤(1)将洁净的载玻片在质量百分比浓度为0.2% 1.0%的常熔点琼脂糖溶液中 浸没后，37 °C烘干备用；(2)将细胞悬液与质量百分比浓度为低熔点琼脂糖溶液以体积比1 1混勻， 将10 40 μ 1混合液滴在上述镀膜后的载玻片上；(3)铺胶片以30 45度角靠近细胞悬液，勻速将铺胶片向后拖动，悬液沿铺胶片 前端扩展，直至细胞悬液铺成薄膜状，铺胶完成，4°C凝固2 3min。所述的铺胶片为质地柔韧、不透水、无毒性材料，如PVC材料，其厚度为0. 15 0. 35mm0所述的铺胶片为梯形，两端宽分别为Icm和0. 7cm，高为4cm，用于面积大小不同胶 的铺制；所述的铺胶片还可以为长条状，长为4cm，宽为0. 7 1cm。本发明的优点与积极效果1、本发明彗星电泳铺胶方法不脱胶。成功率高达99. 99%； 2、铺胶速度快，处理大批量样品尤为方便;3、增加了每张载玻片上所载样品数，一张常规载玻 片(25mm χ 75mm)可以铺5 7个样品，每个样品胶膜面积约为IOmm χ 20mm ；4、干片和湿片镜 检均可。由于胶层薄，极易脱水干燥，尤其适合干片镜检。干的凝胶使所有的彗星都在同一水 平面，勿需不停的重调焦距，比新鲜凝胶容易打分，给试验人员带来极大便利；5、方法简单，便 于掌握，勿需购买或自制磨砂载玻片，或者对常规光面载玻片进行外观改造，成本低廉。
图1为本发明铺胶时载玻片的侧面示意图；图2为铺好样品的载玻片示意图；图3为林烟草原生质体用UV-B辐射后的彗星电泳图(400x) :A为Os，B为5s，C为10s, D 为 30s。 具体实施方案如图1所示，铺胶片以30 45度角靠近细胞悬液，勻速将铺胶片向后拖动，悬液 沿铺胶片前端扩展，直至细胞悬液铺成薄膜状，铺胶完成，4°C凝固2 3min。使用本发明的 铺胶方法，可在一张常规载玻片(25mm χ 75mm)上铺5 7个样品(图2)。下面以林烟草原生质体为材料进行单细胞凝胶电泳具体说明本发明。1、烟草原生 质体的游离供试材料为林烟草(Nicotiana sylvestris)的无菌苗。取充分展开的叶子，剪去 叶片，留叶脉，撕去叶脉表皮，再斜切成段，加入酶液(2%纤维素酶Onozuka R_10，0.5%半 纤维素酶，0. 5%果胶酶 Y-23,0. 5%离析酶 R-10,0. 16mol/L 的 CaCl2,0. 1% MES, 0. 4mol/L 甘露醇，pH 5.8-6.2)28°0黑暗中酶解6-121!。将酶解后的原生质体悬浮液用200目不锈钢 筛过滤，600r/min离心5min。将沉淀的原生质体悬浮在2mL 0. 16mol/L的CaCl2 · 2H20(pH 5.8-6.2)中，用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液6mL，600r/ min离心5min。在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的原生质体带，吸管收集再用SmL 0. 16mol/L CaCl2 · 2H20 (pH 5. 8-6. 2)悬浮备用。2、主要试剂和仪器低熔点琼脂糖(Amresco分装)；常熔点琼脂糖(Spanish原装)； TritonX-100(Roth产品)；二甲基亚砜(Amresco原装)、肌苷酸钠(Sigma分装)；其余 生化试剂均为分析纯。电泳仪(Amersham Biosciences)电泳槽Tanon HE120 ；荧光显 微镜=Leica DMLB 2 (Leica公司)；佳能A650数码相机，彗星图象分析软件CASP软件 (casp-1. 2. 2, http://casp. sourceforge. net/index, php 下载)。3、彗星电泳①镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.6%的常熔点琼脂糖中浸没Imin后，置37°C孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(37°C)以1 1的比例 在离心管中混勻，用剪去尖部的枪头将混合液滴在镀膜后的载玻片上，铺胶片(宽分别为 Icm和0. 7cm,高为4cm的0. 25mm厚的PVC片)以40度角靠近细胞悬液，用铺胶片轻轻下 拉，再将载玻片轻轻晃动，使胶平铺于载玻片之上。4°C静置3min制得含细胞胶层。②裂 解，(2. 5mol · L^1NaClUOOmmol · L-1Na2EDTAUOmmol · L-1Tris, pHIO、1 %肌氨酸钠，用前加 1% TritonX-IOOUO % DMS0)4°C，lh。③水洗，三蒸水4°C水洗3次，5min/次。④解旋，载 玻片放电泳缓冲液中(ImMNa2EDTA, 300mMNa0H，pH 彡 13) 4°C，15min。⑤电泳，4°C，15min， 0. 74VCHT1 (26V, 300mA)。⑥中和，400mMTris 缓冲液，pH7. 5，3 次，5min/ 次。⑦冰冷的无水 乙醇脱水lOmin，室温晾干。⑧染色(EB，20 μ g/ml，20 μ 1)，镜检，每组随机取50个细胞，用 CASP分析软件进行分析。试验重复两次。4、彗星图像分析和数据的统计分析选取彗星头部DNA百分比(HDNA% )、尾部DNA百分比(TDNA% )、彗星全长(CL)、 尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)作为分析指标。统计学处理用SPSS13. 0统计软件对上述指标进行单因素方差分析和组间两两 对比。
权利要求
一种彗星电泳铺胶方法，包括如下步骤(1)将洁净的载玻片在0.2％～1.0％的常熔点琼脂糖溶液中浸没后，37℃烘干备用；(2)将细胞悬液与1％低熔点琼脂糖溶液以体积比1∶1混匀，将混合液滴在上述镀膜后的载玻片上；(3)铺胶片以30～45度角靠近细胞悬液，匀速将铺胶片向后拖动，悬液沿铺胶片前端扩展，直至细胞悬液铺成薄膜状，铺胶完成，4℃凝固2～3min。
2.根据权利要求1所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于将10 40ia混合液滴在 上述镀膜后的载玻片上。
3.根据权利要求1所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于所述的铺胶片为质地柔韧、 不透水、无毒性材料。
4.根据权利要求3所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于铺胶片为PVC材料。
5.根据权利要求4所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于所述的铺胶片厚度为 0. 15 0. 35mm0
6.根据权利要求5所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于铺胶片为梯形，两端宽分别 为1cm和0. 7cm，高为4cm，用于面积大小不同胶的铺制。
7.根据权利要求5所述的彗星电泳铺胶方法，其特征在于铺胶片为长条状，长为4cm， 宽为0. 7 1cm。
全文摘要
本发明公开了一种彗星电泳铺胶方法，包括以下步骤(1)将洁净的载玻片在0.2％～1.0％的常熔点琼脂糖溶液中浸没后，37℃烘干备用；(2)将细胞悬液与1％低熔点琼脂糖溶液以体积比1∶1混匀，将混合液滴在上述镀膜后的载玻片上；(3)铺胶片以30～45度角靠近细胞悬液，匀速将铺胶片向后拖动，悬液沿铺胶片前端扩展，直至细胞悬液铺成薄膜状，铺胶完成，4℃凝固2～3min。本发明铺胶方法脱胶率降为零，铺胶速度快，处理大批量样品尤为方便，方法简单易掌握。
文档编号G01N1/28GK101865877SQ201010209930
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者张来军, 步怀宇, 贾敬芬 申请人:西北大学