专利名称：动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物组织石蜡切片的制作方法。
背景技术：
石蜡切片技术是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，广泛地应用于临床病理诊断、教学和科研工作中。动物标本的形态学观察、免疫组化、原位杂交及原位PCR等技术手段，都离不开标本组织的处理和石蜡切片的制作。常规的组织石蜡切片技术使用二甲苯作为透明剂和脱蜡剂，对组织的收缩性强， 作用迅速，但组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬。二甲苯极易挥发，会对人们的健康造成极大的伤害，可造成操作人员患哮喘，甚至癌症。处理废液时，还会造成空气、水源和食物污染。急需一种或多种代替二甲苯的试剂。有一些资料和文献曾报道过一些替代二甲苯的试剂，但还没有成熟的全套技术， 能像本发明一样能够包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。专利和文献资料报道如下专利号为200810136961. X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液” [1]，使用了桉油素，四氢呋喃，苯甲酸甲酯，汽油等化学试剂。个别化学试剂对人体和环境有害，如苯甲酸甲酯的缺点属低毒类，吸入、口服或经皮吸收都对身体有害。蒸气或雾对眼和上呼吸道有刺激性，对皮肤有致敏作用。遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧的危险。该物质对环境可能有危害。汽油的缺点易燃。吸入、食入、经皮肤可被人吸收。急性中毒时对中枢神经系统有麻醉作用。当慢性中毒时，会出现神经衰弱综合症、植物神经功能症状类似精神分裂症。 液体吸入呼吸道可引起吸入性肺炎。溅入眼内可致角膜溃疡、穿孔，甚至失明。皮肤接触致急性接触性皮炎，甚至灼伤。谭俊等[2]在组织切片的制作中，使用了松节油。根据本人实验表明，由于透明液只含有单一的松节油，脱水透明效果欠佳。制作方法如下组织在固定液固定60分钟；入80%乙醇，120分钟；入95%乙醇1，90分钟；入 95%乙醇II，60分钟；入95%乙醇III，60分钟；为无水乙醇1，60分钟；为无水乙醇II，60 分钟；TO型生物制片透明剂(主要成分为松节油)1，90分钟；TO型生物制片透明剂11，90 分钟；石蜡3个缸，分别为60分钟；染色时用TO型生物制片透明剂代替二甲苯进行脱蜡。丁伟星[3]和李海等M在组织切片的制作中，使用了正丁醇进行脱水兼透明，但染色时仍使用了二甲苯。其方法如下组织在固定液固定兼脱水1缸，1小时；入I液，为无水乙醇，温度为 65 °C, 40分钟；正丁醇脱水兼透明3缸，每缸约40-60分钟，温度为65°C。
专利号为200810136961. X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液”中，在脱水时，使用了丙酮和乙醇的混合液，但在透明时，没有再使用丙酮。综上所述，在动物医学专业中，急需一种成熟的全套技术，不含二甲苯，包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。
发明内容
用混合固定液(100ml固定液的比例是85%酒精91ml，甲醛細1，冰醋酸5ml)和混合透明剂(分析纯正丁醇14%，丙酮四％，无水酒精57%，常温下按比例混配制)及松节油脱蜡剂代替二甲苯，制作出绿色环保的动物组织切片。具体方法如下1、手工蜡块制作方法如下(1)固定病变组织块置于混合固定液中固定18至M小时(有其它用途的特殊染色除外)(2)脱水 85%乙醇1小时一95%乙醇1小时一95%乙醇1小时一无水乙醇Il 小时一无水乙醇IIl小时(如果用60°C烤箱，时间均为40分钟)(3)透明混合透明剂中3小时(如果用60°C烤箱，时间为2小时)(4)浸蜡石蜡 I (52-54°C )、II (54-56°C )禾口 III (56-58°C )中分别 1 小时(5)包埋(6)修块、切片和烤片2、自动脱水机制作蜡块方法如下(从当日16时到次日8时)(1)固定病变组织块置于混合固定液中固定4小时(有其它用途的特殊染色除外)(2)脱水85%乙醇40分钟一95%乙醇40分钟一95%乙醇40分钟一无水乙醇 140分钟一无水乙醇1140分钟(3小时20分)(3)透明混合透明剂中2小时(4)浸蜡石蜡 I (52-54°C ) 2 小时、II (54-56°C ) 3 小时和 III (56-58°C )中分别 2小时40分(5)包埋、修块、切片和烤片3、HE染色，用松节油替代二甲苯，时间上比传统长(二甲苯脱蜡2-5分钟，而松节油 脱蜡20-30分钟，且在60°C烤箱中进行)(1)脱蜡至水松节油120-30分钟(在60°C烤箱中进行)一松节油1120-30分钟 (在60°C烤箱中进行)一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一95%乙醇1分钟一80% 乙醇1分钟一70%乙醇1分钟一自来水洗2分钟(2)染色Harris苏木素液20分钟一自来水洗5分钟一1 %盐酸乙醇分化30秒一自来水洗一饱和碳酸锂30秒一自来水水1分钟一伊红10分钟(3)脱水、透明和封固 75%乙醇20秒一80%乙醇40秒一90%乙醇1分钟一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一风干后，直接用松节油稀释的中性树胶封固。
具体实施例方式以下通过几个实施例对本发明的效果进行说明。实施例1 猪蓝耳病的病理学观察选择有代表性的病猪的各个病变器官组织块，当日下午16点置于混合固定液中。次日上午8点，组织入85 %乙醇1小时。9点，组织入95 %乙醇1小时。10点，组织入95 %乙醇1小时11点，组织入无水乙醇11小时12点，组织入无水乙醇IIl小时(如果用60°C烤箱，以上脱水时间均为40分钟)13点，组织入混合透明剂中3小时(如果用60°C烤箱，时间为2小时)16点，组织入52_54°C熔点的石蜡I中1小时(在60°C烤箱中进行)17点，组织入M_56°C熔点的石蜡II中1小时(在60°C烤箱中进行)18点，组织入56_58°C熔点的石蜡III中1小时(在60°C烤箱中进行)19点，进行包埋至此，蜡块做好。切片时，放入冰箱冷冻层冻1小时后，取出可以进行常规切片。切片进行染色的具体步骤如下(1)脱蜡至水松节油120-30分钟(在60°C烤箱中进行)一松节油1120-30分钟 (在60°C烤箱中进行)一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一95%乙醇1分钟一80% 乙醇1分钟一70%乙醇1分钟一自来水洗2分钟(2)染色Harris苏木素液20分钟一自来水洗5分钟一1 %盐酸乙醇分化30秒一自来水洗一饱和碳酸锂30秒一自来水1分钟一伊红10分钟(3)脱水、透明和封固入75%乙醇20秒一80%乙醇40秒一90%乙醇1分钟一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一风干后，直接用松节油稀释的中性树胶封固。以下为本病例的病理组织学观察结果。
肺脏部分区实变，部分肺泡扩张破裂，部分肺泡内有淋巴细胞、红细胞、组织细胞渗出，扩张的肺泡中有脱落的肺泡上皮组织细胞，肺泡毛细血管扩张充血。肺间质可见淋巴细胞、组织细胞呈小灶状分布。肝脏肝小梁间质增宽，小血管扩张充血，间质有淋巴细胞、组织细胞渗出，肝血窦扩张，窦内淋巴细胞肥大、增生，肝细胞体积增大。肾脏肾小球毛细血管扩张、充血，间质水肿，组织细胞形成小结，有散在淋巴细胞，肾小管上皮细胞颗粒变性，肾脏中有脱落的肾小管上皮细胞。脾脏脾动脉淋巴鞘变薄，有坏死灶，有组织细胞、少量淋巴细胞和少量嗜酸性粒细胞渗出。淋巴结弥漫性肿大，淋巴细胞弥漫增生，淋巴窦扩张，有浆液渗出，淋巴细胞、组织细胞和少量巨噬细胞渗出，滤泡局灶性坏死。实施例2 獭兔螨虫病的病理学观察取皮损组织，按实施例1猪蓝耳病的病理学观察的组织蜡块制作和切片染色的方法，进行。以下为本病例的组织病理学观察结果。皮肤角化层增厚毛细血管扩张充血角化层增厚，皮下组织疏松水肿(有炎症)，可
5见大量虫体，有炎细胞浸润。实施例3 火鸡滴虫病的病理学观察取病死鸡肝脏病变病灶组织，按实施例1猪蓝耳病的病理学观察的组织蜡块制作和切片染色的方法进行。以下为本病例的组织病理学观察结果。火鸡肝脏实质内具有散在和广泛性融合性肝细胞大量坏死，并与周围组织分界不清。肝脏的组织减少。小叶间胆管扩张、胆管内有组织滴虫寄生。胆管数量增多，胆管上皮细胞脱落。综上所述，本发明为绿色制片法制作动物组织石蜡切片技术，其特点如下1、从蜡块制作和切片染色的全程中，试剂种类少、不含有毒物质和污染物质的化学试剂。2、使用混合固定液(100ml固定液的比例是85 %酒精91ml，甲醛細1，冰醋酸 5ml)和混合透明剂(分析纯正丁醇14%，丙酮四％，无水酒精57%，常温下按比例混配制) 及松节油脱蜡剂代替二甲苯，制作出绿色环保的动物组织切片。正丁醇的沸点为117°C _118°C，挥发慢。其饱和吸水量，比乙醇大。丙酮的脱水能力比酒精强，且脱水速度快，但容易使组织过度硬化。三种试剂取长补短，代替二甲苯，加快了脱水速度，不会引起组织块过度收缩和硬化，并且不存在透明时间过长的问题。3、用绿色制片法制作的石蜡组织切片，镜下观察组织结构清晰完整，颜色鲜艳协调，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈淡粉色，对比度好，层次分明。细胞大小和细胞间距与传统相比，没见明显差异。4、本发明是结合二十多年临床医学实践和动物医学的教学和科研实践而创造的， 并经过多年实践验证的制作动物石蜡组织切片的新方法，可以代替传统方法，低能减排，是绿色环保型的。参考文献[1]赵晓辉.专利号为200810136961. X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片 HE染色无二甲苯全程处理液”[2]谭俊，符弘枚.松节油型生物制片透明剂在HE制片中的应用.国际检验医学杂志”，2010，31 (8) :908-909[3] 丁伟星.正丁醇在组织制备中的应用”，河北医学，1998,4(3) :68-69[4]李海，邓志勇，陈金珍，陈芳等.正丁醇及乙醇在病理组织制片中的改进应用”，实用医技杂志，2008，15(11) =4389-4390
图1-6为施例1猪蓝耳病的病理学观察结果图1是患有蓝耳病的病猪，皮肤发绀，肝脏肿大淤血，黑红色图2是病猪的肺脏，肺间质可见淋巴细胞、组织细胞呈小灶状分布 H. E 400X图3是病猪的肝脏，肝脏间质血管扩张，有淋巴细胞、组织细胞渗出H. E 400X图4是病猪的肾脏，肾小管上皮细胞颗粒变性，间质水肿，淋巴细胞和组织细胞形成小结H. E 400 X图5是病猪的脾脏，脾动脉淋巴鞘变薄，有坏死灶H. E 400 X
图6是病猪的淋巴结，淋巴细胞弥漫增生，滤泡局灶性坏死H. E 100Xa 7-102 Mmm^mmmi^mm^m图7是病兔，精神萎靡不振，耳部皮肤红肿，皮肤增厚，有结痂图8是兔的皮肤，血管扩张充血H.E 200X图9是兔的皮肤，皮肤角化层增厚H. E 400X图10是兔的皮肤，皮下有大量虫体H.E 400XS 11-143 "ja點商虫病的病理学观察结果图11是火鸡，腹腔内有淡黄色液体，肝脏肿大，有圆形中央稍凹陷或微突、边缘稍降起、中心黄绿色或黄白色、边缘灰白色的大小不等的坏死灶。盲肠肿大，壁增厚。图12是火鸡的肝脏，肝细胞坏死H. E 400 X
图13是火鸡的肝脏，胆管内有虫体H. E 400 X
图14是火鸡的肝脏，胆管上皮细胞脱落H. E 400 X ο
权利要求
1.动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术，其特征在于使用简单环保化学试剂，制作动物组织石蜡切片，减少试剂种类的适应，减少试剂对人体和环境的危害，且易于推广。具体分为组织脱水和切片染色两部分。(1)组织脱水混合固定液100ml固定液的比例是85%酒精91ml，甲醛細1，冰醋酸5ml。混合透明剂用分析纯正丁醇14%，丙酮，无水酒精57%，常温下按比例混配。(2)切片染色切片脱蜡液I 用分析纯松节油，60°C烤箱中进行。切片脱蜡液II 用分析纯松节油，60°C烤箱中进行。用伊红染色后，梯度酒精脱水后，自然风干，直接用松节油稀释的树胶封片。
2.在整个蜡块制作和切片染色过程中，没有使用传统的透明和脱蜡剂二甲苯，使用的试剂，不对人体和环境产生危害作用。
3.根据权利1和2的要求，动物组织取材后，放入混合固定液中，18-M小时后，经梯度酒精脱水，进入混合透明剂中3个小时，然后进入石蜡1(52- °C )、11(54-56°C )和 III (56-58°C )中分另Ij 1个小时，然后包埋。
4.如果在60°C烤箱中进行梯度酒精脱水，则各酒精中的时间均为40分钟，在混合透明剂中2小时，其它同上；自动脱水机制作蜡块时，病变组织块置于混合固定液中固定4 小时，各酒精中的时间均为40分钟，混合透明剂中2小时，石蜡I (52- °C ) 2小时，石蜡 II (54-560C ) 3小时，石蜡III (56-580C )中2小时40分，然后包埋。
5.根据权利1和2的要求，切片放入切片脱蜡液I和II60°C烤箱中，分别20-30分钟，然后进行下行脱水和苏木素染核，盐酸酒精脱色和饱和碳酸锂的兰化后，进行伊红染色及上行脱水到纯酒精，然后风干，直接用松节油稀释的树胶封片。
全文摘要
本发明“动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术”的目的在于提供一种应用于农业大学动物医学等专业对动物组织进行石蜡切片的技术。特点是使用化学试剂种类少，无毒害，对组织脱水彻底，加快制片的同时又不使组织过度收缩和硬度增加。替代了对传统石蜡切片制作中对人体有害的二甲苯的使用，消除由此产生的职业病和环境污染。组织由混合固定液(100ml固定液的比例是85％酒精91ml，甲醛4ml，冰醋酸5ml)固定和梯度酒精脱水后，置入混合透明剂(分析纯正丁醇14％，丙酮29％，无水酒精57％)中，3小时，然后进行常规浸蜡和包埋。切片染色时，用分析纯松节油(60℃)，进行两次脱蜡，常温下行水化，苏木素染核、脱色、兰化及伊红染色。上行脱水到纯酒精后，风干，直接用松节油稀释的树胶封片。
文档编号G01N1/28GK102279121SQ20111017568
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者任亚超, 兰明慧, 吴海燕, 周玉龙, 孙斌, 范春玲, 郭东华, 郭婷, 齐欣 申请人:黑龙江八一农垦大学