专利名称：基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，尤其是 一种可以提供较大照明能量，并且对样品进行多方位照明成像的光激活定位显微成像系 统。
背景技术：
远场光学荧光显微镜具有非接触性、无损伤性及可探测样品内部等优点，其一直 是生命科学中常用的观测工具。但是由于衍射极限的存在，即使用油浸物镜提高数值孔径， 传统的宽场光学显微镜横向分辨率约为200nm，无法用于观察细胞内分子尺度的动态和结 构特征。近年来，光激活定位显微成像技术利用光激活荧光蛋白特性以及单分子荧光成像 的高定位精度突破了光学分辨率极限，达到了 20nm的分辨率。光激活定位显微成像的基本原理是利用低能量的激活光照射荧光蛋白，单次仅激 活视野下稀疏的荧光蛋白，再使用激发光进行照射，此时仅处于激活态的荧光蛋白被激发 发出荧光。通过控制激活光光强和激发光光强，实现每个衍射极限区域内每个时刻至多有 一个荧光分子发光。对采集到的单分子信号进行高斯拟合，精确定位各单分子。当能精确 定位这些分子后，用激发光长时间照射，直至所有激活的荧光蛋白被漂白。然后按照上述步 骤进入下一次循环，利用激活光和激发光定位其他的荧光分子。当视野内的荧光蛋白都被 漂白后就得到了视野内荧光蛋白精确的定位信息，然后将这些荧光蛋白叠加在一张图中即 得到了比传统光学显微成像分辨率高约10倍的超分辨显微图像。根据光激活定位显微成像技术的成像原理，其探测到的是单个荧光蛋白分子发射 的光强信号。单个荧光蛋白分子的信号很微弱，容易受到背景噪声的影响。然而探测到的 单分子信号的信噪比直接影响分辨率，更高的信噪比可以得到更高的分辨率。全内反射产生的倏逝场在轴向上只存在于百纳米的范围内，并且场强随着距离的 增加呈指数衰减。利用倏逝场进行照明时，只有百纳米范围内的荧光蛋白被激活激发，而超 过这个范围内的荧光蛋白则不受影响，其可以提供更高的信噪比。所以在一般的光激活定 位显微成像系统中，利用全内反射产生的倏逝场进行照明，以减少背景噪声对分辨率的影 响。现有的光激活定位显微成像系统一般利用大数值孔径物镜产生倏逝场进行照明， 其缺点是1)大数值孔径增加了系统的成本；2)照明光路和探测光路重合，不易于调节光 路；3)根据全内反射原理，只能探测贴壁生长的细胞的下表面，而无法探测具有生物功能 的细胞上表面和侧面。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，结合微纳光纤技术，设计了一种基于微纳 光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，可以提供较大照明能量，并且能对样品进 行多方位照明成像。
本发明的技术方案为基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，主要由激活激光器11、 成像激光器12、中性滤光片(9，10)、快门及其控制器(7，8)、反射镜6、二色镜5、透镜4、微 纳光纤倏逝场照明器1、三维微纳调节架3、微纳光纤探针2、倒置荧光显微镜14、子倍增 EMCCD探测器13组成；激活激光器11发射的激活激光依次经过中性滤光片10、快门及其控 制器8、反射镜6、二色镜5、透镜4入射到微纳光纤倏逝场照明器1 ；成像激光器12发射的 成像激光依次经过中性滤光片9、快门及其控制器7、二色镜5、透镜4入射到微纳光纤倏逝 场照明器1 ；微纳光纤探针2安装在三维微纳调节架3上，微纳光纤倏逝场照明器1的微纳 光纤段放置在倒置荧光显微镜14的样品池15内，用微纳光纤探针2拨动微纳光纤倏逝场 照明器1从而调节微纳光纤倏逝场照明器1的位置，电子倍增EMCXD探测器13采集倒置荧 光显微镜14的物镜收集到荧光信号。激活激光器11用于发出激活激光，根据使用的荧光 蛋白的激活波段选用适当波长的激活激光器；成像激光器12用于发出成像激光，根据使用 的荧光蛋白的激发波段选用适当波长的成像激光器；中性滤光片10用于控制激活激光的 强度；中性滤光片9用于控制成像激光的强度；快门及其控制器8用于控制激活激光的照 射时间；快门及其控制器7用于控制成像激光的照射时间；反射镜6用于改变激活激光的 传播方向；二色镜5对上述激活光透射，二色镜5对上述成像光反射，并且将上述激活光和 成像光的传播方向调节至一致；透镜4用于将激活光和成像光耦合入微纳光纤倏逝场照明 器；微纳光纤倏逝场照明器1用于传导上述激活光和成像光，同时产生倏逝场对样品进行 激活激发；通过控制三维微纳调节架3来调节微纳光纤探针2的三维位置，从而控制上述微 纳光纤倏逝场照明器1在样品池内的位置、深度和角度；探测器电子倍增EMCXD13用于采集 倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。所述的微纳光纤倏逝场照明器1，将倏逝场照明器制作在单根光纤上，其特征在 于所述的单根光纤包括普通光纤段16、拉锥段17和微纳光纤段18三段，普通光纤段16 为普通的单模光纤，微纳光纤段18直径在100-300nm范围内，普通光纤段用于耦合和传导 入射光；拉锥段用于将入射光从普通光纤段耦合入微纳光纤段；微纳光纤段用于产生倏逝 场；微纳光纤段的一端面镀全反射膜，当光传输至微纳光纤镀全反射膜端面时被全部反射， 端面无出射光；微纳光纤段的表面镀薄层金膜，可以有效的防止周围环境散射颗粒对表面 倏逝场分布的影响。本发明的特点为1)相对于传统的光激活定位显微成像系统，其将照明光路和成 像光路分离开，光路调节更简单；2)不需要使用大数值孔径的物镜，减少了系统的成本；3) 通过控制微纳光纤的位置可以对细胞各表面进行成像；4)通过选用适当直径的微纳光纤 可以得到较强的倏逝场。
图1为基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统结构示意图。图2为微纳光纤三维控制示意图。图3为微纳光纤照明器结构示意图。图4为微纳光纤及其表面光强分布示意图。图5为光激活定位成像过程中激活成像时序图。
具体实施例方式如图1所示，本发明主要由激活激光器11、成像激光器12、中性滤光片(9，10)、快 门及其控制器(7，8)、反射镜6、二色镜5、透镜4、微纳光纤倏逝场照明器1、三维微纳调节架 3、微纳光纤探针2、倒置荧光显微镜14、电子倍增EMCXD探测器13组成；激活激光器11发 射的激活激光依次经过中性滤光片10、快门及其控制器8、反射镜6、二色镜5、透镜4入射 到微纳光纤倏逝场照明器1 ；成像激光器12发射的成像激光依次经过中性滤光片9、快门及 其控制器7、二色镜5、透镜4入射到微纳光纤倏逝场照明器1 ；微纳光纤探针2安装在三维 微纳调节架3上，微纳光纤倏逝场照明器1的微纳光纤段放置在倒置荧光显微镜14的样品 池15内，用微纳光纤探针拨动微纳光纤倏逝场照明器从而调节微纳光纤倏逝场照明器的 位置，电子倍增EMCCD探测器13采集倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。激活激 光器11用于发出激活激光，根据使用的荧光蛋白的激活波段选用适当的波长的激活激光 器；成像激光器12用于发出成像激光，根据使用的荧光蛋白的激发波段选用适当波长的成 像激光器；中性滤光片10用于控制激活激光的强度；中性滤光片9用于控制成像激光的强 度；快门及其控制器8用于控制激活激光的照射时间；快门及其控制器7用于控制成像激 光的照射时间；反射镜6用于改变激活激光的传播方向；二色镜5对上述激活光透射，二色 镜5对上述成像光反射，并且将上述激活光和成像光的传播方向调节至一致；透镜4用于将 激活光和成像光耦合入微纳光纤倏逝场照明器；微纳光纤倏逝场照明器1用于传导上述激 活光和成像光，同时产生倏逝场对样品进行激活激发；如图2所示，通过控制三维微纳调节 架3来调节微纳光纤探针2的三维位置，从而控制上述微纳光纤倏逝场照明器1在样品池 内的位置、深度和角度；探测器电子倍增EMCXD13用于采集倒置荧光显微镜14的物镜收集 到荧光信号。实施例一利用基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统实现生物 细胞的超分辨显微成像。如图1为利用基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统实现生物 细胞的超分辨显微成像的系统结构示意图。实验样品为荧光蛋白dronpa标记的hek293细 胞的BK通道的β亚基。激活激光的波长为405nm，成像激光的波长为473nm。反射镜6和 二色镜5将激活光和成像光的传播方向调节至相同。透镜4用于将激活光和成像光耦合入 微纳光纤倏逝场照明器1。三维微纳调节架3及其微纳光纤探针2用于调节微纳光纤倏逝 场照明器1的三维位置，其具体结构示意图如图2所示。中性滤光片10、快门及其控制器8 分别用于控制激活激光的光强和照射时间。中性滤光片9、快门及其控制器7分别用于控制 成像激光的光强和照射时间。如图3所示，所述的微纳光纤倏逝场照明器1，将倏逝场照明器制作在单根光纤 上，其特征在于所述的单根光纤包括普通光纤段16、拉锥段17和微纳光纤段18三段，普 通光纤段16直径dl = 125 μ m,拉锥段17长度L = 10 μ m,微纳光纤段18直径为d2 = 200nm，普通光纤段用于耦合和传导入射光；拉锥段用于将入射光从普通光纤耦合入微纳光 纤段；微纳光纤段用于产生倏逝场；微纳光纤段的一端面镀全反射膜，当光传输至微纳光 纤镀全反射膜端面时被全部反射；微纳光纤段的表面镀厚度为50nm的金膜，可以有效的防 止周围环境中的散射可以对表面倏逝场分布的影响。直径为200nm的微纳光纤段18及其表面光强分布如图4所示。 将样品细胞置于倒置显微镜14的载物台上，移动载物台将需要成像的细胞移入 视野内，然后调节三维微纳调节架3将微纳光纤倏逝场照明器移入视野内，利用倏逝场激 活激发荧光蛋白dronpa。根据样品实际情况选取合适激活激光光强，激活激光照射时间， 成像激光光强，成像激光照射时间，并通过中性滤光片(10，9)和快门及其控制器(8，7)实 现上述参数的控制。成像过程中激活成像时序如图5所示。根据样品实际情况选取合适的 EMCCD采图参数，如曝光时间和增益等，然后开始采集一系列成像图。最后经过后期的数据 处理，精确定位采集到的单分子，并进行叠加得到最终的超分辨显微成像重构图。
权利要求
基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，主要由激活激光器、成像激光器、中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜、微纳光纤倏逝场照明器、三维微纳调节架、微纳光纤探针、倒置荧光显微镜、探测器电子倍增EMCCD组成；其特征在于激活激光器发射的激活激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜入射到微纳光纤倏逝场照明器；成像激光器发射的成像激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、二色镜、透镜入射到微纳光纤倏逝场照明器；微纳光纤探针安装在三维微纳调节架上，微纳光纤倏逝场照明器的微纳光纤段放置在倒置荧光显微镜的样品池内，用微纳光纤探针拨动微纳光纤倏逝场照明器从而调节微纳光纤倏逝场照明器的位置，探测器电子倍增EMCCD采集倒置荧光显微镜的物镜收集到荧光信号。
2.根据权利要求1所述的基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，其 特征在于将倏逝场照明器制作在单根光纤上，所述的单根光纤包括普通光纤段、拉锥段和 微纳光纤段三段，普通光纤段为普通的单模光纤，微纳光纤段直径在100-300·范围内，普 通光纤段用于耦合和传导入射光；拉锥段用于将入射光从普通光纤耦合入微纳光纤段；微 纳光纤段用于产生倏逝场；微纳光纤段的一端面镀全反射膜，当光传输至微纳光纤镀全反 射膜端面时被全部反射，端面无出射光；微纳光纤段的表面镀薄层金膜。
全文摘要
本发明涉及一种基于微纳光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像系统，连接如下激活激光器发射的激活激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜入射到微纳光纤倏逝场照明器；成像激光器发射的成像激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、二色镜、透镜入射到微纳光纤倏逝场照明器；微纳光纤探针安装在三维微纳调节架上，微纳光纤倏逝场照明器的微纳光纤段放置在倒置荧光显微镜的样品池内，用微纳光纤探针拨动微纳光纤倏逝场照明器从而调节其位置，探测器电子倍增EMCCD采集倒置荧光显微镜的物镜收集到荧光信号。本发明将照明光路和成像光路分离开，光路调节更简单；不需要使用大数值孔径的物镜减少系统的成本；通过控制微纳光纤倏逝场照明器的三维位置对细胞各表面进行成像。
文档编号G01N21/64GK101949848SQ20101027552
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者付玲, 吕晓华, 曾绍群, 骆清铭, 黄振立 申请人:华中科技大学