专利名称：用于探测植物中的昆虫诱导的损害的非侵入性方法和设备的制作方法
技术领域：
本公开内容大体上涉及用于植物的昆虫产生的损害的非侵入性探测的方法和装置。背景在美国，棉生产在过去二十年中已经经历了深刻的变化。例如，棉铃象虫的成功根除以及Bt-转基因棉的推广已经帮助将乔治亚州的棉的英亩数从1996年的125,000英亩增加至超过1百万英亩。此外，害虫治理的进步已经帮助将化学杀虫剂施用从1996年的超过15次/年减少至2007年的小于3次。然而，虫害的复杂性也已经变化，并且在以前不重要的虫害，例如椿象，现在威胁到生产能力以及纤维品质。椿象对正在生长的棉铃的损害在最近已经直接与降低的棉纤维品质相关。椿象通过穿刺棉铃壁并且食用正在生长的种子损害正在生长的棉铃。除了对种子(纤维是种子的一部分)的物理损害之外，病原体也可以在食用期间被引入或通过昆虫诱导的创伤进入棉铃，使单个的簇或整个棉铃腐烂并且没有收获。由昆虫对棉铃的损害导致的产量损失已经在各种研究中被记录(Cassidy & Barber (1939) J. Econ. Entomol. 32 :99-104 ；Toscano & Stern (1976) J. Econ. Entomol. 69 53-56 ；Barbour 等人’ (1990) J. Econ. Entomol. 83 842-845 ；Greene 等人，Q001) J. Econ. Entomol. 94 :403-409)。在无选择食用研究中，椿象减少已经积聚了小于550热单位的棉铃中的籽棉产量(Greene等人，(2001) J. Econ. Entomol. 94 :403-409 ；Willrich 等人，(2004) J. Econ. Entomol. 97 :1928-1934)。相对少的研究已经研究了食用棉铃的昆虫对纤维品质的影响(Toscano & Mern(1976) J. Econ. Entomol. 69 :53-56 ；Barbour 等人，(1990) J. Econ. Entomol. 83 :842-845)。椿象优先食用年龄范围在开花期之后7-27天的棉铃(Willrich等人，(2004) J. Econ. Entomol. 97 1928-1934)，虽然某些最近的数据显示出在开白花之后仅3_4天的棉铃最易于受到脱落以及椿象损伤的影响。棉纤维在开花期的约45天内生长为成熟体。作为纤维长度测量的纤维伸长在开花期之后的第一个3周期间发生，而由马克隆尼气流式纤维细度测试仪测量的纤维凝聚或变厚在棉铃生长的第二个3周期间发生。许多植食性的椿象，包括南方绿椿象Nezara viridula (稻绿蝽)、绿椿象 Acrosternum hi Iare (绿椿)、以及褐臭蝽Euschitus servus (褐臭蝽)，已经成为棉生产的严重的害虫。这些害虫提出困难的治理上的挑战，这是因为关于基本生态学、在田间以及农场内的分布的有限的信息以及缺乏除了化学控制之外的治理策略。还有证据表明，椿象是活跃的飞虫并且频繁地在田间的毗邻的作物之间移动。椿象具有超过200种已知的寄主植物(农艺植物和非农艺植物)。椿象是强健的昆虫，使用它们的刺吸口器从棉蕾和棉铃除去植物液并且可以损害甚至相对成熟的棉铃。然后被损害的棉铃在外表面上生长小的凹陷的黑点。当用手打开棉铃并且检查皮棉、种子和心皮壁用于食用损伤的迹象时，可以看到食用的内部证据。作为椿象食用的结果，种子和皮棉通常变为褐色。木瘤状的胼胝生长可以在内心皮壁上显示，标志食用创伤以及植物对损伤的响应。侵害现象在单一的田地内高度聚集。一种普遍采用的测定作物田地是 否具有椿象侵扰的方法涉及罩布的使用。使用此方法，将样品植物在白色布上剧烈地摇动并且对逐出的昆虫计数。典型地，少量棉铃被打开并且进行对变色的皮棉和内部损伤的迹象的检查。 然而，这些方法是耗费时间的，可能导致对植物的机械损害，并且罩布方法给出存在的昆虫的计数，而不是对植物组织的损害的程度的指示。此外，皮棉和种子损害的发展可能不是外部明显的，即使昆虫已经穿刺棉铃。所以，种植者可能不正确地得出作物没有昆虫损害的结论，允许害虫不被处理。概述已经显示出，穿刺/吸吮式昆虫诱导植物损害，该植物损害导致当被损害的组织在紫外光或紫光暴露下被察看时的蓝-绿荧光(fluorescence)。在棉中，在内心皮壁和皮棉区域上的这种荧光的强度足以被肉眼探测。本公开内容提供用于非侵入地探测和测量与昆虫有关的荧光并且将所产生的荧光与作物中的昆虫损害的可能性相联系的方法和装置。 特别地，该方法涉及棉植物中的椿象损害，但是也适合于对任何植物的与昆虫有关的损害的探测。因此，本公开内容的一个方面包括探测目标植物组织中的昆虫诱导的损害的方法，包括(a)将目标植物或其片段暴露于紫外光或紫光；并且(b)探测来自目标植物或其片段的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，其中荧光的可探测的水平指示对目标植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。在本公开内容的多个实施方案中，方法还包括(i)探测来自目标植物或其片段的第二被紫外光或紫光诱导的荧光；(ii)测量第一荧光和第二荧光的强度水平；并且 (iii)测定第一被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平与第二被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平的比率；由此所述比率指示对植物或其片段的昆虫损害的水平。在本公开内容的本方面的实施方案中，目标植物可以选自由以下组成的组豆科作物、草类作物和子实体作物。在本公开内容的本方面的实施方案中，目标植物可以选自由以下组成的组大豆、 豇豆、玉米、高粱、稻米、小麦、苜蓿、山核桃、澳洲胡桃、苹果、梨、棉和番茄，或其杂交物或变种。在本公开内容的本方面的某些实施方案中，目标植物选自由以下组成的组棉植物、向日葵植物和大豆植物。本公开内容的另一个方面包括被配置以用于识别植物或其片段中的昆虫诱导的损害的装置，包括紫外光或紫光的源，其中紫外光或紫光的源的波长被选择以诱导与植物组织的昆虫诱导的损害相关联的荧光；至少一个光探测器，其被配置为提供响应于具有约 405nm至约675nm的峰值波长的荧光光线(fluorescent light)的输出电信号；电子系统，其用于将探测器的输出电信号转换为被探测器探测到的荧光光线的强度的度量；以及输出系统，其用于将被探测器探测到的荧光光线的强度的度量转换为用于指示目标植物或其片段具有昆虫诱导的损害的指示物。在本公开内容的本方面的设备的实施方案中，设备可以还包括包封物，包封物被配置为容纳植物或其片段，并且还被配置为减少植物或其片段周围的环境光。在本公开内容的本方面的实施方案中，紫外光或紫光的源和至少一个光探测器被布置为线性阵列，并且其中设备被配置为允许线性阵列围绕目标植物或其片段的轴线旋转。在本公开内容的本方面的一个实施方案中，紫外光或紫光的源被配置为提供具有约365nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且探测器被配置为探测具有约405nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及可能具有约465nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且目标植物是棉植物或其片段。在本公开内容的本方面的另一个实施方案中，紫外光或紫光的源被配置为提供具有约405nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且探测器被配置为探测具有约465nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及具有约515nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且目标植物是向日葵植物或其片段。附图简述当与附图结合地察看在下文描述的本公开内容的多个实施方案的详细描述时，本公开内容的进一步的方面将更容易理解。
图1示出了在长峰值波长紫外激发下暴露的棉铃的内心皮壁和皮棉区域的数码相机图像。左图像心皮壁显示出在任何椿象已经穿刺心皮壁之处的蓝-绿荧光的圆形区域。与心皮壁中的最严重的损害(左图像)相对的皮棉也展示明亮的荧光。右图像包括不显示出特征蓝-绿荧光的未被损害的心皮壁部分。图2图示了一部分棉内心皮壁在存在(样品1)和不存在(样品2、椿象损害时的激发光谱和发射光谱。在紫外激发下，心皮壁组织发射在约405nm(以圆标记的A)的紫光。 在椿象损害的存在下，可以观察到在约462nm的强度更高的峰(以圆标记的B)。该发射峰指示昆虫损害。图3示出了完整的棉铃(顶部)和被损害的棉铃(底部)的内心皮壁的数字落射荧光显微镜图像。红色的叶绿素发射是完整的棉铃的绝大部分，而被损害的棉铃主要展示如图1中所示的蓝-绿荧光。图4示出了完整的棉铃(顶部)和被损害的棉铃(底部)的外心皮壁的数字落射荧光显微照相图像。红色的叶绿素发射是完整的棉铃的绝大部分，尽管存在减少的叶绿素发射的小斑点。被损害的棉铃(可以清楚地看到昆虫刺穿部位)显示出在特征蓝-绿组分的存在下的降低的红色的叶绿素发射。图5示出了未被损害的、完整的棉植物组织的荧光指纹图谱(矩阵扫描)。绿色的植物组织主要显示具有410nm激发和675nm发射的叶绿素荧光。图6示出了昆虫损害的、完整的棉植物组织的荧光指纹图谱(矩阵扫描)。图5中示出的叶绿素自体荧光峰仍然存在，但是具有约360nm的激发波长和约455nm的峰发射的更强的荧光现在是明显的。该波长组合与图2—致。
图7图示了用于探测诸如完整的棉铃的作物植物的昆虫诱导的损害的装置的实施方案。在光衰减包封物5内是一系列可以使用激发光辐照植物或其片段的紫外发射LED 1。基于CCD或CMOS的成像系统2探测植物表面的发射荧光并且指示昆虫损害是否存在。图8图示了用于探测诸如完整的棉铃的作物植物的昆虫诱导的损害的装置的实施方案。在本实施方案中，激发光和发射光可以由柔性光纤传导。光纤可以由手持式棒来操纵， 并且操作者将棒在棉铃的表面上移动。荧光发射可以通过光电倍增管(2)来探测，通过基于微处理器的系统(4)来分析，并且作为昆虫诱导的植物损害的指示呈现给操作者。图9A-9D示出了椿象损害的棉铃的数字落射荧光图像。图9A 完整的棉铃的图像； 图9B 打开的棉铃的图像；图9C 变色的皮棉的图像(左皮棉；右破裂的棉铃)；以及图 9D 不太严重的棉铃变色图像图10示出了损伤材料的矩阵光谱扫描。图11示出了左未被损害的向日葵种子；以及右被损害的向日葵种子的落射荧光图像。图12图示了普通向日葵种子的矩阵扫描。图13图示了被椿象损害的向日葵种子的矩阵扫描。图14A是示出了被损害的大豆的落射荧光图像的数字图像。图14B是示出了未被损害的大豆的落射荧光图像的数字图像。图15A和15B是未被损害的棉铃(图15A)和具有椿象损害的棉铃(图15B)的在 390nm紫外激发下拍照的数字图像。食用点在图15B中由箭头表示示出。图16A和16B是示出了图像处理的效果的数字图像。图像与图15A和15B中相同。图像通过使用红色通道来分割和标准化，并且所得到的蓝-红比率值(ratiometric value)是假彩色的(false-colored)。椿象食用部位作为亮点可以被看到(图16B)，其在图16A中不存在。图17是非便携式棉铃成像设备的数字图像。棉铃样品(A)被放置在旋转台上，旋转台允许从不同的角度获取图像。近紫外发光二极管阵列(B)提供激发光并且使用诱导荧光的UV光照射样品。发射滤波器(C)消除在发射路径中的UV激发光，但是允许蓝色荧光发射通过。荧光图像使用SLR照相机(D)被获得。图18示出了未被损害的棉铃㈧和被识别为具有已发展的木瘤和皮棉变色的被损害的棉铃(C)的荧光图像的比较的一系列数字图像。相应的比率图像示出了与被损害的情况(D)相比，在未被损害的情况(B)中的更少的蓝光发射。图19A和19B示出了从图18中的比率图像获得的强度直方图。图19A中的直方图对应于未被损害的棉铃(图18，B)，而图19B中的直方图对应于被损害的棉铃(图18，D)。 在被损害的情况中可以看到朝向更高的强度值的强的迁移。本公开内容的方法和系统的某些示例性的实施方案的细节在下文的描述中提出。 在考察下文的说明书、附图、实施例和权利要求之后，本公开内容的其他的特征、目的和优点对于本领域的技术人员将是明显的。意图的是，所有这样的另外的系统、方法、特征和优点都应当包括在本说明书内，应当在本公开内容的范围内，并且应当由所附的权利要求保护。详细描述
在更详细地描述本公开内容之前，将理解，本公开内容不限于所描述的具体的实施方案，并且就其本身而论当然可以变化。还将理解，本文所使用的术语仅是为了描述具体的实施方案的目的。如果提供了值的范围，那么将理解，每个介于该范围的上限和下限中间的值(至下限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定)以及在所声明的范围中的任何其他的声明的或介于中间的值，都被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内并且也被包括在本公开内容内，服从在所声明的范围内的任何特别地排除的限制。如果所声明的范围包括上下限中的一个或两个，那么排除了那些被包括的上下限中的一个或两个的范围也被包括在本公开内容内。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员所普遍理解的意思相同的意思。虽然任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可以被用于本公开内容的实施或试验，但是现在描述优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和专利在此通过引用被并入，如同每个单个的出版物或专利被特别地和分别地表示为通过引用被并入一样，并且通过引用被并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是用于其在申请日之前的公开内容，并且不应当解释为承认本公开内容借助于在先公开内容不享有先于这样的出版物的权力。此外，所提供的出版日期可以是与实际的出版日期不同，其可能需要被独立地证实。如在阅读本公开内容时对于本领域的技术人员将是明显的，本文描述和图示的每个单个的实施方案具有分立的组成部分和特征，分立的组成部分和特征可以被容易地从任何其他的多个实施方案的特征分离或与任何其他的多个实施方案的特征组合，而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所叙述的方法可以以所叙述的事件的顺序或以任何逻辑上可能的其他顺序实施。除非另有说明，本公开内容的实施方案将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学以及类似学科的技术，其在本领域的技术的范围内。这样的技术在文献中被完全地解释。必须注意，如在说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一 (a) ”、“一 (an)，， 和“该(the)”包括复数的指代，除非上下文另外清楚地表示。因此，例如，对“支持物”的指代包括多个支持物。在本说明书和随后的权利要求中，将作出对许多术语的指代，这些术语应当被定义为具有以下的意思，除非相反的意图是明显的。如本文所使用的，以下的术语具有它们被赋予的含意，除非另有说明。在本公开内容中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”以及类似表述可以具有它们在美国专利法中被赋予的含意并且可以意指“包括(includes) ”、“包括(including) ”以及类似表述；“基本上
由......组成”或“基本上包含”或类似表述，当被应用于本公开内容包括的方法和组合物
时，是指相似于本文公开的那些的组成，但是其可以含有另外的结构组、组合物组分或方法步骤(或其类似物或衍生物，如上文讨论的)。然而，这样的另外的结构组、组合物组分或方法步骤等等，与本文公开的相应的组合物或方法的基本的和新颖的特征相比，不实质上影响组合物或方法的基本的和新颖的特征。“基本上由......组成”或“基本上包含”或类似表述，当被应用于本公开内容包括的方法和组合物时，具有在美国专利法中赋予的含意，并且术语是开放式的，允许多于所叙述的组分的组分的存在，只要所叙述的组分的基本的或新颖的特征不被多于所叙述的组分的组分的存在改变，但是排除现有技术实施方案。应当注意，比率、浓度、量和其他的数字数据在 本文中可以以范围形式来表示。将理解，使用这样的范围形式是为了简便和简洁，并且因此应当以灵活的方式解释为不仅包括作为范围的上下限明确叙述的数字值，而且包括在该范围内的所有单个的数字值或子范围，如同每个数字值和子范围被明确叙述一样。为了例证，“约0. 至约5%”的浓度范围应当被解释为不仅包括明确叙述的约0. 至约5wt%的浓度，而且包括在所表明的范围内的单个的浓度(例如1%、2%、3%和4% )和子范围(例如0. 5%U. 1%>2. 2%,3. 3% 和4.4% )。术语“约”可以包括所修改的数字值的士 1%、士2%、士3%、士4%、士5%、 士6%、士7%、士8%、士9%或士 10%，或更多。意图的是，术语“约”，当在本文中被应用于光的峰值波长时，可以提供从低于峰值波长约5nm延伸至高于峰值波长约5nm的峰值波长的范围。例如，“约365nm的峰值波长” 可以指约360nm至约370nm的范围。如本文所使用的术语“植物”可以指任何植物，包括但不限于作物植物或野生植物。本术语可以还包括任何经受昆虫损害的单子叶或双子叶植物。这样的植物包括但不限于基于豆、草的作物，包括谷类植物和果实作物。作物植物可以包括但不限于大豆、豇豆、玉米、高粱、稻米、小麦、苜蓿、山核桃、澳洲胡桃、果实作物(例如但不限于苹果和梨)、棉和番茄，或可能易受昆虫(包括但不限于椿象物种)损害的任何其他的植物物种、变种以及类似物。如本文所使用的术语“昆虫”是指可以诱导植物的组织中的变化的昆虫，该变化可以导致植物组织中的荧光峰值波长的迁移或导致荧光强度的减小。如本文所使用的术语 “昆虫”可以指任何半翅目、异翅亚目的植食性昆虫，包括但不限于椿总科，并且包括但不限 參录禾中(MW (Acrosternum hilare))((Euschitus servus))
方绿椿象(稻绿蝽(Nezara viridula))、绿盾蝽(green shieldbug)(红尾碧蝽(Palomena prasma))、茶翅椿(褐翅椿(Halyomorpha halys))、夏至草蝽(horehound bug)(夏至草蝽 (Agonoscelis rutila))、森林红蝽(红足真蝽(Pentatoma rufipes))，以及类似物，如例如由 Triplehorn&Johnson. (2005)在 Borror & DeLong Introduction to the Study of Insects (昆虫研究导论),第七版.Pub :Brooks/Cole, Thomson Learning, Inc.的分公司, 贝尔蒙特，加利福尼亚州(864页)中描述的。术语可以还涉及任何可以导致或诱导对植物 (特别是有经济价值的作物植物)的组织损害的穿刺或咀嚼性昆虫。如本文所使用的术语“紫外光或紫光”是指具有约280nm至约405nm、优选约340nm 至约400nm、并且更优选约355nm至约380nm的峰值波长的光。描述本公开内容包括基于荧光的、用于探测植物中的昆虫诱导的损害的方法，并且提供意图应用所述方法的装置的实施方案。本公开内容的方法是非侵入性的，并且通过探测与植物组织被例如但不限于椿象类别的成员的昆虫的口器穿透相关的发射荧光，提供用于探测对植物的昆虫诱导的损害的快速手段。在使用现有的评估椿象在棉作物中的存在的方法时，已生长的棉铃通过裂开被手动地检查，以可视地确定是否有对皮棉或棉铃心皮的内表面的任何变色或其他损害。这些方法的主要缺点是，它们耗费时间并且依赖于在皮棉或组织中具有可归因于昆虫并且肉眼可见的缺陷。因此，这些方法仅适合于探测已经具有从用于基本损害的棉铃组织的初始穿透至发展的足够时间的作物田地的虫害。如果有的话，仅导致植物组织被口器穿刺的昆虫活性不是可容易地探测的，并且对于植物组织被口器穿刺没有足够的时间流逝用于组织损害形成。对于仅依赖于对棉铃的手动检查的种植者来说，符合实际的选择是可以延迟作物杀虫剂喷洒，直到损害变得明显，在这一时间期间更多的作物可以被攻击。可选择地，出于谨慎的考虑，种植者可以在虫害仅仅在田地中局部时借助于不必要的喷洒。用于作物的手动检查的时间和劳动还可以减少经受检查的作物田地的面积，由此不能够探测局部的昆虫活性，并且低估任何虫害的程度。本公开内容的方法探测在昆虫刺穿的组织部位处的紫外光和紫光诱导的荧光，以及特别是在穿透的部位处的植物组织的外表面处或附近发射的荧光。方法和相关的装置可以容易地适合于快速评定作物昆虫损害的程度并且避免必须手动地打开植物的部分以视觉地探测损害。本公开内容的方法能够探测昆虫攻击，即使可能没有足够的时间已经流逝用于更广泛的基本组织损害的发生。因此，如图15A和15B中所示的，例如，棉铃的椿象穿透是可被在正在生长的棉铃的表面处的蓝-绿荧光探测的。例如，对于棉铃来说，已经发现，对植物组织的椿象损害与可见的蓝-绿荧光相关联。蓝-绿荧光典型地局限于以内心皮壁中的实际的椿象穿刺洞为中心的小的圆形区域， 如图3中所示的。在高度椿象损害的区域附近，下层的皮棉也可以示出这种特征蓝-绿荧光。这种荧光可以被探测和记录。蓝-绿荧光区的光谱分析展示在约460nm的特征发射峰。参照附图，图2示出了被损害的心皮壁(样品1)和未被损害的心皮壁(样品2) 的激发光谱和发射光谱。在约360nm的峰值波长的紫外激发下，未被损害的棉铃发射具有在约405nm周围(在图2中由圆标记的A)的峰发射的紫荧光。然而，在椿象破坏的存在下，并且再次使用约360nm的峰值波长的紫外激发，看到在约462nm的更强的发射峰(在图 2中由圆标记的B)。这一在约462nm的峰对应于在图1中可见的在视觉上观察到的蓝-绿荧光。对在约405nm的未被损害的组织特异性发射以及在约462nm的昆虫损害特异性发射的存在的观察允许植物组织损害的程度的比率测量方法。在紫外激发下，在约405nm和约 462nm 二者的发射可以被同时地观察到，并且如果发射的比率超出某个阀值，那么可以假定昆虫损害。图2的光谱数据被在落射荧光显微镜上在约405nm激发下取得的图像进一步支持。在这种情况下，滤波器设置可以允许观察叶绿素荧光，叶绿素荧光构成了未包括在图2 中示出的光谱图像中的第三荧光组分。内棉铃壁的显微镜图像在图3中示出。在图3中， 顶部图像示出了没有昆虫损害的棉铃。图像主要是被漫射的红色的叶绿素荧光，因为其已经被心皮壁细胞层散射。底部图像示出了观察到昆虫穿刺损害的内棉铃壁。该图像主要是在昆虫刺穿附近的蓝-绿荧光。该图像对应于图1中示出的宏观图像。图4示出了对外心皮壁取得的相应的图像。在未经受昆虫攻击的完整的棉铃中 (图4，顶部)，外壁也主要是红色的叶绿素发射。具有昆虫损害的棉铃(图4，底部)清楚地示出了刺穿部位、与昆虫损害相关联的蓝-绿发射以及降低的红色叶绿素发射。叶绿素的行为(即其不存在于损害部位附近)提供对用于获得比率光谱测量以测定昆虫损害的程度的通常途径的补充。现在参照图5和6，对于来自心皮壁的未被损害的棉铃组织的情况，展示出具有约 360nm的最优激发峰值波长和约405nm的峰发射峰值波长的自体荧光(图5)。该峰也存在于已经被椿象食用的组织中，如图6中所示的。然而，在后一种情况下，现在存在具有约 460nm的峰激发峰值波长的强度更高的峰(图6)。图5和6中示出的矩阵峰 对应于图2中示出的光谱峰。与和棉相关联的那些相比，除了棉之外的植物物种可能需要不同的激发峰值波长并且提供不同的发射光谱。例如，现在参照图12和13，未被损害的向日葵种子组织展示出具有约405nm的最优激发峰值波长和约465nm的峰发射峰值波长的自体荧光(图12)。该峰也存在于已经被椿象食用的组织中(图6)，然而，对于该植物受试者来说，现在存在约 515nm处的峰值波长的更强的发射峰(图13)。与目标植物物种无关，比率测量可以通过使用第一紫外或紫激发光照射样品并且测量在与健康的植物组织相关联的植物物种特异性峰值波长处的第一荧光发射强度的强度(强度I1)来进行。然后，样品将使用可以具有或可以不具有与第一激发光相同的峰值波长的第二紫外或紫激发光来照射，并且测量在与昆虫诱导地损害的植物组织相关联的植物物种特异性峰值波长处的第二荧光发射强度的强度(强度I2)。基于图5和6，例如，比率R = VI1将对于未被损害的植物组织来说小于1，并且对于被损害的植物组织来说大于 1。计算比率测量结果，例如R，可以有利地消除许多影响强度的效应，例如光源和探测器与样品的距离、组织变化或灰尘。设想，根据本公开内容所提供的现场可用的探测装置可以探测使用在约350nm至约410nm之间的紫外光或紫光激发的指示昆虫诱导的植物组织损害的至少一个荧光发射， 并且优选向装置测量的操作者提供损害的程度的数字数据和/或图像。因此，本公开内容的一个方面提供用于探测植物组织的昆虫食用损害的便携式装置。本公开内容的本方面的实施方案，如图7、8和17所示的，可以包括长波长激发光的源 1和激发滤器8、被配置为选择性地探测第一荧光光线的光探测器2以及任选地被配置为选择性地探测第二荧光光线的第二探测器2。期望第一光探测器和第二光探测器2可以是单个的部件或是单一的光探测器，其具有例如被选择以允许第一荧光或第二荧光的光的通过以传递至探测器的至少一个滤波器3。在本公开内容的装置的实施方案中，光源1可以是任何光源，例如发射具有根据本文的方法适合于激发昆虫诱导的荧光的波长的光的LED或LED阵列、激光系统以及类似物。光源1和荧光光线探测器2可以被包封物5包围，包封物5的横截面在图7中图示，包封物5从经受昆虫损害的检查的目标植物或其片段限制或排除环境光。本公开内容的系统 10的包封物和组装的部件可以被配置为提供用于在现场对植物或其部分进行检查的便携式手持式系统10。在某些实施方案中，装置可以被配置为同时检查多重目标植物，在这种情况下装置可以不是手持式的。预期，光探测器2可以能够发射电信号，该信号的强度(intensity)或强度 (strength)是入射在探测器2上的光的强度的函数。设想，来自探测器的输出信号可以被引导至成像部件4，以提供由暴露于本公开内容的方法的长波长光的植物组织所发射的荧光的直接可见的显示，相似于图1中示出的那些。可选择地，来自光探测器2的电信号输出可以通过能够将电信号的振幅转换为定量的数值的方式作为数值显示，数值的大小是输出电信号的强度的函数。本公开内容的装置可以还包括电子计算工具4，例如基于微处理器的装置，以提供第一荧光和第二荧光的强度的比率值。比率值，作为数字值，可以被向操作者显示，然后操作者评估该值并且判断在被测试的植物上是否存在与昆虫有关的损害。可选择地，装置10将比率值转换为简单的指示物，例如但不限于指示与昆虫有关的植物损害的存在的光、声或可见图形表示。在本公开内容的装置中，预期，装置可以是便携式的并且因此能够被携带入田间， 以进行对作物植物的虫害的检查，如由植物组织中的昆虫诱导的荧光变化表明的。激发紫外光源或紫光源、荧光光线探测器和用于转换来自探测器2的电输出信号的电子电路可以可操作地连接在小至足以被容易地携带并且优选手持的一个或多个单元中。对于将在日光中可操作的装置来说，该装置将优选包括光屏蔽包封物5，以包封目标植物或植物片段，由此排除环境光干扰测试设备的入射光和发射光。本公开内容的装置10的微处理器单元4可以分析光谱信息并且向操作者指示昆虫损害是否存在。探测装置的两个传感器单元实施方案在图7和8中示出，但不意图作为限制。两个实施方案都基于以下原理可以将蓝/紫外激发光导向至植物表面，并且分析在不同的峰值波长的发射光以识别主要的发射峰。两个装置都优选地允许探测昆虫损害而不移除、破裂或以其他方式损害正在测试的植物或该植物的部分。光源和探测器将由微控制器电路控制，并且数据分析在附接于探测器的便携式微处理器单元中进行。整个单元可以由常规的电池或可充电电池驱动。任选择的光信号、数字数据信号、声信号以及类似信号可以向操作者通知昆虫损害的存在。在根据本公开内容并且在图8中示意性地示出的设备的一个实施方案中，设备包括光传输光纤7或多个光纤，光纤7的远端被可以是手持式的棒6保持为稳定的配置以保持紧贴目标植物或其部分，并且光纤7的近端被可操作地连接于光源1或其激发滤器8，并且连接于荧光光线探测器2。在采用本公开内容的方法的设备的一个实施方案中，昆虫损害探测可以使用线扫描器来实现。为了进一步使探测过程自动化和促进探测过程，设想，CCD线扫描器可以用作荧光探测器。线扫描器是典型地含有在线性阵列中的2，000个传感器的集成电路。线扫描器经常在传真和桌面扫描装置中以及在电子复印机中使用。线扫描器用于将处理任务简化为一维数据处理，其可以通过紧凑的手持式微控制器装置进行。例如，线扫描器和两个UV照射阵列可以被布置在大至足以贴合在棉铃上的圆桶中。然后，圆桶本身或仅仅光源/荧光探测器围绕棉铃旋转并且收集扫描数据，分析扫描数据用于噪声降低、具有高度足够的红色信号的细胞的探测、蓝色信号相对于红色信号的归一化以及计数具有高于预定水平的蓝色与红色比率的细胞的数量。该数量可以用作用于确定椿象食用损害的量的量度。除了棉铃之外，向日葵种子具有非常相似的光谱行为，并且因此预期装置可以专门地关于与诸如棉、向日葵，玉米、大豆和各种被椿象及类似物影响的其他植物的具体植物目标的昆虫损害相关联的激发光和荧光光线的波长来配置。因此，本公开内容的一个方面包括探测目标植物组织中的昆虫诱导的损害的方法，包括(a)将目标植物或其片段暴露于紫外光或紫光；并且(b)探测来自目标植物或其片段的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，其中荧光的可探测的水平指示对目标植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。在 本公开内容的多个实施方案中，方法还包括(i)探测来自目标植物或其片段的第二被紫外光或紫光诱导的荧光；(ii)测量第一荧光和第二荧光的强度水平；并且 (iii)测定第一被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平与第二被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平的比率；由此所述比率指示对植物或其片段的昆虫损害的水平。在本公开内容的本方面的实施方案中，目标植物可以选自由以下组成的组豆科作物、草类作物和子实体作物。在本公开内容的本方面的实施方案中，目标植物可以选自由以下组成的组大豆、 豇豆、玉米、高粱、稻米、小麦、苜蓿、山核桃、澳洲胡桃、苹果、梨、棉和番茄，或其杂交物或变种。在本公开内容的本方面的某些实施方案中，目标植物选自由以下组成的组棉植物、向日葵植物和大豆植物。在本公开内容的本方面的各种实施方案中，紫外或紫激发光具有约365nm的峰值波长，第一被紫外光或紫光诱导的荧光具有约405nm的峰值波长，并且第二被紫外光或紫光诱导的荧光具有约465nm的峰值波长，并且其中目标植物是棉植物或其片段。在本公开内容的本方面的某些实施方案中，其中紫外或紫激发光具有约405nm的峰值波长，并且第一被紫外光或紫光诱导的荧光具有约465nm的峰值波长，并且第二被紫外光或紫光诱导的荧光具有约515nm的峰值波长，并且其中目标植物是向日葵植物或其片段。在本公开内容的本方面的方法的实施方案中，荧光的可探测的水平可以指示半翅目的昆虫对目标植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。在某些实施方案中，昆虫是椿象。本公开内容的另一个方面包括被配置以用于识别植物或其片段中的昆虫诱导的损害的装置，包括紫外光或紫光的源，其中紫外光或紫光的源的波长被选择以诱导与植物组织的昆虫诱导的损害相关联的荧光；至少一个光探测器，其被配置为提供响应于具有约 405nm至约675nm的峰值波长的荧光光线的输出电信号；电子系统，其用于将探测器的输出电信号转换为被探测器探测到的荧光光线的强度的度量；以及输出系统，其用于将被探测器探测到的荧光光线的强度的度量转换为用于指示目标植物或其片段具有昆虫诱导的损害的指示物。在本公开内容的本方面的设备的实施方案中，设备可以还包括包封物，包封物被配置为容纳植物或其片段，并且还被配置为减少植物或其片段周围的环境光。在本公开内容的本方面的实施方案中，荧光光线可以具有选自由以下组成的组的峰值波长约405nm、约460nm、约515nm和约675nm或其组合。在本公开内容的本方面的实施方案中，荧光光线的强度的度量可以作为对植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在的非数字指示物向操作者显示。在本公开内容的本方面的某些实施方案中，荧光光线的强度的度量可以作为数值向操作者显示，其中数值指示对植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。在本公开内容的本方面的实施方案中，紫外光或紫光的源和至少一个光探测器被布置为线性阵列，并且其中设备被配置为允许线性阵列围绕目标植物或其片段的轴线旋转。在本公开内容的本方面的一个实施方案中，其中紫外光或紫光的源被配置为提供具有约365nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且探测器被配置为探测具有约405nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及具有约465nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且目标植物是棉植物或其片段。在本公开内容的本方面的另一个实施方案中，紫外光或紫光的源被配置为提供具有约405nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且探测器被配置为探测具有约465nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及具有约515nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且目标植物是向日葵植物或其片段。下文的具体的实施例将被视为仅是例证性的，并且不以任何方式作为对本公开内容的其他部分的限制。相信，本领域的技术人员可以不经过进一步地复杂工作基于本文的描述将本公开内容利用至其最完全的程度。本文叙述的所有出版物在此以其整体通过引用被并入。应当强调的是，本公开内容的实施方案，特别是任何“优选的”实施方案，都仅是实施的可能的例子，仅仅为了清楚理解本公开内容的原理而提出。可以对本公开内容的上述实施方案作出许多变化和修改，而不实质上偏离本公开内容的精神和原理。所有这样的修改和变化都意图在此被包括在本公开内容的范围内，并且本公开内容受以下的权利要求保护。
实施例实施例1将棉损伤(组织肿瘤，荧光材料)选择性地切割并且与水混合地放入微量离心管。 然后将所制备的样品冻结并随后在室温放置以融化。当样品融化(固体样品/水混合物) 时，使用特氟隆氟碳树脂研杵在微量离心管中研磨样品。将溶液从固体残留物分离。然后将溶液装入至比色杯，以进行激发/发射光谱测量。如图2中示出的结果显示出棉损伤具有在约350nm的激发峰值波长下的在约425nm至约475nm的范围内的最大发射强度。实施例2向日葵种子研究图12是普通向日葵种子的矩阵扫描。最高发射是在约405nm的激发峰值波长下的约465nm。这一激发/发射对与受侵害的棉铃损伤材料相同。图13是被椿象侵害的向日葵种子的矩阵扫描。在460nm和470nm处的两个显著的激发峰给出约510nm至约520nm的发射。这是与普通向日葵种子的不同点。从附图，普通向日葵种子激发/发射指纹也是明显的(在405nm激发下具有465nm发射)，虽然其与受侵害的材料相比较弱。因此，向日葵种子的椿象诱导的损伤的检查可以使用465nm激发以探测515nm的发射峰值波长。在图14A和14B中示出的图像使用具有在照相机镜头前部中的420nm长通滤波器的标准照相机取得。使用UV灯照射大豆。椿象损害的大豆显示出绿-黄荧光。在图14A 中，小的绿色-黄色点是食用点，与由不均勻的照射导致的更大的和更均勻的绿色-黄色背景点不同。在图14B中，不可归因于与昆虫有关的损害的大荧光位于右上部分上。椿象诱导的损害荧光通常呈现为较小的点。实施例3使用CMOS照相机芯片的椿象损害探测如图17中所示的，390nm高功率LED被用作紫外光源来照射棉铃。荧光图像使用具有固定的50mm镜头和480nm长通滤波器的来自上文的标准数码SLR照相机取得。滤波器被用于截止短波照射光。整个机构被屏蔽对抗明亮的环境光。在SLR照相机中停用所有自动特征，并且保持设置对于所有图像相同，以允许一致的定量图像分析。使用定量 图像分析软件"Crystal Image，，(Haidekker MA, Advanced Biomedical Image Analysis,Boston Artech House 2010)处理所记录的图像。每个SLR原始图像被转变为12比特每像素的TIFF图像，并且通过剪切、像素合并 (4x4像素)和通过中值滤波器和高斯滤波器的噪声减低进行预处理。将红色通道和蓝色通道分离。红色通道主要是由叶绿素导致的长波荧光。蓝色通道中的图像强度强烈地依赖于椿象损伤的存在。因此红色通道被用于提取两个信息要素(1)棉铃的图像区域(自动分割)和(2)照射强度。通过使用红色通道分割蓝色通道，照射不均勻性被衰减。通过仅使用具有高度红光发射的图像区域，仅实际的棉铃区域被考虑。图像处理结果在图16A和 16B中显示。通过简单的阀值设定(thresholding)或通过直方图分析，明亮的(荧光)点的相对面积可以被确定并且用作椿象损害的量度。这些亮点的较大的量以及相应地较大的相对面积指示椿象食用损害的存在。实施例4具有提供12比特每像素分辨率(数字化误差小于0. 04% )的能力的SLR照相机被与365nm LED光源和480nm长通发射滤波器组合地使用。将棉铃放置在旋转台上，使得从不同的角度获得多重图像成为可能。成像机构在图17中示出。从SLR照相机图像，红色通道和蓝色通道被提取。红色通道含有叶绿素自体荧光并且服务于两个目的识别(分割)图像中的棉铃形状并且作为照射基准。在另一方面，蓝色通道含有关于被怀疑的椿象食用损害的信息。图像处理步骤是噪声降低、棉铃分割、归一化的蓝光发射强度的计算(通过计算蓝色强度对红色强度的比率)以及超出某个强度阀值的蓝光发射的相对的面积的测定。在成像处理之后，手动地检查所有棉铃。将棉铃打开并且目测检查三种指示物 (a)皮棉变色、(b)木瘤在内心皮壁上的形成以及(c)刺穿标记中的任何一种的存在。三种指示物中的任何一种的存在将棉铃分类为“被损害的”。如果所有三种指示物都不存在，那么将棉铃分类为“未被损害的”。图18显示出来自两个样品棉铃的图像。棉铃A是未被损害的。可以清楚地看到微红色的色调，这指示叶绿素荧光。相应的比率图像(蓝色相对于红色)在B中示出。棉铃C已经被识别为具有木瘤和皮棉显色二者。未处理的荧光图像显示出较少的红光发射。 相应的比率图像(D)显著地比(B)明亮，指示与被椿象损害相关联的较大量的蓝色荧光发射。相应于图18(B和D)的强度直方图进一步突出了该差异。图18，D中的强度分布揭示了比未被损害的实例(图18，B)的强度分布高的强度值的更高的概率。直方图(图 19A和19B)允许提取一个单一的定量参数，例如超出任意的预选择的阈值的像素数或标记最高5%的像素的强度值。在本具体的实施例中，与在被损害的情况中的917个像素相比，在未被损害的情况中发现M个超过80的值的像素。与95%分位数在损害的情况下是68相比，95%分位数在未被损害的情况下是四。基于手动检查，图像处理参数(即阀值和分位数)可以被选择以匹配通过手动检查获得的结果。实施例5为了测试光学探测潜力，在温室中准备未被损害的棉铃和被椿象损害的棉铃。使棉植物(FiberMax FM 9063 B2F)在3-加仑盆中在无昆虫条件下生长。从开花期开始，给具有第一位置白花的节点加标签。在开花期之后十五天，将三只五龄南方绿椿象(Nezara viridula(稻绿蝽)(L.))关在笼子里置于每个单个的棉铃上。在三天的昆虫食用之后，将从植物收获棉铃并且分析。将被损害的棉铃和未被损害的棉铃打开，以检查在不同类型的光下的光谱性质的差异。最显著的可见结果在棉铃在UV灯下察看时发生，因为椿象诱导的木瘤和变色的皮棉发出绿色的荧光(图1)。为了测定激发的精确的波长，使用荧光光谱法分析无虫害的棉铃和被椿象损害的棉铃的部分。这些结果(图2)显示出，被损害的棉铃以与未被损害的棉铃不同的波长发射荧光。使用低分辨率落射荧光显微术检查棉铃的内表面和外表面。无论是内表面还是外表面，被椿象损害的棉铃总是展示蓝-绿荧光，而红色的叶绿素自体荧光被削弱。相反地， 未被损害的棉铃不显示出蓝-绿荧光的迹象，而是显示出清楚的红色叶绿素荧光。这一发现是甚至更令人鼓舞的，因为我们能够分离被损害的棉铃和未被损害的棉铃，而不破裂它们以暴露木瘤和变色的皮棉。实际上，蓝-绿荧光大部分定位在椿象的口器在食用期间刺穿棉铃壁之处(图幻，这证实了荧光的差异看来像是与椿象食用相关。
权利要求
1.一种探测目标植物组织中的昆虫诱导的损害的方法，包括(a)将目标植物或其片段暴露于紫外光或紫光；并且(b)探测来自所述目标植物或所述其片段的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，由此荧光的可探测的水平指示对所述目标植物或所述其片段的昆虫诱导的损害的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括(i)探测来自所述目标植物或所述其片段的第二被紫外光或紫光诱导的荧光； ( )测量所述第一被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平和所述第二被紫外光或紫光诱导的荧光的强度水平；并且(iii)测定所述第一被紫外光或紫光诱导的荧光的所述强度水平与所述第二被紫外光或紫光诱导的荧光的所述强度水平的比率；由此所述比率指示对所述植物或所述其片段的昆虫损害的水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标植物选自由以下组成的组豆科作物、草类作物和子实体作物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标植物选自由以下组成的组大豆、豇豆、 玉米、高粱、稻米、小麦、苜蓿、山核桃、澳洲胡桃、苹果、梨、棉和番茄，或其杂交物或变种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标植物选自由以下组成的组棉植物、向日葵植物和大豆植物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述紫外或紫激发光具有约365nm的峰值波长，所述第一被紫外光或紫光诱导的荧光具有约405nm的峰值波长，并且所述第二被紫外光或紫光诱导的荧光具有约465nm的峰值波长，并且其中所述目标植物是棉植物或其片段。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述紫外或紫激发光具有约405nm的峰值波长，并且所述第一被紫外光或紫光诱导的荧光具有约465nm的峰值波长，并且所述第二被紫外光或紫光诱导的荧光具有约515nm的峰值波长，并且其中所述目标植物是向日葵植物或其片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中荧光的可探测的水平指示半翅目的昆虫对所述目标植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述昆虫是椿象。
10.一种用于识别植物或其片段中的昆虫诱导的损害的设备，包括紫外光或紫光的源，其中紫外光或紫光的源的波长被选择以诱导与植物组织的昆虫诱导的损害相关联的荧光；至少一个光探测器，其被配置为提供响应于具有约405nm至约675nm的峰值波长的荧光光线的输出电信号；电子系统，其用于将所述探测器的所述输出电信号转换为被所述探测器探测到的荧光光线的强度的度量；以及输出系统，其用于将所述被所述探测器探测到的荧光光线的强度的度量转换为用于指示目标植物或其片段具有昆虫诱导的损害的指示物。
11.根据权利要求10所述的设备，还包括包封物，其中所述包封物被配置为容纳植物或其片段，并且还被配置为减少所述植物或其片段周围的环境光。
12.根据权利要求10所述的设备，其中所述荧光光线具有选自由以下组成的组的峰值波长约405nm、约460nm、约515nm和约675nm，或其组合。
13.根据权利要求10所述的设备，其中所述荧光光线的强度的所述度量作为对植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在的非数字指示物向操作者显示。
14.根据权利要求9所述的设备，其中所述荧光光线的强度的所述度量作为数字值向操作者显示，其中所述数字值指示对植物或其片段的昆虫诱导的损害的存在。
15.根据权利要求10所述的设备，其中所述紫外光或紫光的源和所述至少一个光探测器被布置为线性阵列，并且其中所述设备被配置为允许所述线性阵列围绕所述目标植物或其片段的轴线旋转。
16.根据权利要求10所述的设备，其中所述紫外光或紫光的源被配置为提供具有约 365nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且所述探测器被配置为探测具有约405nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及具有约465nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且其中所述目标植物是棉植物或其片段。
17.根据权利要求10所述的设备，其中所述紫外光或紫光的源被配置为提供具有约 405nm的峰值波长的紫外或紫激发光，并且所述探测器被配置为探测具有约465nm的峰值波长的第一被紫外光或紫光诱导的荧光，以及具有约515nm的峰值波长的第二被紫外光或紫光诱导的荧光，并且其中所述目标植物是向日葵植物或其片段。
全文摘要
由食用植物的昆虫导致的损伤与在例如棉铃心皮壁中和在皮棉区域中的蓝-绿荧光的区域的产生相关联。本公开内容现在提供用于迅速地和非侵入地探测和测量与昆虫有关的荧光并且将所产生的荧光与作物中的昆虫损害的可能性相关联的方法和装置。特别地，方法涉及棉植物中的椿象损害，但是也适合于探测任何植物的与昆虫有关的损害。探测目标植物组织中的昆虫诱导的损害的方法可以包括将目标植物或其片段暴露于紫外光或紫光；并且探测来自所述目标植物或其片段的被紫外光诱导的荧光，由此指示与昆虫有关的植物损害的存在。还提供被配置以用于识别植物或其片段中的昆虫诱导的损害的装置，包括紫外光或紫光的源、至少一个光探测器；电子系统，其用于将输出的电信号转换为被探测器探测到的荧光光线的强度的度量；以及输出系统，其用于将荧光光线的强度的度量转换为用于指示目标植物或其片段具有昆虫诱导的损害的指示物。
文档编号G01N37/00GK102348976SQ201080011235
公开日2012年2月8日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月30日
发明者夏晋军, 迈克尔·D·特夫斯, 马克·A·海德克 申请人:乔治亚大学研究基金公司