专利名称：利用高效液相法快速鉴别冬虫夏草及蛹虫草的制作方法
技术领域：
本发明属于化学成分检测领域，涉及利用高效液相法快速鉴别冬虫夏草及蛹虫草的方法。
背景技术：
冬虫夏草Cordyc印s sinensis (Berk.) Sacc.是由虫生真菌中国被毛孢寄生于鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属(Hirsutella Pat)幼虫而成。冬虫夏草是一种名贵的食用和药用珍品，主要分布于青海、四川、西藏、甘肃和云南的高山林地及亚高山草甸地带。由于处于高寒特殊生境，其寄主蝙蝠蛾又需三年以上完成一个世代，致使虫草资源十分有限，产量不大。加上人工过度采挖，虫草产地生态环境的破坏，我国的冬虫夏草已濒临枯竭。在此背景下，人们大量使用蛹虫草Cordyc印s militaris (L.) Link.代替冬虫夏草入药。蛹虫草又称北冬虫夏草，广泛分布于世界各地，易于栽培。有许多文献报道蛹虫草可作冬虫夏草入药， 甚至代替冬虫夏草。但是，蛹虫草能否作为冬虫夏草的代用品尚待进一步研究，已有的研究和实验表明，冬虫夏草与蛹虫草存在着如下明显差异(1)蛹虫草与冬虫夏草的虫体和侵染菌来源不同。冬虫夏草的昆虫为蝙蝠蛾属(Hepialus Pat)幼虫，已确认的无性型真菌为中国被毛抱 Hirsutella sinensis Liu, Guo，Yu & Zeng (李增智等，菌物系统，2003，22 (1) :161 176，2000，19(1) :60 64 ；蒋毅等，菌物系统，2003，22 (1) :161 176)；蛹虫草，又称北冬虫夏草、北虫草，主要寄生在昆虫蛹和幼虫中，寄主多为表土层昆虫种类，以鳞翅目为主。除此之外，蛹虫草菌还可以寄生在直翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目和半翅目等数十种昆虫，其无性型为蛹虫草拟青霉I^aecilomyces militaris Z. Q. Liang (梁宗琦，食用菌学报，2001， 8(4) 32)。冬虫夏草无性型真菌中国被毛孢最适生长温度为15 20°C，而蛹虫草拟青霉的最适生长温度为20 35°C，寄主的差异和生长温度的差异，使得冬虫夏草和蛹虫草分布的生态环境差异巨大，冬虫夏草主要分布于海拔较高的高寒林区和草甸，在四川、 青海、西藏等地分布在海拔3500 4600m，在云南分布在海拔3850 5000m地区。而蛹虫草属于世界性广布种，对海拔要求不严格。因而，它们两者生物学的差异是显而易见的。 (2)蛹虫草与冬虫夏草的化学成分存在差异，从已有报道上看，北虫草里含有冬虫夏草的一些成分，因现在设备条件、分析手段等原因，不能说其成分完全搞清楚了，例如许多微量的化学成分，就目前的技术手段和研究还没有完全弄清楚(林群英等，微生物学通讯，2006， 33(4):巧4 157)。中药材中的有效化学成分主要为次生代谢产物，其形成受到很多生态因子的影响。药用植物中同一品种在不同地区都能生长，但成分差异很大。同一品种在同一生态气候条件下成分因土壤、施肥管理措施不同，其质量也有差异。因而中药材的应用比较讲究道地药材。蛹虫草要作为冬虫夏草的代用品，其成分研究是前提，应用现代分析测试手段对其成分进行研究，要从中药指纹图谱上与冬虫夏草进行研究与比较。但仅凭对蛹虫草中的几个成分进行测定，与已经报道的冬虫夏草的成分进行比较，只有几种成分相近，就得出蛹虫草可代替冬虫夏草的结论是值得商榷的。
目前市场上关于虫草的产品鱼目混珠，打着冬虫夏草的牌子，用价格相对低廉得多的蛹虫草替代冬虫夏草进行产品生产销售，使得市场混乱，消费者权益得不到保障，因而迫切需要建立一套高效、快速鉴别冬虫夏草和蛹虫草的方法，目前未见关于利用高效液相色谱法区分冬虫夏草和蛹虫草的文献和专利。相关申请的专利有许瑞祥等发明的“鉴别冬虫夏草的方法”(中国发明专利专利申请号99106135. 7)和“鉴别冬虫夏草的基因序列及方法”(中国发明专利申请号00109084. 4)，以上发明专利均为利用分子生物学手段进行冬虫夏草和其他虫草的区分，操作繁杂，但耗时较长，其费用较高，不便于推广应用。鉴于保健品市场中主要是以蛹虫草作为冬虫夏草的伪品，因而建立一种能快速识别和能鉴别冬虫夏草和蛹虫草的方法迫在眉睫。本发明利用高效液相色谱法对冬虫夏草和蛹虫草进行快速鉴别。
发明内容
本发明提供了一种利用高效液相法对冬虫夏草和蛹虫草进行快速鉴别的方法。发明内容如下1操作步骤1. 1样品的粉碎利用高速粉碎机粉碎样品，过60目筛子，备用。1.2蛹虫草供试液的配制称取样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入:3ml 20% 甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复以上操作2次，合并上清液。最后定容至10ml。1. 3冬虫夏草溶液的配制称取冬虫夏草样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入 3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复以上操作2次，合并上清液。最后定容至10ml。1. 4标准溶液的配制称取0. 00200g虫草素，精确到0. OOOOlg，溶解于20%甲醇， 定容至50ml。1. 5进样样品准备取0. 800ml虫草素标准溶液作为1号样；取0. 800ml供试液 (蛹虫草)作为2号样；取0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草溶液为3号样，超
声混勻。1. 6高效液相色谱法进行检测操作步骤1. 5中的样品。1. 7图谱的分析根据HPLC图谱峰图保留时间定性，表明冬虫夏草和蛹虫草中含有虫草素，但冬虫夏草样品虫草素保留时间稍早于蛹虫草中虫草素的保留时间，混合样品中冬虫夏草虫草素和蛹虫草虫草素从图谱上可以区分开，两个峰分离度达到90%以上，可能来源至冬虫夏草的虫草素和蛹虫草的虫草素在结构上有着一定的差异，但相关方面未见报道。虽然学术界对此没有定论，但这并不影响本发明利用这个差异性来鉴别冬虫夏草和蛹虫草。2高效液相法色谱条件2. 1 仪器戴安ULTIMATE 3000高效液相色谱仪(LPG-3400A四元梯度泵，WPS-3000SL自动进样器，PDA-3000 二极管阵列检测器，TCC-3000柱温箱，戴安原装ACCLAIM C18色谱柱，5 μ m， 4. 6 X 250mm，“变色龙”控制分析色谱工作站软件)；SK5200超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；高速万能粉碎机FW-100 (北京中兴伟业仪器有限公司)。虫草素对照品购自中国药品生物制品检定所，纯度为99 %以上；甲醇为色谱纯 (Fisher Scientific)；重蒸水。Η3Ρ04(磷酸)为分析纯。2. 2检测波长及色谱条件流动相甲醇-0. 磷酸水溶液为流动相(14. 8 85. 2)；流速1. OmL/min ；检测波长:260nm ；柱温30°C，进样量10 μ 1。本发明的关键点在于利用正品冬虫夏草和虫草素作为标准来区分虫草样品是否为正品的冬虫夏草。来源至冬虫夏草的虫草素和源至蛹虫草的虫草素在特定的色谱条件下可以发生分离。本发明操作简便，鉴别快速准确，本发明可应用到鉴别冬虫夏草和蛹虫草实际应用中。
图1虫草素标准品(1号进样瓶)购买至中国药品生物制品鉴检定所，批次号为 858-200202，称取0. 00200g虫草素标准品，20%甲醇溶解定容至50ml，于本发明给定的色谱条件下进样1(^1，详见图1。图2江门市新会区益元虫草培植场蛹虫草虫草素图谱O号进样瓶)称取蛹虫草样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入:3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心 5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml。于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图2。图3青海玉树县冬虫夏草虫草素峰图(3号进样瓶)称取冬虫夏草样品(青海玉树县)0. 2000g至于5ml离心管中，加入:3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图3。图4青海玉树县冬虫夏草和蛹虫草混合样品虫草素分离图谱0号进样瓶)取 0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(青海玉树县)混合溶液于4号进样瓶中，超声混勻，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图4。图5西藏巴青县冬虫夏草虫草素峰图(5号进样瓶)称取冬虫夏草样品(西藏巴青县)0. 2000g至于5ml离心管中，加入:3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图5。图6西藏巴青县冬虫夏草和蛹虫草混合样品虫草素分离图谱(6号进样瓶)取 0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(西藏巴青县)混合溶液于4号进样瓶中，超声混勻，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图6。图7云南丽江市冬虫夏草虫草素峰图(7号进样瓶)称取冬虫夏草样品(云南丽江市)0. 2000g至于5ml离心管中，加入:3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图7。图8云南丽江市冬虫夏草和蛹虫草混合样品虫草素分离图谱(8号进样瓶)取0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(云南丽江市)混合溶液于4号进样瓶中，超声混勻，于本发明给定的色谱条件下进样10 μ 1，详见图8。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。实例一青海玉树县冬虫夏草虫草素和蛹虫草虫草素的区分1冬虫夏草和蛹虫草样品的准备采自青海玉树县冬虫夏草，经中国科学院昆明植物研究所臧穆先生鉴定为正品冬虫夏草，粉碎过60目筛子，备用。购买自江门市新会区益元虫草培植场的蛹虫草子实体，粉碎过60目筛子，备用。2样品溶液的制备2. 1蛹虫草供试液的制备称取蛹虫草样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2 次。合并提取液定容至10ml。2.2冬虫夏草溶液的配制称取冬虫夏草样品0.2000g至于5ml离心管中，加入 3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml。2. 3标准溶液的配制称取0. 00200g虫草素20%甲醇溶解定容至50ml。3进样样品的准备0. 800ml虫草素标准溶液于1号进样瓶中；取0. 800ml供试液 (蛹虫草)于2号进样瓶中；取0. 800ml冬虫夏草(青海玉树县)溶液于3号进样瓶中；取 0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(青海玉树县)溶液于4号进样瓶中，超声混勻。4图谱分析由图1、图2、图3和图4可知，青海玉树县所产冬虫夏草提取的虫草素的峰保留时间为11.505min，蛹虫草虫草素的峰保留时间为11. 873min，冬虫夏草虫草素的出峰时间早于蛹虫草虫草素，混合样品见图4，两个不同来源的虫草素的分离程度达到98%，两峰基本分离开，出峰时间分别为11. 520min和11. 867min。实例二西藏巴青县冬虫夏草虫草素和蛹虫草虫草素的区分1冬虫夏草和蛹虫草样品的准备采自西藏巴青县冬虫夏草，经中国科学院昆明植物研究所臧穆先生鉴定为正品冬虫夏草，粉碎过60目筛子，备用。购买自江门市新会区益元虫草培植场的蛹虫草子实体，粉碎过60目筛子，备用。2样品溶液的制备2. 1蛹虫草供试液的制备称取蛹虫草样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2 次。合并提取液定容至10ml。2.2冬虫夏草溶液的配制称取冬虫夏草样品0.2000g至于5ml离心管中，加入 3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml。
2. 3标准溶液的配制称取0. 00200g虫草素20%甲醇溶解定容至50ml。3进样样品的准备取0.800ml冬虫夏草(西藏巴青县)溶液于5号进样瓶中；取 0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(西藏巴青县)溶液于6号进样瓶中，超声混勻。4图谱分析由图1、图2、图5和图6可知，西藏巴青县所产冬虫夏草提取的虫草素的峰保留时间为11.507min，蛹虫草虫草素的峰保留时间为11. 873min，冬虫夏草虫草素的出峰时间早于蛹虫草虫草素，混合样品见图6，两个不同来源的虫草素的分离程度达到90%，两峰基本分离开，出峰时间分别为11. 478min和11. 823min0实例三云南丽江市玉龙雪山冬虫夏草虫草素和蛹虫草虫草素的区分1冬虫夏草和蛹虫草样品的准备采自云南丽江市玉龙雪山冬虫夏草，经中国科学院昆明植物研究所臧穆先生鉴定为正品冬虫夏草，粉碎过60目筛子，备用。购买自江门市新会区益元虫草培植场的蛹虫草子实体，粉碎过60目筛子，备用。2样品溶液的制备2. 1蛹虫草供试液的制备称取蛹虫草样品0. 2000g至于5ml离心管中，加入3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2 次。合并提取液定容至10ml。2.2冬虫夏草溶液的配制称取冬虫夏草样品0.2000g至于5ml离心管中，加入 3ml 20%甲醇溶液，超声处理lh，10000转/分离心5min，取上清液至IOml容量瓶中，再重复2次。合并提取液定容至10ml。2. 3标准溶液的配制称取0. 00200g虫草素20%甲醇溶解定容至50ml。3进样样品的准备取0. 800ml冬虫夏草(云南丽江市)溶液于7号进样瓶中；取 0. IOOml供试液(蛹虫草)+0. 400ml冬虫夏草(云南丽江市)溶液于8号进样瓶中，超声混勻。4图谱分析由图1、图2、图7和图8可知，云南丽江市玉龙雪山所产冬虫夏草提取的虫草素的峰保留时间为11.530min，蛹虫草虫草素的峰保留时间为11. 873min，冬虫夏草虫草素的出峰时间早于蛹虫草虫草素，混合样品见图8，两个不同来源的虫草素的分离程度达到92%， 两峰基本分离开，出峰时间分别为11. 493min和11. 868min。
权利要求
1.利用高效液相法快速鉴别冬虫夏草及蛹虫草，其特征在于该方法包括(1)进样样品的配制方法利用已知的冬虫夏草提取液与未知样品进行一定比例的混合；(2)图谱的分析混有冬虫夏草和蛹虫草的样品，因虫草素来源不同，而使得HPLC图谱上两个峰发生了分离，分离度大于90%，且冬虫夏草虫草素的保留时间早于蛹虫草虫草素；(3)HPLC色谱条件甲醇-0.磷酸水溶液为流动相(14.8 85. 2)；流速1. OmL/ min ；检测波长:260nm ；柱温:30°C。
全文摘要
本发明涉及一种利用高效液相法快速鉴别冬虫夏草及蛹虫草的方法。利用不同来源(冬虫夏草和蛹虫草)的虫草素在一定的色谱条件下可发生分离，选取正品的冬虫夏草为标准品，用以鉴定未知样品是冬虫夏草或者是蛹虫草，不涉及其它种类的虫草鉴别。操作方法取0.1ml供试液+0.4ml冬虫夏草提取液，混匀，进样检测，色谱条件为C18柱；甲醇-0.1％磷酸水溶液为流动相(14.8∶85.2)；流速1.0mL/min；检测波长260nm；柱温30℃。两个不同种(冬虫夏草和蛹虫草)的虫草素峰分离度达到90％以上，而来源不同地理种源的冬虫夏草混合样的虫草素的峰不发生分离，因此可快速而准确的鉴别冬虫夏草和蛹虫草。
文档编号G01N30/36GK102327298SQ201010226749
公开日2012年1月25日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者曾文波, 杨俊媛, 虞泓, 陈自宏 申请人:云南大学中草药生物资源研究所