专利名称：鉴别冬虫夏草真伪的pcr引物对、试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对、试剂盒及方法。
背景技术：
冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berkeley) Saccardo为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属(Hepialus)幼虫上形成的虫生子囊真菌，为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草的子座及其寄主鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合物，主要分布青藏高原，菌性属于低温型，生长在海拔3，800m的雪线以上，性甘平，补肺益肾，止血化痰，用于久咳虚喘，劳咳咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛，是我国传统的名贵中药材。由于冬虫夏草具有特殊的药理作用和治疗功效，市场上出现了许多与冬虫夏草形态相似的伪品，其中亚香棒虫草(Cordyc印s hawkesii Gray)是最为常见的伪品。亚香棒虫草又称霍克斯虫草，其寄主为鳞翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾属(Napialus)幼虫，分布于湖南、江西、湖北、安徽、浙江、福建、广东等省山区及丘陵低海拔区域。亚香棒虫草与冬虫夏草在形态上相似，常被不法商贩冒充冬虫夏草出售。此外，北虫草Cordyc印s militaris (Li) Link, 又称蛹虫草也是最为常见的伪品之一。北冬虫夏草，为同属真菌蛹虫草寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上的复合物，菌性属中温型，生长在低海拔的平原地域，主要分布在东北、华北、西北等省区，民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。冬虫夏草由于生长地理的特殊要求，以及严格的寄生性，造成其资源极其稀少，兼之采收的不易更使得野生冬虫夏草显得十分珍贵，价格昂贵。而伪虫草在名称、外形上与之相似，因而常作为冬虫夏草的混淆品出现在药材市场。因而在本领域需要有一种特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法。本发明为了解决上述技术问题所技术方案是提供一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对。该鉴别冬虫夏草真伪的PCR(聚合酶链式反应)引物对的序列为上游引物(SEQID No. 1) :5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，；下游引物(SEQID No. 2) :5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。本发明还提供一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR试剂盒。该PCR试剂盒包括从提取的样品DNA中PCR扩增待测样品DNA片段的引物对，包括上述的引物对。当然，该PCR试剂盒还可包括一般的PCR扩增所需的各种标准试剂。优选采用超保真试剂。本发明另外还提供了一种鉴别冬虫夏草的方法。该方法包括以下步骤a、获取样品总DNA;b、采用上述的引物对在PCR仪上进行PCR扩增；C、对扩增产物进行测序，并与SEQ ID No. 3所示的序列比对，其中的与SEQ IDNo. 6对应部分100%符 合者为真品，否则为伪品。100%符合者为真品，否则为伪品。其中，上述方法步骤b所述的PCR扩增的条件为
预变性98 °C, Imin 变性98 °C, IOsec 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec .
延伸72 °C, 5min其中，上述方法步骤b所述的PCR扩增的体系为PCR 扩增反应体积为 50 μ 1，其中 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. Ομ 1,7. 4μ 1 的 5MBetaine，上、下游引物(10ym/L)各 1· 0μ 1，DNA 模板 2· 0μ 1。为确保PCR扩增时序列的正确性，PCR试剂优选采用超保真试剂2XPhusi0n Master Mix (产品编号F-532L，购自NEB公司)，5M Betaine (产品编号B 0300)购自 sigma公司ο本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到有效的PCR引物对。实验表明，本发明引物对能够有效地扩增冬虫夏草及其常见赝品的目标片段，并且能够准确地鉴别，使用该引物对进行鉴别的方法是特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法，具有很好的应用前
旦
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图1、本发明的引物设计示意图，其中有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合的位置。只有下划线的部分为主要用于比对的579个碱基的区域为可信区间。图2、使用本发明引物对扩增的玉树冬虫夏草18S片段序列与亚香棒虫草、北虫草 18S序列片段比较结果，2-A和2-B的结果是连续的。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
对本发明进行具体说明。实施例一检测PCR引物的设计与合成及对样品进行检验1、设计PCR扩增引物根据GenBank上公开登录的冬虫夏草18s核糖体基因序列信息进行引物的设计 (设计引物的部分参见图1)。序列信息为GenBank :HM135169(共 1741bp)，(Cordyceps sinensis, 18S ribosomal RNA, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/HM135169)。在446-466 设计上游引物，命名为CC18s_F。序列为5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，(SEQ ID No. 1)；在1179-1198 设计下游引物，命名为CC18s_R。序列为5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT3，(SEQ ID No. 2)。扩增的目标序列为SEQ ID No. 3所示(446-1198)。优选中间的共计579个碱基的区域为可信区间(参见图1中下划线部分)2、提取虫草DNA冬虫夏草为本公司购自 青海玉树；亚香棒虫草购自浙江；北虫草购自辽宁；由中科院西北高原生物研究所中药鉴定室鉴定。提取虫草DNA所用试剂为“柱式真菌DNAout基因提取试剂盒”(产品编号 70901-50)购自北京天恩泽基因科技有限公司，按照说明书进行提取；准确称取干燥样品lOOmg，液氮研磨成粉后转移到1. 5mL离心管中，加入ImL溶液 A充分混勻，65°C保温30分钟；12，OOOrpm离心3分钟；转移上清到新离心管中，加入等体积的溶液B，混勻，冰浴5分钟；室温12，OOOrpm离心3分钟，转移上清到新的离心管中；力口入0. 2mL氯仿，振荡30秒混勻；室温12，OOOrpm离心3分钟，转移上清到新离心管中；加入 1. 5倍体积的溶液C，混勻，将混合液转移到离心吸附柱中，室温放置5分钟；12，OOOrpm离心1分钟；加入0. 7mL洗柱液，室温离心1分钟；加入0. 3mL洗柱液重复一次；空甩1分钟去除残留液体；将离心柱放置在一新的1. 5mL离心管中，加入30uL通用洗脱液。室温放置 5分钟后离心1分钟，即获得DNA溶液，-20°C保存。3、PCR扩增目标序列为确保扩增的正确性，PCR试剂采用超保真试剂2XPhusi0n Master Mix (产品编号F-532L，试剂购自 NEB 公司)，5M Betaine (B 0300)购自 sigma 公司。PCR反应体系如下表1 PCR反应体系
组分.体积(μ )"ddH^O^
2χ Phusion MMix25.0
5M Betaine7.4
SEQ ID No. 1 (ΙΟμηι/L)1.0
SEQ ID No. 2 (ΙΟμηι/L)1.0
_DNA2.0
Total Volume (总体积)50PCR反应条件如下
预变性98 °C,Imin 变性98 °C，IOsec ^ 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec -
延伸72 °C,5min
PCR反应结束后，取各PCR反应产物3 μ 1加1 μ 1加样缓冲液(6XLoading Buffer)在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电压100V，电泳时间30-40min。紫外光下观察电泳结果，可使用凝胶成像系统拍照记录。扩增产物电泳后凝胶回收试剂盒回收纯化，进行测序(英骏生物有限公司)。测序结果，玉树冬虫夏草(SEQ ID No. 4)，亚香棒虫草(SEQ ID No. 5)，北虫草(SEQ ID No. 6)
4、测序结果分析 待扩增的冬虫夏草标准目标序列长度为753个碱基。测序时，以上游引物和下游引物作为测序反应的引物进行测序，由于进行的是PCR产物直接测序，最初的50-70个碱基可能出现的错读现象。因此，需要剔除首、尾各70个碱基序列，然后进行对比。我们选择中间的共计579个碱基的区域为可信区间(图1中下划线部分)，进行比较。应用DNAMAN序列比对软件，将玉树冬虫夏草、亚香棒虫草、北虫草的测序结果与 GenBank登录的冬虫夏草(HM135169)的18S序列进行比对，结果显示，玉树冬虫夏草与冬虫夏草相应序列的相似度均为100% ；亚香棒虫草与冬虫夏草18S序列的相似度为91. 39%, 北虫草的相似度为91. 74%。具体比对结果参照图2。本发明PCR扩增引物对可以有效地鉴别冬虫夏草及其混淆品北虫草和亚香棒虫草。可以以适量的PCR扩增引物对，添加进行PCR的必要试剂，制备成PCR试剂盒，用于快速的冬虫夏草PCR扩增鉴别。
权利要求
1.鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对，其特征在于所述引物对的序列为 上游引物5’ CAATAAATACCGATACAGGGC 3’ ；下游引物5’ TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。
2.鉴别冬虫夏草真伪的PCR试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物对。
3.鉴别冬虫夏草真伪的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a、获取样品总DNA；b、采用权利要求1所述的引物对在PCR仪上进行PCR扩增；C、对扩增产物进行测序，并与SEQ ID No. 3所示的序列比对，其中的与SEQ ID No. 6对应部分100%符合者为真品，否则为伪品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 步骤b所述的PCR扩增的条件为预变性98 °C, Imin变性98 °C, IOsec退火60°C，20sec 30 cycles延伸72°C，30sec .延伸72 °C，5min 。
5.根据权利要求3或所述的方法，其特征在于； 步骤b所述的PCR扩增的体系为每 50μ IPCR 扩增反应体积中包含 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. 0 μ 1, 7. 4 μ 1 的 5MBetaine, 10 μ m/L 的上、下游引物各 1. 0 μ 1，DNA 模板 2. 0 μ 1。
全文摘要
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及冬虫夏草真伪的鉴别。本发明要解决的技术问题是提供一种特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法。本发明为了解决上述技术问题所技术方案是提供一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对、试剂盒及方法。引物对的序列为上游引物5’CAATAAATACCGATACAGGGC 3’；下游引物5’TGTC TGGACCTGGTGAGTTT 3’。本发明引物对能够有效地扩增冬虫夏草及其常见赝品的目标片段，并且能够准确地鉴别，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102226217SQ201110147608
公开日2011年10月26日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者张雪峰, 徐丽 申请人:张雪峰