专利名称：片仔癀原药材及片仔癀的质量检测方法
技术领域：
本发明涉及中药材的质量检测方法，特别涉及片仔癀原药材及片仔癀的质量检测方法。
背景技术：
片仔癀的质量控制标准收载于卫生部标准中药成方制剂第十八册WS3-B-3381-98，仅收载两个反应及三七的薄层色谱鉴别项目。片仔癀是由三七、牛黄、蛇胆、麝香等多种名贵中药材精制而成的复方中药制剂，生产工艺条件乃国家级保密。陈海滨等对片仔癀中三七的薄层鉴别进行改进，增加了对牛黄和蛇胆的薄层色谱鉴别，同时利用气相色谱法测定麝香酮的含量；赖延锦等采用高效液相色谱梯度洗脱法同时测定了三七皂苷R1、人参阜苷Rg1、人参阜苷Rb1及牛磺胆酸钠四种成分的含量；此外，还有一些相关研究，主要是测定片仔癀中某单一组分，如分别用HPLC和紫外分光光度法测定胆红素、利用气相 色谱测定麝香酮等。而片仔癀由三七、牛黄、蛇胆、麝香等多种名贵中药材精制而成的复方中药制剂，其成分相当复杂，包含百十种化学成分，其药效是各成分整体协同的结果。因此，仅用有限的化学对照品，测定药物中少数几种化学成分或浓度大的化学成分，不一定真正代表药物中有效的化学成分，而其它化学成分和浓度小的化学成分也有可能对疗效有一定的影响。单一或少量化学成分的定性或定量指标，难以保证制剂的质量稳定，需要进一步发展片仔癀质量的控制方法和手段，建立更加科学、完善的质量标准，符合国际药品质量控制要求，保证片仔癀质量稳定，使产品更具有国际市场竟争力。中药指纹图谱是指以系统的化学成分研究和药理学研究为基础，经化学测定或基因鉴定得到的某种或某产地中药及其制剂所共有的、具有特异性的组分群体(某类或数类成分)特征图谱或图像。中药指纹图谱的基本属性是整体性和模糊性，要求专属、稳定、实用，具有系统性、特征性和稳定性等特征。指纹图谱既具定性(通过特征峰群、峰位)功能，又具定量(峰高、峰面积)功能，在一定程度上可较全面控制药品质量，同时通过对原药材和成品的指纹图谱控制，可基本解决批次间的一致性问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种片仔癀中三七药材的质量检测方法；本发明目的还在于提供一种片仔癀的质量检测方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的。I、本发明片仔癀中三七药材的质量检测方法，包括如下指纹图谱检测方法照高效液相色谱法色谱条件及系统适用性试验选用Welch XB-C18色谱柱(250mmX4. 6mm，5 μ m)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0 40分钟22%乙腈，流速O. 5mL/min,40 50分钟22 30%乙臆，流速O. 5mT ,/min, 50 80分钟30 55%乙臆,流速O. 5mL/min, 80 95分钟55%乙腈，流速O. 5mL/min，95 115分钟55 90%乙腈，流速O. 8mL/min, 115 135分钟90%乙腈，流速O. 8mL/min, 135 140分钟90 22%乙腈,流速O. 5mL/min,柱温为25°C,检测波长为203nm ；供试品溶液制备取三七药材粉I 10重量份，精密称定，于具塞锥形瓶中，准确加入50 200体积份70%乙醇溶液(V乙醇V水=7 3)，称重，放置过夜；置80°C 90°C水浴回流I 3小时，待冷至室温，再称重，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，准确移取25 100体积份滤液置于烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至10体积份容量瓶中，定容；用O. 45 μ m针式滤膜过滤至2体积份样品瓶，得三七药材供试品溶液，备用。对照品溶液制备分别准确称取对照品三七皂苷R1O. 00569g、人参皂苷Rg1O. 00896g、Rb1O. 00809g、ReO. 00103g、Rg2O. 00605g、Rh1O. 00409g、RdO. 00787g、RfO. 01180g、Rc0. 00619g，加甲醇溶解定容25mL，制成对照品混合溶液。测定法分别吸取供试品溶液和对照品混合溶液O. 005体积份，注入液相色谱仪 中，记录170分钟色谱图，以峰面积最大、较稳定的共有峰Rgl为内标物作为参照物，分别以其保留时间和峰面积作为1，计算各共有峰相对保留时间；供试品指纹图谱与标准指纹图谱(见附图I)相似度为I ;所得指纹图谱应有23个共有峰，分别是1-12、14-19、23、26、28、29、32号峰，共有峰的相对保留时间分别为27. 125,37. 341,39. 333,57. 772,63. 659,64. 751,65. 441、66.391,67.619,68.662,69.171,69.773,71.53,72.633,73.478,81.212,83.71,85.151、91. 732,104. 717,109. 83,110. 29,113.46。相对峰面积比值分别为0.199,1. 000,0. 118,0. 006,0. 020,0. 021,0. 006,0. 670、O.038,0.004,0.026,0.047,0. 175,0. 007,0. 029,0. 006,0. 006,0. 013,0. 012,0.004、O.0019,0. 004,0. 009。本发明片仔癀中三七药材的质量检测方法，还包括如下步骤按照如上所述液相色谱条件进行液质联用(LC-MS/T0F)分析，根据各峰所对应的编号、色谱图中的位置和相应的质谱图推测各峰化学式，质谱条件为雾化器压力_35psi，干燥气流速9. OL/min，干燥温度325°C ；各共有峰对应的化学式分别为1-3号、8号、11-12号峰及14号分别是三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Rb1, Re、Rg2' %、Rd ；4 号峰为 C41H70O13 ；5 号峰为 C59H100O27 ；6 号峰为C59H100O27 ;7 号峰为 C42H72O14 和 C54H90O23 ;9 号峰为 C41H70O13 ; 10 号峰为 C53H90O22 ; 15 号峰为C36H62O9 ；16 号峰为 C48H82O18 ；17 号峰为 C42H70O13 ；18 号峰为 C36H60O8 ；19 号峰为 C36H60O8 ；23 号峰为 C25H8O18 和 C21H8O17 ；26 号峰为 C18H32O3 ；28 号峰为 C29H12O22 ；29 号峰为 C15H21O2 ；32 号峰为。29氏4〇25。2、本发明片仔癀的质量检测方法，包括如下指纹图谱检测照高效液相色谱法色谱条件及系统适用性试验选用Welch XB-C18色谱柱(250mmX4. 6mm，5 μ m)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0 40分钟22%乙腈，流速O. 5mL/min,40 50分钟22 30%乙臆，流速O. 5mT ,/min, 50 80分钟30 55%乙臆,流速O. 5mL/min, 80 95分钟55%乙腈，流速O. 5mL/min，95 115分钟55 90%乙腈，流速O. 8mL/min, 115 135分钟90%乙腈，流速O. 8mL/min, 135 140分钟90 22%乙腈,流速O. 5mL/min,柱温为25°C,检测波长为203nm ；供试品溶液制备取市售片仔癀(锭剂)I 10重量份，经研钵研细，过筛5号或80目，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50 200体积份70%乙醇溶液(Vis V* =7 3)，称重，放置过夜；置80°C 90°C水浴回流I 3小时，待冷至室温，再称重，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，准确移取25 100体积份滤液置于烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至10体积份容量瓶中，定容；用0.4511111针式滤膜过滤至2体积份样品瓶，备用。对照品溶液制备分别准确称取对照品三 七皂苷R1O. 00569g、人参皂苷Rg1O. 00896g、Rb1O. 00809g、ReO. 00103g、Rg2O. 00605g、Rh1O. 00409g、RdO. 00787g、RfO. 01180g、RcO. 00619g，加甲醇溶解定容25mL，制成对照品混合溶液。测定法分别吸取供试品溶液和对照品混合溶液O. 005体积份，注入液相色谱仪中，记录170分钟色谱图，以峰面积最大、较稳定的共有峰Rgl为内标物作为参照物，分别以其保留时间和峰面积作为1，计算各共有峰相对保留时间；供试品指纹图谱与标准指纹图谱(见附图3)相似度大于O. 998。所得指纹图谱应有16个共有峰，共有峰分别是1-9、11、12、14-16、19和27号峰，共有峰的相对保留时间分别为27. 557,37. 956,39. 968,57. 919,63. 809,64. 917,65. 613、66.549,67.785,69. 34,69. 948,71. 733,72. 821,73. 697,85. 395,105. 602。相对峰面积比值分别为0.204,1. 000,0. 116,0. 006,0. 020,0. 021,0. 006,0. 677、
O.040,0.026,0. 050,0. 183,0. 015,0. 033,0. 012,0. 013。本发明片仔癀成品的质量检测方法，还包括如下步骤按照所述液相色谱条件进行液质联用(LC-MS/T0F)分析，根据各峰所对应的编号、色谱图中的位置和相应的质谱图推测各峰化学式，质谱条件为雾化器压力(Nebulizer)_35psi,干燥气流速(Dry Gas)-9. OL/min,干燥温度(Dry Temp)_325°C。各共有峰对应的化学式分别为1-3号、8号、11-12号峰及14号峰分别是三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg” Rb” Re、Rg2' Rh” Rd ；4 号峰为 C41H70O13 ；5 号峰为 C59H100O27 ；6 号峰为 C59H100O27 ；7 号峰为 C42H72O14 或 C54H90O23 ；9 号峰为 C41H70O13 ；15 号峰为 C36H62O9 ；16 号峰为C48H82O18 ；19 号峰为 C36H60O8 ；27 号峰为 C18H32O30本发明所述片仔癀可以是市售的，由漳州片仔癀药业股份有限公司制造销售。本发明所述重量份和体积份的单位对应关系为g/ml。本发明质量检测方法确认了三七药材的提取方法，优化了色谱条件，建立了三七药材及片仔癀中间品和片仔癀成品的液相色谱对照指纹图谱，确定了相对保留时间及色谱峰较稳定的共有峰分别为23、18和16个峰，相似度分别为1、均> 0. 981和均> 0. 998，且共有峰的总面积的相对标准偏差分别为I. 24%,3. 26%和I. 64%。依靠建立的对照指纹图谱结合质谱分析能更有效地监控和评价片仔癀的质量，使片仔癀质控体系更加完整，可从整体反映片仔癀内在质量的稳定、可控。
图I片仔癀三七药材标准指纹图谱图2片仔癀成品标准指纹图谱
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例I三七药材提取方法的选择I、提取溶剂的初步选取取0.6g三七粉(过4号筛，65目，粒径250±9. 9 μ m)，精密称定，首先尝试先用30mL乙醚分3次超声提取，滤纸过滤，残渣挥干乙醚溶剂后，再用60mL甲醇或70%甲醇分3次超声提取，滤纸过滤，滤液减压浓缩至干，用相应溶剂溶解，定容于25mL容量瓶中，过滤(O. 45 μ m针式滤膜)至2mL样品瓶中，精确吸取5 μ L，注入液相色谱仪，检测。色谱条件参照中国药典，稍作修改，柱温为25°C，流速为I. OmL/min，检测波长为203nm，乙腈和水为流动相，色谱条件I程序如下
权利要求
1.一种片仔癀中三七药材的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱检测方法 照高效液相色谱法色谱条件及系统适用性试验选用Welch XB-C18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0 40分钟22%乙腈，流速O. 5mL/min，40 50分钟22 30%乙腈，流速O. 5mL/min，50 80分钟30 55%乙臆，流速O. 5mL/min, 80 95分钟55%乙臆，流速O. 5mL/min, 95 115分钟55 90%乙臆,流速O. 8mL/min, 115 135分钟90%乙臆,流速O. 8mL/min, 135 140分钟90 22%乙腈，流速O. 5mL/min,柱温为25°C，检测波长为203nm ； 供试品溶液制备取三七药材粉I 10重量份，精密称定，于具塞锥形瓶中，准确加入50 200体积份70%乙醇溶液，称重，放置过夜；置80°C 90°C水浴回流I 3小时，待冷至室温，再称重，用70%乙醇溶液补足减失的重量,摇匀,过滤,准确移取25 100体积份滤液置于烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至10体积份容量瓶中，定容；用O. 45 μ m针式滤膜过滤至2体积份样品瓶，得三七药材供试品溶液，备用； 对照品溶液制备分别准确称取对照品三七皂苷R1O. 00569g、人参皂苷Rg1O. 00896g、Rb1O.00809g、ReO. 00103g、Rg2O. 00605g、Rh1O. 00409g、RdO.00787g、RfO.01180g、RcO. 00619g,加甲醇溶解定容25mL,制成对照品混合溶液； 测定法分别吸取供试品溶液和对照品混合溶液O. 005体积份，注入液相色谱仪中，记录170分钟色谱图，以峰面积最大、较稳定的共有峰Rgl为内标物作为参照物，分别以其保留时间和峰面积作为1，计算各共有峰相对保留时间；供试品指纹图谱与标准指纹图谱相似度为I ; 所得指纹图谱应有23个共有峰，分别是1-12、14-19、23、26、28、29、32号峰，共有峰的相对保留时间分别为27. 125,37. 341,39. 333,57. 772,63. 659,64. 751,65. 441,66. 391、67. 619,68. 662,69. 171,69. 773,71. 53,72. 633,73. 478,81. 212,83. 71,85. 151,91. 732、104.717,109. 83,110. 29,113. 46 ；相对峰面积比值分另Ij 为0. 199、I. 000,0. 118,0. 006,0. 020,0. 021、O. 006,0. 670、O.038,0.004,0.026,0.047,0.175,0. 007,0. 029,0. 006,0. 006,0. 013,0. 012,0. 004、O.0019,0. 004,0. 009。
2.如权利要求I所述的片仔癀中三七药材的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下步骤 按照权利要求I中所述液相色谱条件进行液质联用分析，根据各峰所对应的编号、色谱图中的位置和相应的质谱图推测各峰化学式，质谱条件为雾化器压力_35psi，干燥气流速9. OL/min，干燥温度325°C ； 各共有峰对应的化学式分别为1-3号、8号、11-12号峰及14号分别是三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1 為、Re、Rg2、Rh” Rd ;4 号峰为 C41H70O13 ;5 号峰为 C59H100O27 ;6 号峰为 C59H100O27 ；7号峰为 C42H72O14 和 C54H90O23 ；9 号峰为 C41H70O13 ；10 号峰为 C53H90O22 ；15 号峰为 C36H62O9 ；16 号峰为 C48H82O18 ；17 号峰为 C42H70O13 ；18 号峰为 C36H60O8 ；19 号峰为 C36H60O8 ；23 号峰为 C25H8O18 和C21H8O17 ；26 号峰为 C18H32O3 ；28 号峰为 C29H12O22 ；29 号峰为 C15H21O2 ；32 号峰为 C29H14O2515
3.如权利要求I或2所述的片仔癀中三七药材的质量检测方法，其特征在于该方法中的供试品溶液制备为取三七药材粉I. Og，精密称定，于250mL具塞锥形瓶中，准确加入50. 00ml70%乙醇溶液，称重，放置过夜；置80°(水浴回流2小时,待冷至室温,再称重,用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，准确移取25. OOml滤液置于50mL烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至IOmL容量瓶中，定容；用O. 45 μ m针式滤膜过滤至2mL样品瓶，得三七药材供试品溶液，备用。
4.一种片仔癀的质量检测方法，，其特征在于该方法包括如下指纹图谱检测 照高效液相色谱法色谱条件及系统适用性试验选用Welch XB-C18色谱柱(250mmX4. 6mm, 5 μ m),以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0 40分钟22%乙腈，流速O. 5mL/min,40 50分钟22 30%乙臆，流速O. 5mL/min, 50 80分钟30 55%乙臆,流速O. 5mL/min, 80 95分钟55%乙腈，流速O. 5mL/min，95 115分钟55 90%乙腈，流速O. 8mL/min, 115 135分钟90%乙腈，流速O. 8mL/min, 135 140分钟90 22%乙腈,流速O. 5mL/min,柱温为25°C,检测波长为203nm; 供试品溶液制备取市售片仔癀(锭剂)I 10重量份，经研钵研细，过筛5号或80目，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50 200体积份70%乙醇溶液(Vie : V水=7 3)，称重，放置过夜；置80°C 90°C水浴回流I 3小时，待冷至室温，再称重，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，准确移取25 100体积份滤液置于烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至10体积份容量瓶中，定容；用O. 45 μ m针式滤膜过滤至2体积份样品瓶，备用； 对照品溶液制备分别准确称取对照品三七皂苷R1O. 00569g、人参皂苷Rg1O. 00896g、Rb1O.00809g、ReO. 00103g、Rg2O. 00605g、Rh1O. 00409g、RdO.00787g、RfO.01180g、RcO. 00619g,加甲醇溶解定容25mL,制成对照品混合溶液； 测定法分别吸取供试品溶液和对照品混合溶液0. 005体积份，注入液相色谱仪中，记录170分钟色谱图，以峰面积最大、较稳定的共有峰Rgl为内标物作为参照物，分别以其保留时间和峰面积作为1，计算各共有峰相对保留时间；供试品指纹图谱与标准指纹图谱相似度大于O. 998 ； 所得指纹图谱应有16个共有峰，共有峰分别是1-9、11、12、14-16、19和27号峰，共有峰的相对保留时间分别为27. 557、37. 956、39. 968、57. 919、63. 809、64. 917、65. 613、·66. 549,67. 785,69. 34,69. 948,71. 733,72. 821,73. 697,85. 395,105.602 ；相对峰面积比值分另Ij 为0. 204,1. 000,0. 116,0. 006,0. 020,0. 021,0. 006,0. 677、·0.040,0.026,0. 050,0. 183,0. 015,0. 033,0. 012,0. 013。
5.如权利要求4所述的片仔癀的质量检测方法，其特征在于该方法还包括如下步骤 按照所述液相色谱条件进行液质联用分析，根据各峰所对应的编号、色谱图中的位置和相应的质谱图推测各峰化学式，质谱条件为雾化器压力_35psi，干燥气流速-9. OL/min，干燥温度-325 °C ； 各共有峰对应的化学式分别为1-3号、8号、11-12号峰及14号峰分别是三七皂苷凡、人参皂苷 Rg1^Rb1, Re, Rg2, Rh1, Rd ;4 号峰为 C41H70O13 ;5 号峰为 C59H100O27 ;6 号峰为 C59H100O27 ；·7 号峰为 C42H72O14 或 C54H90O23 ；9 号峰为 C41H70O13 ；15 号峰为 C36H62O9 ；16 号峰为 C48H82O18 ；19 号峰为 C36H60O8 ；27 号峰为 C18H32O0
6.如权利要求4或5所述的片仔癀的质量检测方法，其特征在于该方法中的供试品溶液制备为 供试品溶液制备取与三七药材相对应的十批号的片仔癀，每批I. Og，精密称定，置于250mL具塞锥形瓶中，准确加入50. 00ml70%乙醇溶液，称重，放置过夜；置80°C水浴回流2小时，待冷至室温，再称重，用70 %乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，准确移取25. OOml滤液置于50mL烧杯中，100°C水浴锅上方浓缩至干，用70%乙醇溶液溶解，转移至IOmL容量瓶中，定容；用O. 45 μ m针式滤膜过滤至2mL样品瓶，备用。
全文摘要
本发明提供一种片仔癀中三七药材的质量检测方法；本发明还提供一种片仔癀的质量检测方法。本发明质量检测方法确认了三七药材的提取方法，优化了色谱条件，建立了三七药材及片仔癀成品的液相色谱对照指纹图谱，依靠建立的对照指纹图谱结合质谱分析能更有效地监控和评价片仔癀的质量，使片仔癀质控体系更加完整，可从整体反映片仔癀内在质量的稳定、可控。
文档编号G01N1/28GK102914598SQ20111022091
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者于娟, 高飞, 陈啓兰, 刘冬英 申请人:漳州片仔癀药业股份有限公司