专利名称：一种牛奶和奶粉中维生素b12的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种维生素B12的检测方法，尤其涉及一种用于牛奶和奶粉制品中维生素B12的检测方法。
背景技术：
目前，国内外关于维生素B12的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多。微生物法检测乳品中维生素B12是利用德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii) ,ATCC 7830对维生素B12的特异性，在含有维生素B12样品中生长产生的酸 度和形成的光密度来测定维生素B12的含量。现有的微生物法检测维生素B12需要经过制备测试菌液、加入缓冲液和水水解，加入盐酸调整PH值进行样品前处理、制作标准曲线、灭菌、接种、培养、使用风光光度计测定。但是检测过程复杂，使用分光管妒忌需将每个样品放入比色皿，操作繁琐；容易造成交叉污染，结果重现性不好。基于上述问题，开发一种操作简单、重现性好、结果稳定的维生素B12检测方法就尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，其操作简单、重现性好、结果稳定。本发明提供了一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，包括
a、将牛奶或奶粉定容混匀得到溶解液；
b、将溶解液杀菌，得到灭菌液，存储灭菌液；
C、配制维生素B12的培养基液，将培养基液杀菌得到杀菌基液，存储杀菌基液；
d、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液；
e、分别将杀菌基液、灭菌液、德氏乳杆菌和标准品溶液加入微孔板条的相应微孔中，孵育得到测试液；
f、处理测试液，使微生物悬浊其中，用酶标仪读取它们的混浊度；
g、绘制与标准品溶液相对应的测试液中维生素B12的浓度与测试液混浊度的标准曲线.
h、将溶解液相对应的测试液的混浊度代入标准曲线中，换算得到牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的再一种示意性的实施方式中，步骤a中牛奶的取样量为lmL，且放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀，得到溶解液。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的另一种示意性的实施方式中，步骤a中奶粉的取样量为lg，且放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀，得到溶解液。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤b中溶解液在超净台用0. 2 ii m或0. 22 ii m无菌滤膜过滤杀菌，得到灭菌液，将灭菌液存储于I. 5mL或2. OmL无菌试管中。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤c中加入IOmL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀，得到培养基液，将培养基液在90-100°C水浴中加热至少5分钟，其间振荡至少2次，迅速冷却至室温，使用0. 2 iim或
0.22 um无菌滤膜过滤杀菌培养基液得到杀菌基液，将杀菌基液存储于15mL无菌离心管中。
在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤d中配制了维生素B12浓度分别为0、0. 03,0. 06,0. 09,0. 12,0. 18mg/100g的标准品溶液，且标准品溶液的配制方法为加入I. 8-2. 2mL无菌水至维生素B12标准品瓶中得到维生素B12标准品，用移液器溶解维生素B12标准品，用标准品瓶中的溶液冲洗移液器尖，得到标准品浓缩液，使用标准品浓缩液配制得到不同浓度的标准品溶液。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤e中取与标准品溶液和灭菌液份数对应的微孔板条，分别用移液器吸取150 u L杀菌基液至板条的全部微孔中，分别用移液器吸取150 u L标准品溶液和灭菌液至指定的微孔中，分别用移液器吸取德氏乳杆菌5 u L菌液至板条的微孔中，用粘合箔盖住微孔板条的微孔，在370C ±1°C黑暗条件下孵育44-48小时。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤f中将微孔板在漩涡混合器上振荡，使微生物悬浊在测试液中，用破坏微孔测试液表面所有的泡沫，用酶标仪在610-630nm或540_550nm条件下分别读取测试液的混浊度。在一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的又一种示意性的实施方式中，步骤h中将与溶解液相对应的测试液的混浊度代入标准曲线方程中得到其维生素B12浓度，将与溶解液相对应的测试液的维生素B12浓度换算得到牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，操作过程简单，且微孔板均为一次性使用，避免了测试中的交叉干扰，结果重现性好。下文将以明确易懂的方式，结合实施例，对ー种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进ー步说明。
具体实施例方式I检测原理
维生素B12是德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii),ATCC 7830生长所必需的营养素。在待测样品处理后，使其中只含有德氏乳杆菌，德氏乳杆菌的生长响应与待测样品中维生素B12含量呈线性关系。用比浊法測定待测样品中细菌増殖后的混浊度，通过与标准曲线相比较计算出待测样品中维生素B12的含量。2仪器设备与试剂 2.1仪器设备
水浴锅(能达到95 °C )，酶标仪(610-630或540-550nm)，微孔板，超净工作台，培养箱37°C ±l°C，(X2ym或0·22μπι无菌滤膜。可调移液器(λ 5-10 μ L、20_200 μ L和100-1000 μ L,移液器头20-200 μ L和100-1000 μ L (需灭菌)，50mL离心管，15mL离心管(需灭菌)，I. 5mL或2. OmL离心管(需灭菌)，标准品瓶，5mL或IOmL —次性无菌注射器，维生素B12标准品瓶。2. 2 试剂 所用试剂如下
(1)德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii), ATCC 7830,市售;
(2)维生素B12粉末标准品，市售，容纳维生素B12标准品的瓶子即为维生素B12标准品瓶;
(3)维生素B12培养基，其中含有除维生素B12外，德氏乳杆菌生长所需要的其他物质，自制；
(4)蒸馏水或纯水，自制。实施例I
I、牛奶处理方法如下 加入ImL牛奶样品至50mL离心管中，准确加入蒸馏水或纯水39mL，漩涡混匀得到溶解液。在超净台中用O. 2 μ m无菌滤膜过滤杀菌得到灭菌液，将灭菌液存储至I. 5mL无菌试管中。其中，可以根据需要使用O. 22 μ m无菌滤膜，与O. 2 μ m无菌滤膜相比两者并不产生使用效果上的差别；同时可以根据需要使用2. OmL无菌试管，与I. 5mL无菌试管相比两者并不产生使用效果上的差别。本方法的检出限是O. 03 μ g/100g,检测范围是O. 03-0. 18 μ g/100g。2、培养基处理方法如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入IOmL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀得到培养基液。将培养基液在90°C水浴中加热5分钟，其间振荡至少2次(保证瓶子封闭)，迅速冷却至室温(低于30°C )。使用0. 2 μ m无菌滤膜过滤杀菌得到杀菌基液，将杀菌基液存储至15mL无菌离心管中。3、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入I. SmL无菌水至维生素B12标准品瓶中，用移液器溶解维生素B12标准品，为了使维生素B12标准品充分溶解，用标准品瓶中的溶液冲洗移液器尖，得到标准品浓缩液，取6个I. 5mL无菌管，使用无菌水和标准品浓缩液配制维生素B12浓度分别为0、0. 03、
0.06,0. 09,0. 12,0. 18mg/100g 的标准品溶液。4、测试液的制备过程如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。(I)取微孔板条并在板上固定，其中微孔板上微孔的数量为七个，它们分别可用来盛放六个维生素B12浓度的标准品溶液，以及牛奶配制得到的灭菌液，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2-8°C条件下；
(2)分别用移液器吸取150μ L杀菌基液至每一个微孔中；
(3)分别用移液器吸取150μ L不同维生素Β12浓度的标准品溶液(0、0. 03,0. 06,0. 09、0.12,0. 18mg/100g)和灭菌液至指定的微孔中，即吸取标准品溶液至微孔板上的六个微孔中，吸取灭菌液至剩下的一个微孔中；
(4)分别用移液器吸取德氏乳杆菌5u L菌液至板条的微孔中；
(5)用粘合箔盖住微孔，除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条，保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。(6)在36°C黑暗条件下(可用孵育器)孵育44小时，得到七份测试液。5、使用酶标仪测量测试液
再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在漩涡混合器上振荡，使微生物分别悬浊于测试液中，沿对角揭去粘合箔。用移液器枪头破坏微孔内测试液表面所有的泡沫。使用酶标仪在610-630nm条件下分别读取七份测试液的混浊度。 6、数据处理
绘制酶标仪混浊度与六个标准品溶液相对应的测试液中维生素B12浓度之间的曲线，其中纵坐标为酶标仪混浊度，横坐标为测试液中维生素B12浓度，拟合得到曲线的方程。将于溶解液对应的测试液的混浊度数据代入拟合得到的方程中，计算得到测试液中维生素B12浓度，根据牛奶到溶解液到测试液的稀释关系，换算出牛奶中维生素B12的浓度。一种牛奶中维生素B12的检测方法，操作过程简单，且微孔板均为一次性使用，避免了测试中的交叉干扰，结果重现性好。实施例2
I、牛奶处理方法如下
加入ImL牛奶样品至50mL离心管中，准确加入蒸馏水或纯水39mL，漩涡混匀得到溶解液。在超净台中用0. 22 ii m无菌滤膜过滤杀菌得到灭菌液，将灭菌液存储至2. OmL无菌试管中。本方法的检出限是0. 03 U g/100g,检测范围是0. 03-0. 18 U g/100g。2、培养基处理方法如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入IOmL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀得到培养基液。将培养基液在100°C水浴中加热10分钟，其间振荡至少2次(保证瓶子封闭)，迅速冷却至室温(低于30°C )。使用0. 22 ii m无菌滤膜过滤杀菌得到杀菌基液，将杀菌基液存储至15mL无菌离心管中。3、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入2. 2mL无菌水至维生素B12标准品瓶中，用移液器溶解维生素B12标准品，用标准品瓶中的溶液冲洗移液器尖，得到标准品浓缩液，取6个I. 5mL无菌管，使用无菌水和标准品浓缩液配制维生素B12浓度分别为0、0. 03,0. 06,0. 09,0. 12,0. 18mg/100g的标准品溶液。4、测试液的制备过程如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。
(I)取微孔板条并在板上固定，其中微孔板上微孔的数量为七个，它们分别可用来盛放六个维生素B12浓度的标准品溶液，以及牛奶配制得到的灭菌液，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2-8°C条件下；
(2)分别用移液器吸取150μ L杀菌基液至每一个微孔中；
(3)分别用移液器吸取150μ L不同维生素Β12浓度的标准品溶液(0、0. 03,0. 06,0. 09、
O.12,0. 18mg/100g)和灭菌液至指定的微孔中，即吸取标准品溶液至微孔板上的六个微孔中，吸取灭菌液至剩下的一个微孔中；
(4)分别用移液器吸取德氏乳杆菌5μ L菌液至板条的微孔中；
(5)用粘合箔盖住微孔，除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条，保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘 部分。(6)在38°C黑暗条件下(可用孵育器)孵育48小时，得到七份测试液。5、使用酶标仪测量测试液
再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在漩涡混合器上振荡，使微生物分别悬浊于测试液中，沿对角揭去粘合箔。用移液器枪头破坏微孔内测试液表面所有的泡沫。使用酶标仪在540-550nm条件下分别读取七份测试液的混浊度。6、数据处理
绘制酶标仪混浊度与六个标准品溶液相对应的测试液中维生素B12浓度之间的曲线，其中纵坐标为酶标仪混浊度，横坐标为测试液中维生素B12浓度，拟合得到曲线的方程。将于溶解液对应的测试液的混浊度数据代入拟合得到的方程中，计算得到测试液中维生素B12浓度，根据牛奶到溶解液到测试液的稀释关系，换算出牛奶中维生素B12的浓度。实施例3
I、奶粉处理方法如下
加入Ig奶粉至50mL离心管中，准确加入蒸馏水或纯水39mL，漩涡混匀得到溶解液。在超净台中用O. 22 μ m无菌滤膜过滤杀菌得到灭菌液，将灭菌液存储至2. OmL无菌试管中。本方法的检出限是O. 03 μ g/100g,检测范围是O. 03-0. 18 μ g/100g。2、培养基处理方法如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入IOmL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀得到培养基液。将培养基液在100°C水浴中加热20分钟，其间振荡至少2次(保证瓶子封闭)，迅速冷却至室温(低于30°C )。使用O. 22 μ m无菌滤膜过滤杀菌得到杀菌基液，将杀菌基液存储至15mL无菌离心管中。3、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。加入2. 2mL无菌水至维生素B12标准品瓶中，用移液器溶解维生素B12标准品，用标准品瓶中的溶液冲洗移液器尖，得到标准品浓缩液，取6个I. 5mL无菌管，使用无菌水和标准品浓缩液配制维生素B12浓度分别为0、0. 03,0. 06,0. 09,0. 12,0. 18mg/100g的标准品溶液。
4、测试液的制备过程如下
本步骤中所有操作需在超净台内进行。(I)取微孔板条并在板上固定，其中微孔板上微孔的数量为七个，它们分别可用来盛放六个维生素B12浓度的标准品溶液，以及奶粉配制得到的灭菌液，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2-8°C条件下；
(2)分别用移液器吸取150y L杀菌基液至每ー个微孔中；
(3)分别用移液器吸取150u L不同维生素B12浓度的标准品溶液(0、0. 03,0. 06,0. 09、
0.12,0. 18mg/100g)和灭菌液至指定的微孔中，即吸取标准品溶液至微孔板上的六个微孔中，吸取灭菌液至剩下的一个微孔中；
(4)分别用移液器吸取德氏乳杆菌5u L菌液至板条的微孔中；·
(5)用粘合箔盖住微孔，除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条，保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。(6)在37°C黑暗条件下(可用孵育器)孵育48小时，得到七份测试液。5、使用酶标仪测量测试液
再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在漩涡混合器上振荡，使微生物分别悬浊于测试液中，沿对角揭去粘合箔。用移液器枪头破坏微孔内测试液表面所有的泡沫。使用酶标仪在540-550nm条件下分别读取七份测试液的混浊度。6、数据处理
绘制酶标仪混浊度与六个标准品溶液相对应的测试液中维生素B12浓度之间的曲线，其中纵坐标为酶标仪混浊度，横坐标为测试液中维生素B12浓度，拟合得到曲线的方程。将于溶解液对应的测试液的混浊度数据代入拟合得到的方程中，计算得到测试液中维生素B12浓度，根据奶粉到溶解液到测试液的稀释关系，换算出奶粉中维生素B12的浓度。在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何图示、实施方式解释为ー种更优选的或更具优点的技术方案。应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为ー个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种牛奶或奶粉中维生素B12的检测方法，其包括 a、将牛奶或奶粉定容混匀得到溶解液； b、将所述溶解液杀菌，得到灭菌液，存储所述灭菌液； C、配制维生素B12的培养基液，将所述培养基液杀菌得到杀菌基液，存储所述杀菌基液； d、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液； e、分别将所述杀菌基液、所述灭菌液、德氏乳杆菌和所述标准品溶液加入微孔板条的相应微孔中，孵育得到测试液； f、处理所述测试液，使微生物悬浊其中，用酶标仪读取它们的混浊度； g、绘制与所述标准品溶液相对应的所述测试液中，所述测试液中维生素B12的浓度与所述测试液混浊度的标准曲线； h、将所述溶解液相对应的所述测试液的混浊度代入所述标准曲线中，换算得到所述牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。
2.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤a为取所述牛奶lmL，放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀得到所述溶解液。
3.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤a为取所述奶粉lg，且放入50mL的离心管中用蒸馏水或纯水定容并漩涡混匀得到所述溶解液。
4.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤b中所述溶解液在超净台用O.2μπι或O.22 um无菌滤膜过滤杀菌，得到所述灭菌液，将所述灭菌液存储于I. 5mL或2. OmL无菌试管中。
5.如权利要求I所述的检测方法,其中步骤c中加入IOmL无菌水至维生素B12培养基中，盖好瓶盖，摇匀，得到所述培养基液，将所述培养基液在90-100°C水浴中加热至少5分钟，其间振荡至少2次，迅速冷却至室温，使用0.2μπι或0.22μπι无菌滤膜过滤杀菌所述培养基液得到所述杀菌基液，将所述杀菌基液存储于15mL无菌离心管中。
6.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤d中配制了维生素B12浓度分别为O、O.03、0.06,0. 09,0. 12,0. 18mg/100g的所述标准品溶液，且所述标准品溶液的配制方法为加入1.8-2. 2mL无菌水至维生素B12标准品瓶中得到维生素B12标准品，用移液器溶解维生素B12标准品，得到标准品浓缩液，使用所述标准品浓缩液配制得到不同浓度的所述标准品溶液。
7.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤e中取与所述标准品溶液和所述溶解液份数对应的微孔板条，分别用移液器吸取150 μ L所述杀菌基液至板条的全部微孔中，分别用移液器吸取150 μ L所述标准品溶液和所述灭菌液至指定的微孔中，分别用移液器吸取德氏乳杆菌5μ L菌液至板条的微孔中，用粘合箔盖住微孔板条的微孔，在37°C ±1°C黑暗条件下孵育44-48小时。
8.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤f中将所述微孔板在漩涡混合器上振荡，使微生物悬池在所述测试液中，破坏所述测试液表面所有的泡沫，用酶标仪在610_630nm或540-550nm条件下分别读取所述测试液的混浊度。
9.如权利要求I所述的检测方法，其中步骤h中将与所述溶解液相对应的测试液的混浊度代入标准曲线方程中得到其维生素B12浓度，将与所述溶解液相对应的测试液的维生素B12浓度換算得到所述 牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。
全文摘要
一种牛奶和奶粉中维生素B12的检测方法，包括a、将牛奶或奶粉原样定容混匀得到溶解液；b、杀菌后存储灭菌液；c、配制维生素B12的培养基液，杀菌得到杀菌基液，存储杀菌基液；d、配制不同维生素B12浓度的标准品溶液；e、分别将杀菌基液、灭菌液、德氏乳杆菌和标准品溶液加入微孔板条的相应微孔中，孵育得到测试液；f、使微生物悬浊测试液中，用酶标仪读取它们的混浊度；g、绘制测试液中维生素B12的浓度与测试液混浊度的标准曲线；h、将溶解液相对应的测试液的混浊度代入标准曲线中，换算得到牛奶或奶粉中维生素B12的浓度。本发明操作过程简单，且微孔板均为一次性使用，避免了测试中的交叉干扰，结果重现性好。
文档编号G01N21/75GK102759523SQ201110108290
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者刘卫星, 刘志楠, 刘晓川, 喻东威, 李梅, 杜丽, 薛志清, 赵源 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司