一种类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法

专利名称：一种类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法
技术领域：
本发明属环境分析化学领域，是一种涉及类固醇类环境内分泌干扰物(雌酮、 17 3 -雌二醇、雌三醇、17 a -乙炔基雌二醇和孕酮)的羟基酮基同步衍生化方法，是气相色 谱_质谱联用仪用于分析此类物质的样品前处理方法和核心技术。
背景技术：
环境内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)又称环境激素 (Environmental Hormones)，是指环境中天然存在或人为排放的，能够通过模拟动物或人 体内的生理生化作用，起到干扰或抑制内分泌系统，并对生殖、神经和免疫系统功能产生影 响的一大类外源性化合物。EDCs具有很强的毒性和生物蓄积性，可通过饮用水和食物链富 集来干扰动物和人类的内分泌系统，在极低浓度下即对生物体产生严重危害。类固醇类环 境内分泌干扰物(Steroids Endocrine Disrupting Chemicals)是EDCs 的一种，是由胆固 醇合成的一种生物活性物质。这类物质化学性质稳定，难以分解，易于在生物体内富集，相 对其他EDCs，有更强的内分泌干扰作用。所以，类固醇类环境内分泌干扰物的研究已成为国 际环境分析化学领域的前沿和热点课题之一。现今，涉及类固醇类环境内分泌干扰物的分析检测方法很多，但就世界范围来 说还处于起步阶段，没有现成的标准分析方法。在实际工作中，气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)以其良好的检测灵敏度，避免过多的溶剂浪费，相对快速的分析过程和较低的运行 成本而受到环境痕量分析工作者的青睐。但是由于类固醇类环境内分泌干扰物本身的弱挥 发性和热不稳定性，加之含有羟基，酮基等极性官能团，直接用GC-MS分析，在气相色谱柱 内容易产生吸附，从而使检出值偏低，灵敏度下降，不利于痕量分析。GC-MS分析此类物质通 常需通过衍生化技术，将其转化成极性较低，更易挥发且热稳定性好的衍生化产物，从而提 高检测灵敏度和改善色谱峰形，达到痕量分析的要求。在衍生化技术研究领域中，类固醇类环境内分泌干扰物单羟基衍生化技术已经取 得一定成果，主要采用三甲基硅烷化(TMS)衍生化技术，研究内容全面，基本满足应用要 求。相比之下，类固醇类环境内分泌干扰物的酮基以其自身的性质决定其衍生化难度高于 羟基，研究酮基衍生化的工作开展较少。因为酮基衍生化研究的匮乏，导致一次性分析含 有羟基与酮基的多组分的工作难于开展。目前，国际上羟基酮基同步衍生化技术发展也有 研究，但其开发极不完善，反应条件差别很大，应用试剂种类繁多。在国内外论文报道的各 种能够同步衍生化羟基酮基的试剂中，以硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroa-cetamide, MSTFA)为基质，加入催化剂(三 甲基碘硅烷(Trimethyliodosilane, TMIS)或碘化铵(Ammonium iodide, NH4I))与还原剂 (二硫赤藓糖醇(DithioerythreitoLDTE)或乙硫醇(ethanethiol))为最常用的衍生化试 剂，但此类方法研究主要集中在临床医学与兴奋剂检测领域，检测物质也很少涉及类固醇 类环境内分泌干扰物，绝大多数检测的物质在结构上与类固醇类内分泌干扰物结构相近， 有一定的参考价值。如Hartman (Hartmann S，Steinhart H. Journal of ChromatographyB，1997,704(1/2) :105 117)应用 MSTFA/TMIS/DTE(1000 2 2，v/v/w)为衍生化试 剂，在反应条件60°C持续15min，检测肉类中雄激素、雌激素、孕激素及其代谢产物时指出， GC-MS检测的灵敏性明显高于单羟基硅烷化法；Magnisali(MagnisaliP，Dracopoulou M， Mataragas M, Dacou—Voutetakis A, Moutsatsou P. Journal of Chromatography A,2008, 1206(2) :166 177)也采用MSTFA/TMIS/DTE，在80°C，35min条件下对类固醇类物质进 行衍生化。目前，关于类固醇类环境内分泌干扰物的羟基酮基同步衍生化在国内尚无专 利。国际上，羟基酮基同步衍生化技术近年也开始应用于环境领域，如Aerni(H.R.Aerni， B. Kobler, B. V. Rutishauser, et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2004, 378(7) 1873 1873)禾口 Rutishauser(B. V. Rutishauser，M. Pesonen, B. I. Escher, et al.Environmental Toxicology and Chemistry，2004，23(4)857 864)以 MSTFA/TMIS/ DTE (1000 2 2, v/v/w)检测污水中类固醇类环境内分泌干扰物，但以上应用对反应条 件要求较高，实验过程比较繁琐。通过对食品安全，兴奋剂检测以及环境领域的综合研究发现，羟基酮基同步衍生 化法存在的不足主要是目前所应用的羟基酮基衍生化法过程过于繁琐，至今对衍生化方 法缺乏系统研究。缺乏针对典型类固醇类环境内分泌干扰物的羟基酮基衍生化法。衍生化 反应需要在加热的条件下进行，加热温度为60 80°C，加热时间为15min lh，催化剂加 入量差别较大，这都使得衍生化实验能耗和成本上升，实验时间较长，在实际环境样品检测 中，加大了样品流失，降低了检测准确度。所以，本发明以环境中贡献量较大且极具危害的五种典型类固醇类环境内分泌干 扰物作为研究对象，包括生物体内天然存在的雌酮(Estrone，El)、17 0-雌二醇(强力求偶 素)(17 0 -Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和孕酮(progesterone，PROG)以及人工 合成的用于口服避孕药物的17 a-乙炔基雌二醇(na-ethynylestradoil，EE2)，研究羟 基酮基同步衍生化方法，使之适用于痕量类固醇类环境内分泌干扰物的检测要求。

发明内容
本发明的目的在于针对目前类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化中 存在的不足，提出一种衍生化新方法。该方法具有实验操作简便、省时、衍生化效果好的优
点o本发明类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如 下步骤(1)在酮基同步衍生化步骤中，将固体状类固醇类环境内分泌干扰物雌酮、17 3 雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标5 a -雄烷分别溶于甲醇中，振荡60s， 配成浓度为1 P g/y L标准储备液，密封后置于-20 -40°C保存；(2)根据需要，用甲醇以及所说的标准储备液配成含有浓度为5pg/L long/的雌 酮、17 0 -雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有浓度为100pg/ u L内标的标准 混合溶液；(3)取100yL步骤⑵所制备的标准混合溶液于1.5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入 氮吹仪，通入高纯氮气缓慢吹干；(4)加入以N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇配成的、其比例为1000 uL 5mg 10 ii L 5mg的衍生化试剂，振荡混合30s后，在20 60°C下反应5 lOmin，以得到雌酮羟基酮基衍生化产物、17 ^ -雌二醇双羟基衍生化产物、 17 a-乙炔基雌二醇双羟基衍生化产物、雌三醇三羟基衍生化产物、孕酮双酮基衍生化产 物；(5)将反应后的样品取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入气相色谱-质 谱联用仪分析。在所述步骤(1)中类固醇类环境内分泌干扰物雌酮、170-雌二醇、17a-乙炔基 雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标5a -雄烷均分别用E1、E2、EE2、E3、PROG和I. S.表示。在所述步骤(3)中，高纯氮气纯度为99. 99%以上；在氮吹仪中吹干时无需加热， 常温条件下即可。在所述步骤(4)中，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤 藓糖醇分别用MSTFA，TMIS与DTE表示，其配成的衍生化试剂MSTFA，TMIS与DTE分配比为 1000 u L 5 lOilL 5mg，以 MSTFA/TMIS/DTE (即 1000 5 10 5，v/v/w)表示，配 成的衍生化试剂固定用量为100 yL。在所述步骤(4)中，雌酮羟基酮基衍生化产物、17 雌二醇双羟基衍生化产物、 17 a -乙炔基雌二醇双羟基衍生化产物、雌三醇三羟基衍生化产物、孕酮双酮基衍生化产物 分别以 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3 和 di_TMS-PR0G 表示。在所述步骤(5)中，气相色谱-质谱联用仪所用色谱柱为Supelco SpB -5或者 J&W Scientific DB-5MS毛细管柱；气相色谱仪以氦气为载气，流速为lmL/min ；不分流方 式进样，进样口温度为280°C，进样体积ly L，升温程序如下
12°C/ min3。C/ min
50°C (2 min) ^ 260°C (8min) ^ 280°C (5min)0在所述步骤(5)中，质谱仪接口温度为280°C，传输线温度为300°C，离子源温度为 250°C，电离方式为电子轰击电离，即EI，电子轰击能量为70eV，溶剂延迟时间为12min。在所述步骤(5)中，气相色谱_质谱联用仪以全扫描模式定性，扫描范围m/z50 600，定量采用选择离子扫描模式，即SIM模式；在SIM模式下，di-TMS-El、di-TMS_E2、 di-TMS-EE2、tri-TMS-E3、di-TMS-PR0G 分别选取 m/z 414、399、309，m/z 416、285、232，m/z 440、425、300，m/z 504、345、311，m/z 458、443、156 作为特征碎片离子，扫描时间为 0. 5 0. 7s。和现有技术相比，本发明具有以下优点或积极效果1、本发明实现了类固醇类环境内分泌干扰物的羟基酮基同步衍生化，极大减小了 因羟基酮基这两类最常出现的官能团所产生的极性问题，适用于含有羟基酮基的类固醇类 环境内分泌干扰物的同步测定。2、确定了理想的催化剂用量，在不影响实验结果的前提下，节约了试剂，降低了实 验成本。3、衍生化反应温度比较低且较为宽泛，常温条件下(20°C )亦可，由于可省去加热 步骤，使衍生化实验变得简便，降低了能耗和成本。
4、衍生化反应时间较短，为5min lOmin，整个衍生化实验操作可在12min内完成。5、所选择的衍生化试剂可作为进样溶剂，简化了实验操作减少了样品流失，提高 了检测效率和准确度。6、在上述条件下，本发明可以将五种类固醇类环境内分泌干扰物E1、E2、EE2、 E3、PROG的羟基酮基同步衍生化，衍生化产物分别为di-TMS-El、di-TMS_E2、di-TMS_EE2、 tri-TMS-E3和di_TMS-PROG。同时EE2并无副产物生成。各衍生化产物的线性相关性良好， 为 0. 99481 0. 99730，线性范围 di-TMS-El、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3 为 lpg/ii L 500pg/ U L, di-TMS-E2 为 0. lpg/ ii L 500pg/ u L, di-TMS-PROG 为 5pg/ ii L 500pg/ u L。仪器 检出限可达0. 01 lpg/uLo本发明可以应用于水体、底泥、生物等样品中类固醇类环境内分泌干扰物El、E2、 EE2、E3、PROG 的 GC—MS 检测。


图1是类固醇类环境内分泌干扰物E1、E2、EE2、E3、PR0G及其衍生化产物的化学
结构图。图2是类固醇类环境内分泌干扰物￡1』2、￡￡2、￡3、？1 ( 浓度为lng/yL以及内 标浓度为lOOpg/yL未衍生化时GC-MS检测的选择离子扫描模式(SIM)色谱图。图3是类固醇类环境内分泌干扰物El、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lng/ u L的衍生 化产物 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG,以及含有浓度为 lOOpg/yL内标经GC-MS检测的选择离子扫描模式(SIM)色谱图。
具体实施例方式下面用实施例并结合附图对本发明作进一步说明。在下述实施例中，所用类固 醇类环境内分泌干扰物雌酮、170雌二醇、17a乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标 5 a -雄烷的纯度均为99%，所用甲醇均为色谱纯。实施例1羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度为 100pg/uL内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF分别为 0. 0759,0. 2326,0. 0670,0. 1143,0. 0491。实施例2羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_30°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度为 100pg/uL内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0760,0.2320,0.0692,0.1145,0.0493。实施例3羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度为 100pg/uL内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 30°C恒温干燥加热环境中反应7min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0757,0.2323,0.0694,0.1147,0.0489。实施例4羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度为 100pg/uL内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；
3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0759,0.2323,0.0693,0.1142,0.0489。实施例5羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_30°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有El、E2、EE2、1E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度 为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG，EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0755,0.2322,0.0691,0.1143,0.0488。实施例6羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并含有浓度为 100pg/uL内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C 反应 5min ；4、取出冷却至室温，振荡30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0757,0.2322,0.0693,0.1145,0.0490。实施例7羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为
1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0756,0.2321,0.0694,0.1147,0.0490。实施例8羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0755,0.2322,0.0694,0.1144,0.0490。实施例9羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_30°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5pg/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。
经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成， RRF(相对响应因子Relative Response Factor，待测物峰面积与内标峰面积的比值)分别 为 0.0759,0.2322,0.0693,0.1143,0.0491。实施例10羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取100i! L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C常温环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 501,65. 067、19. 999、15. 149、18. 780。实施例11羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C 恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 503,65. 065,20. 001,15. 151,18. 782。实施例12羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C常温环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，E1、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 500,65. 067、19. 996、15. 152、18. 779。实施例13羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_30°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C常温环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，E1、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 498,65. 066、19. 998、15. 153、18. 777。实施例14羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C常温环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 503,65. 067、19. 997、15. 150、18. 779。实施例15羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 P g/ P L的标准储备液，密封后置于_20保存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取100 y L骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮吹 仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C常温环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 504,65. 065,20. 002、15. 151、18. 776。实施例16羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C常温环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 504,65. 069、19. 995、15. 146、18. 776。实施例17羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C常温环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 546,65. 070,19. 996,15. 151,18. 781。实施例18
羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为5000pg/L 并含有浓度为lOOpg/y L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的度99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C常温环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 24. 500,65. 070、19. 995、15. 145、18. 783。实施例19羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_40°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 002、130. 135,39. 998,30. 299,37. 566。实施例20羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 005、130. 133,39. 996,30. 300,37. 562。实施例21羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 001、130. 137,40. 001,30. 296,37. 568。实施例22羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 48. 997、130. 136,39. 997,30. 301,37. 567。实施例23羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于40°C恒温干燥加热环境中反应lOmin ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PROG羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 003、130. 132,40. 002,30. 295,37. 569。实施例24羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/ y L的标准储备液，密封后置于_20保存 待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并含 有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C 恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 006、130. 139,39. 995,30. 302,37. 569。实施例25羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 40°C恒温干燥加热环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 006、130. 132,39. 995,30. 303,37. 563。实施例26羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；
2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 lOOii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 20°C 恒温干燥加热环境中反应5min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 006、130. 136,40. 003,30. 301,37. 562。实施例27羟基酮基同步衍生化方法的具体步骤为1、首先，准确称取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及内标10mg分别置于10mL色谱瓶中， 分别加入10mL甲醇，振荡60s，配成浓度各为1 y g/y L的标准储备液，密封后置于_20°C保 存待用；根据需要，用甲醇以及标准储备液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G浓度为lOng/L并 含有浓度为100pg/ii L内标的标准混合溶液；2、取lOOy L步骤(1)所制备的标准混合溶液于1. 5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮 吹仪，通入纯度99. 99%的氮气缓慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振荡 30s 混合后，置于 60°C 恒温干燥加热环境中反应8min ；4、取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。经检测，El、E2、EE2、E3、PR0G羟基酮基均同步衍生化，衍生化产物分别为 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG，EE2 也无副产物生成，RRF 分别为 49. 005、130. 138,39. 994,30. 293,37. 566。
1权利要求
一种类固醇类环境内分泌干扰物羟基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如下步骤(1)在羟基酮基同步衍生化步骤中，将固体状类固醇类环境内分泌干扰物雌酮、17β雌二醇、17α 乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标5α 雄烷分别溶于甲醇中，振荡60s，配成浓度为1μg/μL标准储备液，密封后置于 20～ 40℃保存；(2)根据需要，用甲醇以及步骤(1)所制备的标准储备液配成含有浓度为5pg/L～10ng/L的雌酮、17β 雌二醇、17α 乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有浓度为100pg/μL内标的标准混合溶液；(3)取100μL步骤(2)所制备的标准混合溶液于1.5mL色谱瓶中，将色谱瓶放入氮吹仪，通入高纯氮气缓慢吹干；(4)加入以N 甲基 N 三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇配成的、其比例为1000μL∶5mg～10μL∶5mg的衍生化试剂，振荡混合30s后，在20～60℃条件下反应5～10min，以得到雌酮羟基酮基衍生化产物、17β 雌二醇双羟基衍生化产物、17α 乙炔基雌二醇双羟基衍生化产物、雌三醇三羟基衍生化产物、孕酮双酮基衍生化产物；(5)将反应后的样品取出冷却至室温，振荡混合30s后，取1μL注入气相色谱 质谱联用仪分析。
2.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(1)中类固醇类环境内 分泌干扰物雌酮、17 β -雌二醇、17 α -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及内标5 α -雄烷均分 别用 El、E2、EE2、E3、ra0G 和 I. S.表示。
3.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(3)中，高纯氮气纯度为 99. 99%以上；在氮吹仪中吹干时无需加热，常温条件下即可。
4.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤⑷中，N-甲基-N-三甲 基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇分别用MSTFA，TMIS与DTE表示，其配成 的衍生化试剂 MSTFA, TMIS 与 DTE 分配比为 1000 μ L 5 10 μ L 5mg,以 MSTFA/TMIS/ DTE (即1000 5 10 5，v/v/W)表示，配成的衍生化试剂固定用量为100 μ L。
5.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(4)中，雌酮羟基酮基衍 生化产物、17 β -雌二醇双羟基衍生化产物、17 α -乙炔基雌二醇双羟基衍生化产物、雌三 醇三羟基衍生化产物、孕酮双酮基衍生化产物分别以di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、 tri-TMS-E3 和 di-TMS-PROG 表示。
6.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(5)中，气相色谱-质谱 联用仪所用色谱柱为Supelco SPB -5或者J&W Scientific DB-5MS毛细管柱；气相色谱仪 以氦气为载气，流速为lmL/min ；不分流方式进样，进样口温度为280°C，进样体积1 μ L，升 温程序如下
7.据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(5)中，质谱仪接口温度为 280°C，传输线温度为300°C，离子源温度为250°C，电离方式为电子轰击电离，即EI，电子轰击能量为70eV，溶剂延迟时间为12min。
8.根据权利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步骤(5)中，气相色谱-质谱 联用仪以全扫描模式定性，扫描范围m/z 50 600，定量采用选择离子扫描模式，即SIM模 式；在 SIM 模式下，di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3、di-TMS-PR0G 分别选取 m/z 414、399、309，m/z 416、285、232，m/z 440、425、300，m/z 504、345、311，m/z 458、443、 156作为特征碎片离子，扫描时间为0. 5 0. 7s。
全文摘要
一种类固醇类环境内分泌干扰物(雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮)的羟基酮基同步衍生化方法，其步骤为首先取含有类固醇类环境内分泌干扰物以及内标的标准混合溶液于常温下通入高纯氮气吹干，加入以N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷与二硫赤藓糖醇配成的比例为1000μL∶5～10μL∶5mg衍生化试剂，在20～60℃下反应5～10min，以得到衍生化产物，如附图。该方法具有操作简便、省时、能耗和成本低等优点。可将羟基酮基同步衍生化，各衍生化产物线性相关性良好，仪器检出限可达0.01～1pg/μL，可应用于水体、底泥、生物等样品中类固醇类环境内分泌干扰物的GC-MS检测。
文档编号G01N30/06GK101942006SQ201010223719
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者刘晶靓, 方锴, 潘学军, 王宇, 高建培, 黄斌 申请人:昆明理工大学