专利名称：稳定的不饱和铁结合力测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测领域，具体涉及不饱和铁结合力测定试剂盒。
背景技术：
人体中铁总含量约为4000mg，其中三分之二以血色素铁的形式存在于红细胞中， 剩余三分之一则以铁蛋白或含铁血黄素存在于肝、脾、骨髓等组织中。血清中含有极少量的铁，含量为3 ％ig，约占总含量0. 1%，几乎所有血清铁都与转铁蛋白结合。转铁蛋白是血液中一种主要的糖蛋白，负责将肝组织(是铁贮藏的主要场所)的铁向其它组织的细胞运输。通常血清中只有三分之一的转铁蛋白与铁结合，其余转铁蛋白结合铁的潜力称为不饱和铁结合力(UIBC)。血清中转铁蛋白结合的最大铁量称为总铁结合力(TIBC)，它等于血清铁与不饱和铁结合力之和。总铁结合力的测定对于缺铁性贫血、再生不良性贫血、恶性贫血、慢性出血性贫血、感染性贫血等各种贫血、急性肝炎、慢性肝炎等肝病的临床诊断具有很重要的意义。例如，缺铁性贫血和肝细胞坏死会导致总铁结合力升高，而遗传性铁蛋白缺乏症、肾病、 尿毒症、肝硬化、溶血性贫血、慢性感染及白血病会导致总铁结合力降低。测定血清铁和UIBC有许多方法，通常采用比色法进行测定，原理加入强还原剂 (例如胼、抗坏血酸、巯基乙酸或羟基胺等)将高铁离子0 3+)还原成亚铁离子(Fe2+)，再用一种能与亚铁离子络合的发色试剂去络合亚铁离子，然后进行比色测定。最常用的络合剂有红菲绕嗪、3-(2-吡啶基)-5，6_双(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(亚铁嗪)和三吡啶基三啉 (TPZ)。这类方法目前在临床实验室广泛使用。另外也可以采用电化学法进行血清铁的测定。基于库仑测定的原理，首先加入乙醇盐酸溶液将铁离子从铁蛋白上解离下来，游离的铁离子暴露在一个多电极传感器的不同的特定电位中，这样在狗3+与狗2+之间的电子转移就产生了一个电流，它与铁的浓度相关。 该法样品用量少，分析时间短，但需专门的仪器，应用较少。血清铁测定几乎总是同时要做不饱和铁结合力测定。血清铁是与转铁蛋白结合的，但转铁蛋白分子中只有一部分被饱和，而另一部分未被饱和，即不饱和铁结合力。当血清转铁蛋白全部被饱和后，其结合铁的量就是总铁结合力。另外也有用比色法直接测定 TIBC，通过首先加入过量的高铁化合物使转铁蛋白饱和，剩余的未与转铁蛋白结合的铁，加轻质碳酸镁吸附除去。然后，再按测定总血清铁的方法测定饱和转铁蛋白的铁总量。但此方法操作复杂，不利于大量样本的快速检测，目前应用较少。目前已开发了血清铁和不饱和铁结合力测定液体试剂，可以在自动生化分析仪器上进行快速测定。不饱和铁结合力的检测原理是在有过量铁离子存在的碱性缓冲液中，血清中未与铁结合的转铁蛋白全部与铁离子结合，剩余的铁离子与还原剂、显色剂作用后生成蓝色络合物，通过计算缓冲液中铁离子的减少量即可计算出血清的不饱和铁结合力。转铁蛋白和铁的结合是可逆的，碱性环境下，铁与转铁蛋白结合，在pH7 9条件下，铁与转铁蛋白结合很稳定。酸性环境或者PH大于9强碱环境下，铁与转铁蛋白分离。因此，不饱和铁结合力的测定试剂组分为缓冲液pH为7 9、过量铁离子、亚铁离子络合剂和强还原剂。目前最广泛使用的还原剂为抗坏血酸(维生素C)，抗坏血酸具有强大的还原能力，能够将试剂中所有狗3+还原为狗2+。然而由于抗坏血酸在溶液不稳定、易分解，因此需要加入其他具有维持抗坏血酸稳定性的物质，使试剂保持良好的稳定性。目前UIBC测定试剂中普遍添加β -巯基乙醇、DTT或巯基乙酸等含有异味巯基，具有不良气味的物质。专利文献W01995013544A1描述了一种稳定的UIBC测定试剂盒试剂1包括ρΗ7 9的缓冲液，其包括Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等，其中 Fe3+浓度为10 500 μ g/dL，如氯化铁、硫酸铁；试剂2包括显色剂0. 5 20mmol/L,抗坏血酸0. 02 3. 0%，稳定剂1 lOOmmol/L，其中稳定剂选用DDT、β -巯基丙酸、N-乙酰半胱氨酸等，PH条件在7以下。其中，β-巯基丙酸、DDT、N-乙酰半胱氨酸具有稳定性效果， 但均具有不良气味。专利文献JP49092219A和JP5903M68B中提到使用偏磷酸盐、N-乙酰-L-半胱氨酸和亚硫酸盐有利于抗坏血酸水溶液的稳定。使用偏磷酸盐可以使抗坏血酸溶液在室温下储存4周后保存约80%。N-乙酰-L-半胱氨酸并添加亚硫酸盐，在储存过程中可稳定10 天的效果，单独使用亚硫酸盐不具有稳定效果。另外，专利文献JP6247855A中描述了一种稳定的UIBC测定试剂，采用焦亚硫酸钠作为稳定剂。实验观察了试剂在25°C存储1个月和3个月后的稳定效果，但未观察试剂的长期实时稳定性及试剂其他性能，如抗干扰等性能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的不饱和铁结合力(UIBC)测定试剂的不足，提供一种没有不良气味、具有长期稳定性能、而且抗干扰能力强的不饱和铁结合力(UIBC)测定试剂盒。本发明的UIBC测定试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中，试剂1包括缓冲液、Fe3+ 水溶性盐、表面活性剂和去干扰剂，试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂和表面活性剂，其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剂，所述亚铁离子络合剂可以加在试剂1中，也可以加在试剂2中。
图1表示本发明实施例1的UIBC测定试剂盒在37°C保存5天后的空白实时反应曲线图。图2表示比较例1的UIBC测定试剂盒在37°C保存5天后的空白实时反应曲线图。
具体实施例方式如前所述，抗坏血酸在溶液中很不稳定，其分子中含有连烯二醇基[-C(OH)= (OH)-]的结构，具有很强的还原性及内酯环的结构，极易水解，与空气接触自动氧化生成脱氢抗坏血酸，而巯基类还原剂能抑制抗坏血酸自动氧化，从而起到稳定剂的作用。本发明中的UIBC测定试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中，试剂1包括缓冲液、Fe3+ 水溶性盐、表面活性剂和去干扰剂，试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂和表面活性剂，
其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剤，所述亚铁离子络合剂可以加在试 剂1中，也可以加在试剂2中。进ー步地，试剂1为
缓冲液(pH 7.0-9.0 ) 0.1mol/L lmol/L Fe3+水溶性盐l~10mg/L
表面活性剂0.1-2.0%
去干扰剂20~100mmol/L其中，各成分的浓度指各成分在最终溶液(试剂1)中的浓度，下同；试剂2为
缓冲液(pH 1.0-5.0 )O.lmol/L lmol/L
抗坏血酸l~20g/L
稳定剂レ50mmol/L
表面活性剂0.レ2.0%其中，各成分的浓度指各成分在最终溶液(试剂幻中的浓度，下同；其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剤，所述亚铁离子络合剂可以加在试 剂1中，也可以加在试剂2中，所述亚铁离子络合剂浓度为1 lOmmol/L。优选为试剂1为
缓冲液(pH 7.0-9.0 )0.2mol/L~0.5mol/L
Fe3+水溶性盐5~10mg/L
表面活性剂0.5 1.0%
去千扰剂20 50mmol/L试剂2为
缓冲液(pH 1.0-3.0 ) 0.5mol/L~lmol/L
抗坏血酸2~10g/L
稳定剂l~20mmol/L
表面活性剂0.レ1.0%其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剤，所述亚铁离子络合剂可以加在试 剂1中，也可以加在试剂2中，所述亚铁离子络合剂浓度为1 5mmol/L。本发明的UIBC測定试剂盒中，试剂1选用pH 7. 0 9. 0的缓冲液，有利于狗3+与转铁蛋白结合，优选Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液。1 3+水溶性盐，优选为硫酸铁或氯化铁。表面活性剂有利于样本中各种物质的溶解，减少样本脂浊对测定结果的影响，可以选用 Tween20, Triton X_100、Brii35等非离子型表面活性剂，优选Triton X-100 ；其中，对于固体表面活性剂，所述浓度为质量百分比浓度，对于液体的表面活性剂，所述浓度为体积百分比浓度，优选采用液体的表面活性剂。去干扰剂用于消除血清铜对测定的干扰，可以选用硫脲、氨基硫脲等，优选硫脲。此外，试剂1中还可以加入碳酸氢钠，以更好地调节PH值，浓度可以是 50 300mmol/L，优选为 100 150mmol/L。试剂2选用pH 1. 0 5. 0的缓冲液，有利于抗坏血酸的稳定性，优选用甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液，更优选为醋酸缓冲液。表面活性剂有利于试剂中抗坏血酸的稳定性，可以选用Tween20 Jriton X_100、Bri j35等非离子型表面活性剂，优选"Triton X-100,Tween20o抗坏血酸作为还原剂将Fe3+还原为狗2+。稳定剂可以选用硫代硫酸钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠，优选硫代硫酸钠。为了更好地稳定抗坏血酸，还可以加入盐酸羟胺或硫酸羟胺，其浓度为1 lOmmol/L，优选为2 5mmol/L。所述亚铁离子络合剂可以是红菲绕嗪、3- (2-吡啶基)-5，6-双苯磺酸)_1，2， 4-三嗪(亚铁嗪)、三吡啶基三啉(TPZ)或狗1^1^。所述亚铁离子络合剂可以加在试剂1 中，也可以加在试剂2中，优选加在试剂1中。应用本发明的UIBC测定试剂盒，采用的测定方法为两点终点法，温度为37°C，样本Rl R2为20 200 40，其中Rl和R2分别代表试剂1和试剂2，测定主/副波长为600/700nm，Rl加入样本或校准后在测定稳定孵育300秒后，记录吸光度值Al，然后加入 R2继续孵育300秒后记录吸光度值A2。计算方法UIBC浓度=(Δ A样本/ Δ A校准)X校准液浓度Δ A = A 待测-A 空白，A = Α2-Α1本申请中所涉及的试剂或缓冲液均可以通过商业渠道获得，或者按照本领域常规的方法进行配制。本申请中的技术术语和相关技术术语的缩写均按照本领域的通常理解。例如 Triton X-100表示聚乙二醇辛基苯基醚，Ferene表示呋喃三嗪，Tris表示三羟甲基氨基甲烷，Bri j35表示聚环氧乙烯月桂酰醚。本发明的UIBC测定试剂盒，不仅没有不良的气味，而且具有长期稳定性能，并且抗干扰能力强。实施例下面将采用实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。比较例1试剂1
Tris 缓冲液(pH8.6) 0.5mol/L 碳酸氢钠100mmol/L
试剂2 醋酸缓冲液抗坏血酸 Ferene 比较例2 试剂1 试剂2
实施例1 试剂1
氯化铁 Triton X-100
硫脲
(pH 2. 5) 0. 4mol/L 5g/L 5mmol/L
5mg/L 0.5%
50mmol/L
Tris 缓冲液(pH9.0) 0.5mol/L
碳酸氢钠疏酸铁 Triton X-100
硫脲
lOOmmol/L
5mg/L
0.5%
50mmol/L
醋酸缓冲液(pH 3.0 ) 0.5mol/L
抗坏血酸 β-巯基丙酸 Ferene
5g/L 50mmol/L 5mmol/L
实施例2试剂1 试剂2实施例3试剂1
Tris 缓冲液(pH8.6) 0.5mol/L 碳酸氢钠100mmol/L
氯化铁 Triton X-100 硫脲 Ferene
试剂2:
醋酸缓冲液(pH3.0) 抗坏血酸疏代疏酸钠 Triton X-100
5mg/L 0.5%
50mmol/L 2mmol/L
0.5mol/L 5g/L
lOmmol/L 0.2%
Tris 缓冲液(pH 9.0 ) 0.2mol/L 疏酸铁5mg/L
Triton X-1000.5%
硫脲
50mmol/L
醋酸缓冲液(pHl.0) l.Omol/L
抗坏血酸盐酸羟胺硫代硫酸钠 Triton X-100 Ferene
5g/L 5mmol/L lOmmol/L 0.5% 5mmol/LTris 缓冲液(pH7.0) 0.2mol/L
碳酸氢钠150mmol/L
氯化铁10mg/L
Triton X-IOO1.0%
疏脲50mmol/L
Ferene2mmol/L试剂2
醋酸缓冲液(pH3.0) 1.0mol/L
抗坏血酸10g/L
盐酸羟胺2mmol/L
疏代疏酸钠20mmol/L
Triton X-1001.0%实施例4试剂1
Tris 缓冲液(pH8.0) 0.2mol/L
碳酸氢钠150mmol/L
氯化铁10mg/L
Triton X-1000.5%
疏脲50mmol/L试剂2
醋酸缓冲液(pH 2.0 ) 1.0mol/L
抗坏血酸10g/L
盐酸羟胺2mmol/L
焦亚ぁも酸钠20mmol/L
Triton X-1000.1%
Ferene5mmol/L试验例1稳定性试验应用以上UIBC测定试剂盒，按以下測定方法进行測定采用两点终点法，温度为 37°C，样本Rl R2为20 200 40，测定主/副波长为600/700nm，Rl加入样本或校 准后孵育300秒，记录吸光度值Al，然后加入R2继续孵育300秒后记录吸光度值A2。
计算方法UIBC浓度=(Δ A样本/ Δ A校准)X校准液浓度
Δ A = A 待测一A 空白，A = Α2-Α1上述试剂分别在42°C保存6天、37°C保存14天、2 8°C保存18个月后检测试剂空白吸光度和样本，比较试剂稳定性。结果见表1 3，以及图1和图2。表1为不同UIBC测定试剂盒在2 8°C保存后的稳定性结果。比较例1中未添加稳定剂，抗坏血酸很不稳定，还原能力逐渐减弱，导致样本测值身高，2 8°C保存10天，测值升高2倍。实施例1、2、3、4的UIBC检测试剂在2 8°C保存360天后，测值偏差在10% 以内，稳定性能好于比较例2。表2为不同UIBC测定试剂盒在37°C保存后的稳定性结果。比较例1中未添加稳定剂，抗坏血酸很不稳定，还原能力逐渐减弱，导致样本测值升高，37°C保存4天，测值升高 2倍。实施例1、2、3、4的UIBC检测试剂在37°C保存14天后，测值偏差在10%以内，稳定性能与比较例2相当。表3为不同UIBC测定试剂盒在42°C保存后的稳定性结果。比较例1中未添加稳定剂，抗坏血酸很不稳定，还原能力逐渐减弱，导致样本测值身高，42°C保存2天，测值升高 2倍。实施例1、2、3、4的UIBC检测试剂在42 °C保存6天后，测值偏差在5 %以内，稳定性能好于比较例2。
权利要求
1.一种不饱和铁结合力测定试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其中，所述试剂1包括缓冲液、狗3+水溶性盐、表面活性剂和去干扰剂，所述试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂和表面活性剂，并且，其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剂，所述亚铁离子络合剂加在试剂1 中，或者加在试剂2中。
2.根据权利要求1所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1中的缓冲液PH为 7. 0 9. O0
3.根据权利要求1或2所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1中的缓冲液为 Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂2中的缓冲液PH为1.0 5. O。
5.根据权利要求4所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂2中的缓冲液pH为 1. O 3. O。
6.根据权利要求1 5中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂2中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液。
7.根据权利要求1 6中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1中的狗3+水溶性盐为硫酸铁或氯化铁。
8.根据权利要求1 7中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1中的去干扰剂为硫脲或氨基硫脲。
9.根据权利要求1 8中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂2中的稳定剂为硫代硫酸钠、亚硫酸钠或焦亚硫酸钠。
10.根据权利要求1 9中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1 和/或试剂2中的表面活性剂为非离子型表面活性剂。
11.根据权利要求1 10中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1 和/或试剂2中的表面活性剂为Tween20、Triton X-IOO或Brij350
12.根据权利要求1 11中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，所述亚铁离子络合剂是红菲绕嗪、3-(2-吡啶基)-5，6_双(4-苯磺酸)-1，2，4_三嗪(亚铁嗪)、 三吡啶基三啉或!^erene。
13.根据权利要求1 12中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1为 pH 7.0 9.0 的缓冲液0.1mol/L lmol/LFe3+水溶性盐l~10mg/L表面活性剂0.1~2.0%去干扰剂20~100mmol/L试剂2为pH 1.0-5.0 的缓冲液 0.1mol/L lmol/L抗坏血酸l~20g/L稳定剂l~50mmol/L表面活性剂0.1 2.0%其中，所述亚铁离子络合剂浓度为1 lOmmol/L。
14.根据权利要求1 13中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中， 试剂1为pH 7.0-9.0的缓冲液Fe3+水溶性盐表面活性剂去干扰剂0.2mol/L~0.5mol/L 5~10mg/L 0.5-1.0% 20~50mmol/L试剂2为pH 1.0-3.0的缓冲液抗坏血酸稳定剂表面活性剂0.5mol/L~lmol/L 2 10g/L l~20mmol/L 0.1-1.0%其中，所述亚铁离子络合剂浓度为1 5mmol/L。
15.根据权利要求1 14中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂1 中还包含碳酸氢钠。
16.根据权利要求15所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，碳酸氢钠的浓度是 50 300mmol/L。
17.根据权利要求16所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，碳酸氢钠的浓度是 100 150mmol/L。
18.根据权利要求1 17中任意一项所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，试剂2 中还包含盐酸羟胺或硫酸羟胺。
19.根据权利要求18所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，盐酸羟胺或硫酸羟胺的浓度是1 10mmol/L。
20.根据权利要求19所述的不饱和铁结合力测定试剂盒，其中，盐酸羟胺或硫酸羟胺的浓度是2 5mmol/L。
全文摘要
本发明提供一种不饱和铁结合力测定试剂盒，所述试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中，所述试剂1包括缓冲液、Fe3+水溶性盐、表面活性剂和去干扰剂，所述试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂和表面活性剂，并且，其中，在所述试剂盒中还包含亚铁离子络合剂，所述亚铁离子络合剂加在试剂1中，或者加在试剂2中。本发明的不饱和铁结合力测定试剂盒，不仅没有不良的气味，而且具有长期稳定性能，并且抗干扰能力强。
文档编号G01N33/90GK102323430SQ20111023302
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司